Name: optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

这项工作由国家科学与工程研究委员会（NSERC;RGPIN-2019-04617）。Lucia Liao由滑铁卢大学生物系的Ram和Lekha Tumkur纪念奖学金以及安大略省IODE的Lucy Morrison纪念助学金资助，此外还有滑铁卢大学的研究生研究经费，包括研究生研究奖学金（50503-11072），科学研究生奖和研究生助教。作者要感谢马丁实验室的所有成员对准备这份手稿的支持，特别是Stephanie Ryall，Harleen Gill和Sadia Khan，他们最初帮助建立了马丁实验室，为这些研究做准备。作者还要感谢Luc Berthiaume博士对ctHTT-GFP结构的善意礼物，以及Shaun Sanders博士在准备手稿时提供的重要投入。图 3 是使用 BioRender.com 创建的。

1. 细胞培养
<ol><li>为了补充DMEM（Dulbecco的改性鹰培养基）用于细胞培养，加入10%胎牛血清（FBS），1x青霉素 - 链霉素，2mM L-谷氨酰胺和100mM丙酮酸钠（1%体积/体积）。</li>
	<li>将约5×105 个HEK293T细胞/孔加入6孔组织培养皿中，并在37°C加湿培养箱中生长18小时，其中5%CO 2 达到75%-80%汇合度。</li>
	<li>脂肪酸血清剥夺<ol>
<li>要准备标记介质，请按上述方式（步骤 1.1）准备 DMEM，不带 10% FBS。用5%葡聚糖 - 木炭涂层FBS（DCC-FBS）代替FBS。使用前预热至37°C。</li>
		<li>在室温下用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻洗涤细胞，并用标记培养基替换。 注意：HEK293T细胞很容易从组织培养板上分离。清洗细胞和更换培养基时要小心。在转入和移出培养箱期间，尽可能减少搅拌。</li>
		<li>将细胞用5%CO 2 返回37°C培养箱并孵育约45分钟（至少15分钟有效），最多60分钟，然后继续用脂肪酸进行代谢标记。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 脂肪酸类似物的制备和皂化
<ol><li>通过在DMSO中增溶以达到以下浓度并储存在-20°C下，提前制备炔基脂肪酸的储备溶液。 根据需要在室温下解冻。将准备工作储存在N2 或Ar下以获得最佳性能。 炔基肉豆蔻酸酯（13-十四炔酸，13-TDYA）：25 mM 棕榈酸炔酯（15-十六炔酸;15-HDYA）：100 mM 炔基硬脂酸酯（17-十八烷酸;17-ODYA）：100 mM
</li>
	<li>要制备20%脂肪酸游离BSA（FAFBSA），在50 mL一次性管中称取2gFAFBSA。<ol>
<li>使用预热 （37 °C） DMEM 输送至 10 mL。</li>
		<li>通过端对端旋转或通过涡旋混合，并置于37°C水浴中以完全溶解FAFBSA。</li>
		<li>使用0.2μm过滤器过滤灭菌培养基。</li>
		<li>等分试样在约1 mL体积中，并储存在-20°C。 根据需要解冻，并在使用前在水浴中加热至37°C。</li>
	</ol>
</li>
	<li>为了提高脂肪酸和脂肪酸类似物的溶解度，通过在3mL玻璃锥形反应瓶中孵育20%摩尔过量的氢氧化钾（KOH）进行皂化。 注意：这些小瓶允许盐保持可溶性，同时确保FAFBSA不会因高温而凝结。使用玻璃还可以防止脂肪酸粘附在塑料上。<ol>
<li>将至少2μL炔基脂肪酸类似物直接移出到3mL锥形反应瓶的底部。使用6孔板每孔制备2μL脂质（见 表1）。 注意：由于脂肪酸的疏水性，最好在将移液器的尖端涂覆几次，然后将其分配到反应瓶中。</li>
		<li>将1M KOH稀释至等于20%摩尔过量的炔基脂肪酸标记（13-TDYA为30mM，15-HDYA和17-ODYA为120mM）。</li>
		<li>移出等量的稀释KOH（1μL：1μL脂肪酸：KOH）靠近玻璃边缘反应瓶底部，使得KOH的分配体积与脂肪酸混合。</li>
		<li>合上小瓶盖，轻轻敲击以混合溶液。 注意：混合物可能迅速凝固，特别是随着脂肪酸烃链长度的增加。注意不要移液固体（即，不要通过移液混合）。</li>
		<li>将反应瓶在65°C下加热约5分钟，或一旦加入脂肪酸（溶液变得透明）。 注意：碳含量较高且溶解度降低的脂肪酸，如硬脂酸酯（17-ODYA），可能需要更长的孵育时间才能在65°C下完全掺入KOH中。 如果需要，将温度升高至70°C。水浴是最好的。注意液体不会蒸发太多。</li>
		<li>一旦脂肪酸进入溶液并且没有可见的固体残留，移液器预热20%FAFBSA使得脂肪酸的体积比：KOH：FAFBSA为1：1：50，以达到20x BSA结合的炔基脂肪酸的最终浓度。</li>
		<li>通过上下移液混合。溶液通常看起来很清晰，没有可见的固体。 注意：通常，任何小固体将在37°C下孵育后进入溶液。</li>
		<li>将脂肪酸和FAFBSA在37°C下孵育15分钟。 注意：此时皂化标签稳定超过15分钟。 
		 </li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>总培养基体积（毫升）</td>
			<td>体积脂肪酸或脂肪酸类似物（μL）</td>
			<td>光之合（μL）</td>
			<td>体积 20% 法夫巴硫 （μL）</td>
			<td>BSA偶联皂化标记的总体积（μL）</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>208</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>100</td>
			<td>104</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：皂化脂肪酸标记比。 根据所用培养基的体积，脂肪酸，KOH和FAFBSA的实验体积用于脂肪酸标记的皂化。
<ol start="4"><li>作为控件，重复步骤 2.3。与脂肪酸没有炔烃标签。</li>
	<li>将1/20体积的20x脂肪酸- BSA偶联物直接标记在饥饿培养基（通常，在2mL培养基/细胞中为100μL）上，以达到1%BSA和25μM的终浓度（用于炔基 - 肉豆蔻酸酯，或100μM用于炔基 - 棕榈酸酯和炔基 - 硬脂酸酯）。 注意：为了最大限度地减少对附着细胞的物理干扰，请在移液器尖端靠近培养基表面形成液滴，而不是直接移液到培养基中。如果使用酰化抑制剂，请在标记的脂肪酸前至少15分钟添加。时间可能因使用的细胞或抑制剂而异。建议在此步骤中使用皂化法28。<ol>
<li>为了进行比较，通过将2μL（或相当于体积皂化）未标记的脂肪酸直接移液到饥饿培养基中来添加非皂化脂质。</li>
		<li>将细胞放回培养箱并孵育3-6小时。 注意：可能需要为每种细胞类型或实验条件确定最佳标记时间。较长的孵育时间可能导致脂肪酸通过β氧化和/或掺入其他脂质基团（如磷脂）而分解28。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在室温下用1x PBS轻轻洗涤细胞。</li>
	<li>通过在4°C下摇动裂解物15分钟，用500μL不含乙二胺四乙酸（EDTA）的改良放射性免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（0.1%SDS，50mM N-2-羟乙基哌嗪-N-乙烷磺酸（HEPES）pH 7.4，150mM NaCl，1%非变性洗涤剂，0.5%脱氧胆酸钠，2mM MgCl2 与新鲜加入的1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和10μg/ μL Pepstatin A（或不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物））收获细胞并裂解细胞。<ol>
<li>在4°C下以16，000× g 离心裂解物10分钟。</li>
		<li>将上清液收集在1.7mL微量离心管中，并储存在-20°C，直到准备好继续进行点击反应。 注意：协议可以在此处暂停。裂解物在-20°C下稳定长达1个月。但是，建议及时进行点击反应。</li>
	</ol>
</li>
	<li>根据制造商的方案使用适当的测定法（例如去垢剂相容性（DC）测定法）来量化蛋白质浓度。</li>
</ol>3. 点击反应细胞裂解物
<ol><li>准备用于点击化学的试剂。<ol>
<li>将三（苄基三唑基甲基）胺（TBTA）溶解在DMSO中至2 mM。用干燥剂在-20°C下储存在小等分试样中长达2-3个月。最好储存在N2 或Ar下。</li>
		<li>将 CuSO4 溶解在 ddH2O 水中，达到 50 mM。在室温下储存长达2个月。</li>
		<li>将三羧乙基膦（TCEP）溶解在ddH2 O水中至250 mM。在4°C的黑暗中储存，并在点击反应之前制作新鲜的50 mM稀释液。</li>
		<li>在DMSO中制备2 mM叠氮化物。用干燥剂在-20°C下储存在小等分试样中长达6个月。最好储存在N2 或Ar下。 注意：据观察，具有三个或更多聚乙二醇组的产品与生物素配合使用效果最好。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用与上述相同的裂解缓冲液将50-100μg蛋白质裂解物放入1.7mL微量离心管中至相同体积。 注意：保持反应体积尽可能小（20-100μL）。<ol>
<li>向每个样品中添加十二烷基硫酸钠（SDS）以达到最终的1%浓度。</li>
		<li>准备点击试剂的预混合，以便加入裂解物后的最终浓度为：100μM TBTA（2mM储备液），1mM CuSO4，（50mM储备）1mM TCEP（50mM储备）和100μM叠氮化物探针（2mM储备）。相应地组合储备溶液（见 表2）。 注意：顺序很重要。加入每种成分后完全混合。</li>
		<li>将适当体积的预混液添加到裂解液中。通过上下移液混合。</li>
		<li>在37°C水浴中在黑暗中孵育30分钟。偶尔搅拌/混合。</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>总反应体积（μL）</td>
			<td>体积蛋白（μL）</td>
			<td>体积 TBTA （2 mM） （μL）</td>
			<td>体积铜溶氧物质4 （50 mM） （μL）</td>
			<td>体积 TCEP （50 mM） （μL）</td>
			<td>氮化物探针 （2 mM） （μL）</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>43</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>86</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>表2：点击试剂和蛋白质体积比。 点击化学试剂的实验体积和相应的储液浓度，以及蛋白质样品的体积。
4. 免疫沉淀蛋白上的点击反应
<ol><li>或者，可以在磁珠 上或磁珠外的 免疫沉淀（IP）蛋白上进行点击反应。 注意：通常，执行点击 关闭 磁珠会导致最少的背景，并且在测试感兴趣的新蛋白质时是最好的。<ol>
<li>转染细胞以获取感兴趣的蛋白质，在这种情况下，野生型肉豆蔻酰化C端亨廷顿蛋白（HTT）融合到GFP（myr-ctHTT-GFP）和ctHTT-GFP，具有G2A取代，使用磷酸钙DNA共沉淀，如前所述41。<ol>
<li>在6孔组织培养板中平板2.5×105 个细胞/孔，并生长过夜至约70-80%汇合度。</li>
			<li>通过将2.5μg DNA加入10μL和99.75μL分子级H2 O到1.7mL微量离心管中来制备DNA混合物。然后，将15.25μL CaCl2 滴加到DNA混合物中。</li>
			<li>将DNA / CaCl2 混合物以滴滴方式加入含有125μL 2x HEPES缓冲盐水（HBS，pH 7.0）的单独管中混合。</li>
			<li>缓慢地将DNA / CaCl2 / HBS混合物添加到细胞中。2-4小时后，更换培养基并孵育过夜。继续执行步骤 1.3-2.8 中的标记。</li>
		</ol>
</li>
		<li>在裂解缓冲液中制备等体积的500μg蛋白质。</li>
		<li>通过与兔抗GFP孵育ctHTT-GFP在4°C下旋转过夜来执行IP。</li>
		<li>向每个管中加入15-20μL蛋白G珠，用裂解缓冲液预先平衡，并使其在4°C下端对端反应3小时。</li>
		<li>用裂解缓冲液洗涤磁珠，并重悬于45μL 1%SDS 50mM HEPES缓冲液中。</li>
		<li>将珠子在80°C下加热15分钟，并倒置管或大约每5分钟搅拌一次。短暂旋转管并返回80°C。</li>
		<li>在样品仍然温热时收集含有蛋白质的上清液。 注意：如果不能立即用于点击化学，则可以在此处暂停实验方案，并且免疫沉淀样品可以储存在-20°C或-80°C下。</li>
		<li>让43μL上清液与7μL点击试剂的预混液反应。</li>
		<li>按照步骤3.2.3中所述进行反应。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SDS-PAGE和蛋白质印迹
<ol><li>通过加入含有25mM二硫黄醇（DTT）的1x样品上样缓冲液并在95°C下加热5分钟来停止反应并变性。 注：最高可达 100 mM DTT28。不要使用β-巯基乙醇与S-酰化蛋白，因为它可以水解硫酯键并除去点击的脂肪酸类似物。</li>
	<li>简要地降低样本。</li>
	<li>用SDS-PAGE在聚丙烯酰胺凝胶上一式两份地分离蛋白质。 注意：用KOH碱性处理需要两个凝胶，以确认硫酯键的存在。如果使用荧光叠氮化物探针，则可以在凝胶内或使用指示的激发通道在转印后检测到酰化。</li>
	<li>转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（在甲醇中活化并在ddH2 O中冲洗5分钟），用半干转印装置在25 V，1.0 A（恒定）下30分钟。</li>
	<li>用ddH2O短暂冲洗膜后，将一个复制膜浸泡在甲醇/水（9：1 v / v）中的0.1 M KOH中，另一个在0.1 M Tris-HCl pH 7.0中浸泡在甲醇/水（9：1 v / v）中，作为非碱性对照，在室温下轻轻摇动60分钟。</li>
	<li>在ddH 2O水中短暂冲洗膜，然后在PBS-T（1x PBS，0.1%吐温20）中洗涤6次，每次5分钟。 注意：彻底清洗。</li>
	<li>在5%脱脂牛奶阻断缓冲液（1x PBS，0.1%吐温20）中阻断膜过夜。</li>
</ol>6. 进行蛋白质印迹
<ol><li>在指示的情况下，在室温下将荧光标记的链霉亲和素（1：5000）和负载控制，抗GAPDH罗丹明（1：5000）的探针置于5%BSA封闭缓冲液（0.01%SDS，1x PBS，0.1%吐温20）中，在室温下轻轻摇动45-60分钟，在黑暗中轻轻摇晃。<ol>
<li>首先在5%脱脂牛奶封闭缓冲液中使用一级抗GFP抗体探测免疫沉淀蛋白印迹，然后按照步骤6.1在5%BSA中使用适当的二抗。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在PBS-T（1x PBS，0.1%吐温20）中洗涤膜5分钟，共重复四次，并在成像前用ddH 2 O水冲洗。</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

在培养物中将脂肪酸直接添加到细胞中可导致不溶性、脂质沉淀和脂质毒性40。因此，将脂肪酸直接添加到细胞中不仅可能导致细胞摄取不良和脂肪酸标记的可用性低，而且还会导致用于下游分析的活细胞数量减少，以及脱靶途径的激活。然而，许多用于点击化学检测的代谢标记方案涉及直接添加脂肪酸和大量使用点击化学检测的棕榈酰 - 蛋白质组研究，迄今为止很少皂化脂肪酸标签或用BSA8，36孵育它们。重要的是要考虑这样一个事实，即脂肪酰化蛋白的点击化学检测的效率和灵敏度取决于脂肪酸类似物的充分细胞摄取。因此，可以合理地推测，许多S-酰化蛋白可能在蛋白质组学研究中逃脱了检测，因为脂肪酸标记的可用性较低，因为掺入细胞的不良，特别是当使用长链脂肪酸17-ODYA时。17-ODYA，或炔基硬脂酸酯，由于其商业可用性和早期使用，一直是几项研究广泛使用的首选标签8，36。然而，该协议的结果表明，与棕榈酸酯或肉豆蔻酸盐等短链脂肪酸相比，17-ODYA的皂化导致S-酰化蛋白检测的最大增加。因此，用皂化标记重复这些实验可能会产生以前可能被忽视的其他S-酰化底物。此外，虽然大多数棕榈酰酰基转移酶更喜欢棕榈酸酯进行S-酰化，但有些确实偏爱其他长度的脂肪酸，如硬脂酸酯15，38，44。此外，某些蛋白质甚至蛋白质中的特定位点更喜欢一种脂肪酸而不是另一种脂肪酸15，45。因此，使用17-ODYA的研究可能偏向于用硬脂酸酯而不是棕榈酸酯S酰化的蛋白质，同时由于检测率较低，这些蛋白质的代表性也不足。
点击化学的代谢标记效率的提高依赖于脂质的皂化和与FAFBSA步骤的孵育，以及脱脂FBS。所有脂肪酸必须在KOH中完全皂化，在继续与FAFBSA孵育之前，没有可见的固体残留。这可能是一个艰难的步骤，时机至关重要。皂化脂肪酸在65°C进入溶液后，立即加入温热的BSA，因为进一步加热将导致脂肪酸中的DMSO蒸发。此外，皂化标签一旦开始冷却，就会开始重新固化。因此，FAFBSA必须变暖并在盐变得可溶后迅速添加。玻璃反应瓶及其形状对于这一步很重要。它们允许皂化脂质足够温暖以保持可溶性，同时足够冷以确保FAFBSA不会凝结。在此步骤中，通过移液充分混合也很重要，以确保用于标记的均匀溶液。
用于点击化学的试剂需要正确储存，通常用干燥剂或在-20 °C至-80°C的N2或Ar气体下储存。 缺乏酰化信号或信号微弱可能是由于试剂不稳定，特别是较旧的TBTA和叠氮化物储备溶液。此外，必须注意荧光叠氮化物储备溶液，这需要尽可能地避光。此外，可能需要测试诸如脂质剥夺方法和标记时间之类的变量，以确定最佳条件，具体取决于所使用的细胞类型。例如，神经元细胞可能需要更长的标记时间，因为培养基变化和脂质剥夺是困难的（未发表）。
当用于长链脂肪酸时，该协议的好处是最显着的。对于较短的链，信号强度的增加变得不那么明显，但仍然可能对细胞具有保护作用。虽然建议的修饰将改善蛋白质酰化检测，但点击化学仍被认为是一种以脂质为中心的方法1 ，仅限于动态检测，而不是稳定的S酰化蛋白1。需要考虑的其他局限性包括脂肪酸剥夺以促进标记的要求，以及与S-酰化酰化检测的酰基 - 生物素交换（ABE）检测相比，其相容细胞类型范围相对有限16。尽管有这些局限性，点击化学检测比大多数酰基交换测定更快，更适合检测不耐受酰基交换测定所需的重复蛋白质沉淀步骤的蛋白质。此外，这种方法可以与使用其他点击测定（如脉冲追逐分析）同时标记相结合38。
将这种修饰用于点击化学的代谢标记增加了酰化蛋白的整体检测，特别是S-酰化蛋白，与点击化学结合使用的各种蛋白质组学技术。如图所示，荧光检测可用作生物素的替代品（图1）28。这是特别有用的，因为细胞裂解物中没有内源性荧光蛋白。此外，只有在点击化学后才能激活的荧光团也可以使用46。用于点击化学标记的皂化和FAFBSA结合脂肪酸可以帮助检测感兴趣的蛋白质，因为细胞中可用的标记量总体上增加，并且限制了直接向培养基中添加脂肪酸的毒性作用。它还可以与质谱27 结合使用，以增加对低丰度蛋白质的检测，特别是当与使用机器学习算法的最新进展相结合时，可以防止冗余测量以提高对低丰度蛋白质的灵敏度，而不是现有的数据依赖性采集，有利于检测最丰富的蛋白质47.此外，点击化学可以与细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）和脉冲追逐方法相结合，以产生有关动态蛋白质S-酰化的可量化数据27。最后，Hannoush小组将点击化学与接近连接测定（PLA）相结合，允许单细胞可视化和检查棕榈酰化蛋白的亚细胞分布43，48。

脂肪酰化涉及脂肪酸向蛋白质的共价添加，并以其在促进蛋白质 - 膜相互作用方面的重要性而闻名，但也已被证明可以促进蛋白质 - 蛋白质相互作用，构象变化和调节酶的催化位点1，2，3，4，5，6，7.脂肪酰化已成为无数疾病的潜在药物靶标，包括感染，癌症，炎症和神经变性，其中已经记录了棕榈酰化破坏8，9，10，11，12，13。这主要是由于新的化学检测方法的发展，这些方法能够大规模鉴定S-酰化蛋白靶标。
脂肪酰化可以包括涉及饱和和不饱和脂肪酸共价添加的各种修饰，但通常是指N-肉豆蔻酰化和S-酰化。N-肉豆蔻酰化是指在蛋白水解裂解后，将肉豆蔻酸添加到N端甘氨酸中，无论是在新生多肽上共翻译，还是在新暴露的N端甘氨酸上翻译后2，14。N-肉豆蔻酰化通过不可逆的酰胺键发生。另一方面，S-酰化通常是指通过硫酯键将长链脂肪酸可逆地添加到半胱氨酸残基中。这种修饰的最常见形式包括棕榈酸酯的掺入，因此，通常被称为S-棕榈酰化，或简称为棕榈酰化11，15。在许多方面，S-棕榈酰化类似于磷酸化。它是动态的，酶调节的，并且被证明是高度可处理的。
直到过去十年，研究脂肪酰化一直受到有限检测方法的阻碍，这需要放射性标记的脂肪酸。这有几个缺点，包括成本，安全问题和非常长的检测时间。通常，三化或碘化棕榈酸酯用于检测S-酰化16。经磨的棕榈酸酯需要使用放射自显影片进行长时间的检测，这可能需要数周至数月的时间。虽然[125I]碘脂肪酸类似物缩短了检测时间，但它具有更高的安全风险，需要对实验者进行密切的甲状腺监测。此外，这些方法是非定量的，因此限制了测量动态棕榈酰化的能力，并且由于额外的个人防护设备和放射性监测，设置和清理也非常耗时。最后，放射性标记不太适合蛋白质组学研究，通常仅限于目标特定蛋白质的低通量检测。随着检测到更多的底物，并且不可避免地确定了介导每个修饰的酶，很明显需要新的检测方法17，18，19，20，21。几乎同时，出现了几种用于检测脂肪酰化蛋白的新方法。第一个利用了S-酰化硫酯键的可逆性和反应性。酰基 - 生物素交换（ABE）测定化学地用生物素代替棕榈酸酯，用于随后使用亲和蛋白琼脂糖珠拉取S-酰化蛋白，并通过蛋白质印迹直接检测22，23，24。接下来，开发了脂肪酸的生物正交标记和标签或手柄的化学选择性添加，包括使用施陶丁格结扎和点击化学25，26，27，28，29，30，31，32，33.最后，与ABE类似，酰基树脂辅助捕获（RAC）基本上用硫醇反应性珠代替S-酰化位点，用于捕获和检测S-酰化蛋白34，35。基于交换和点击化学的测定共同为下游分析提供了更有效和更灵敏的酰化检测和亲和纯化方法，并随后发现了数千种S酰化蛋白8，36。
术语点击化学包括一组化学反应，但通常是指Cu（I）催化的叠氮基-炔烃[3+2]烷基和叠氮基之间的环加成反应机理27，28，37。特别是，在脂肪酰化的情况下，点击化学涉及通过将生物正交16-碳炔基棕榈酸酯（15-十六炔酸;15-HDYA）或14-碳炔基肉豆蔻酸酯（13-十四炔酸;13-TDYA）分别掺入细胞中以标记内源性酰化蛋白来检测S-棕榈酰化或N-肉豆蔻酰化.在目标蛋白质的细胞裂解和免疫沉淀之后，进行点击化学反应（炔烃和叠氮化物之间的共价键）以结合亲和探针（通常是生物素），以便通过蛋白质印迹检测28，37。或者，可以在总细胞裂解物上进行点击化学，并且可以亲和纯化脂肪酰化蛋白通过质谱法进行鉴定。与放射性相比，与氮基生物素的初始点击化学反应使检测的选择性和灵敏度提高了一百万倍以上2。点击化学的另一个优点是，它可以与其他经典的标记方法结合使用，例如使用叠氮基- 高丙氨酸进行定量分析的蛋白质周转的脉冲追逐分析38。此外，荧光探针可用于代替生物素或其他生化探针，如FLAG或Myc标签，以检查蛋白质定位16，28，39。
尽管点击化学相对易于使用，但检测可能受到在细胞培养中使用长链游离脂肪酸的低溶解度和潜在毒性的限制40。特别是，尽管大多数蛋白质在S-酰化过程中偏爱棕榈酸酯，但许多研究使用18-碳硬脂酸酯（17-十八进制酸-17-ODYA）而不是棕榈酸酯（15-HDYA）来检测S-酰化蛋白，因为它的商业可用性和相对较低的成本。然而， 17-ODYA 是非常不溶的， 需要特别注意使用.此外，点击化学可能需要一些细致入微的化学品制备和储存。本文，该协议描述了一种标记方法，该方法使用脂肪酸的皂化，用不含脂肪酸的BSA和脱脂胎牛血清（FBS）进行递送来优化递送，以提高溶解度并绕过向细胞中添加游离脂肪酸的潜在毒性作用28。这种方法适用于各种细胞类型，甚至已用于活体动物28。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>90270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide/bis solution 29:1</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFDye 647 azide plus</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-tris, ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 16,000xg, 4&#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imager</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (1 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid sodium salt monohydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent compatible (DC) assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0231-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>319015CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219989950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blot Turbo Semi-dry transfer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Incubator at 37&#176;C and 5% CO2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement solution</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myristic Acid (25 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M0476-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid (100 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 10x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>450201EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A (synthetic)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-085-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-184-G005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75801-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified)</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal antibody to GFP</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>600-110-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)</td>
			<td>Soltec Ventures</td>
			<td>M115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-043-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Reagent Grade 1L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHEATON NextGen V Vials 3 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry

脂肪酰化是饱和脂肪酸向蛋白质底物的共价添加，除了在癌症和神经退行性疾病中具有重要意义外，还具有调节无数细胞功能的重要性。脂肪酰化检测方法的最新发展使得脂肪酰化蛋白的高效和非危险检测成为可能，特别是通过使用具有生物正交标记的点击化学。然而，点击化学检测可能会受到在细胞培养中添加长链脂肪酸的溶解度差和潜在毒性作用的限制。这里描述的是一种标记方法，使用皂化脂肪酸与不含脂肪酸的BSA以及脱脂介质进行优化递送，可以改善难以检测的脂肪酰化蛋白的检测。这种效应在炔基 - 硬脂酸酯类似物17-ODYA中最为明显，17-ODYA一直是酰化蛋白点击化学检测中最常用的脂肪酸类似物。这种修饰将改善细胞掺入并提高对酰化蛋白检测的敏感性。此外，这种方法可以应用于各种细胞类型，并与其他测定相结合，例如脉冲追逐分析，细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记，以及用于脂肪酰化蛋白定量分析的质谱分析。

皂化和非皂化（非皂化）炔基脂肪酸之间用于点击化学检测的标记效率的差异可以通过蛋白质印迹的脂肪酰化蛋白的信号强度来可视化和比较（图1）。随着酰基链长度的增加，观察到明显的效果。在用烷炔基硬脂酸酯（alk-stear）标记的细胞中，脂肪酸的皂化和BSA递送用于代谢标记，通过点击化学和荧光叠氮基探针检测（图1，右）大大增加了S-酰化蛋白信号的检测，这表明烷炔基脂肪酸标记的细胞掺入总体上增加。相反，在用最短和最易溶性脂肪酸炔基 - 肉豆蔻酸酯（烷基 - myr;13-十四炔酸或13-TDYA）处理的细胞中未观察到显着差异。与炔基 - 肉豆蔻酸酯（13-TDYA）相比，用炔基 - 棕榈酸酯标记的细胞（图1，中间）显示出中间标记增加，但小于炔基 - 硬脂酸酯。
重要的是，用0.1M KOH处理PVDF膜在很大程度上从用炔基 - 棕榈酸酯和炔基 - 硬脂酸酯孵育的细胞中去除了脂肪酸标记，确认大部分信号是通过酯或硫酯键（图1，中间和右侧，底部面板）。正如预期的那样，由于肉豆蔻酸酯通过酰胺键附着在蛋白质上，因此炔基 - 肉豆蔻酸酯的掺入主要是耐碱的（图1，左，底图）。
图2显示了点击化学检测免疫沉淀蛋白脂肪酰化的多功能性和灵敏度。如前所述，将HEK293T细胞转染成肉豆蔻酰化的C端亨廷顿蛋白（HTT）与GFP（myr-ctHTT-GFP）并用烷炔基-肉豆蔻酸酯标记18。免疫沉淀后，ctHTT-GFP从磁珠中释放出来，并与裂解物一起进行点击化学反应。不仅在免疫沉淀物中检测到野生型（WT）myr-ctHTT-GFP的肉豆蔻酰化，而且在裂解物中强烈检测到，而G2A突变完全阻断了ctHTT-GFP的肉豆蔻酰化（图2）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> 图1：使用点击化学检测脂肪酰化蛋白。 HEK293T细胞直接与指定的脂肪酸（非汁液）或随后皂化（汁液）孵育并与载体蛋白BSA孵育，如方案2.1-2.7中所述。通过将100μg蛋白质裂解物置于点击化学中，用SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上，将炔基脂肪酸与荧光叠氮化物联系起来。用0.1M Tris pH 7.0或0.1M KOH处理后，逆转硫酯键，使用荧光叠氮化物检测脂肪酰化。GAPDH被用作装载控制;抗GAPDH罗丹明（1：5，000）。Alk-myr = 13-TDYA， alk-pal = 15-HDYA， alk-ste = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> 图2：使用点击化学检测N-肉豆蔻酰化的ctHTT-GFP。 将HEK293T细胞转染为C端截断（ct）和肉豆蔻可亲热形式的HTT（myr-ctHTT-GFP）并用炔基 - 肉豆蔻酸酯标记。包括一种非肉豆蔻酰化形式，必需甘氨酸被丙氨酸取代（G2A）。收获和裂解后，使用山羊抗GFP免疫沉淀ctHTT-GFP。裂解物在从磁珠中释放后进行点击化学反应（左）以及免疫沉淀物。肉豆蔻酰化是使用链霉亲和素Alexa 680（SA680）检测的。使用兔子抗GFP与反兔子Alexa 488组合检测GFP。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> 图3：实验方案的工作流程方案。 协议中主要实验步骤的工作流程大纲。在协议可能暂停的几个点上被注意到。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

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Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

脂肪酰化的研究在细胞蛋白质相互作用和疾病中具有重要意义。这里介绍的是一种改进的方案，用于改善脂肪酰化蛋白的点击化学检测，其可应用于各种细胞类型并与其他测定相结合，包括脉冲追逐和质谱分析。

优化了炔基脂肪酸类似物的掺入，用于使用点击化学检测脂肪酰化蛋白

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

这种方法改善了脂肪酸向细胞的递送，并保护它们免受游离脂肪酸递送的毒性作用，从而确保更一致的标记。点击化学检测的灵敏度和效率取决于脂肪酸标记的有效摄取。我们已经证明，这可以大大改善。该协议的几个步骤非常具体，需要密切关注。例如，视觉演示可以澄清和展示如何避免在标签混合物中形成固体。为了制备标记介质，用5%葡聚糖/木炭包被的FBS，1X青霉素链霉素，2毫摩尔L-谷氨酰胺和100毫摩尔丙酮酸钠补充DMEM，然后在使用前将其预热至37摄氏度。在一天前在具有PBS的六孔组织培养皿中轻轻洗涤HEK-293 T细胞，然后用标记培养基代替PBS。用5%二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞约45分钟，然后用脂肪酸进行代谢标记。为了皂化脂肪酸类似物，将至少两微升的炔基脂肪酸类似物直接移液到三毫升锥形反应小瓶的底部。在靠近反应瓶底部的玻璃边缘移取等量的稀释氢氧化钾，使得分配的氢氧化钾体积与脂肪酸混合。合上小瓶盖，轻轻敲击以混合溶液。将反应瓶在65摄氏度下加热约五分钟或直到溶液变得清晰，表明脂肪酸已被掺入。但是，请注意液体不会蒸发太多。接下来，移液器预热20%无脂肪酸BSA，使得脂肪酸与氢氧化钾与无脂肪酸BSA的体积比为1-1-50，达到20X BSA结合的炔基脂肪酸的最终浓度。通过上下移液来混合溶液，然后在37摄氏度下孵育15分钟。通过将20X脂肪酸BSA偶联物直接加入饥饿培养基中来标记HEK-293 T细胞，以在25微摩尔炔基肉豆蔻酸酯或100微摩尔炔基棕榈酸酯和硬脂酸炔基中达到1%BSA的最终浓度。为了进行比较，通过将两微升未标记的脂肪酸直接移入饥饿培养基中来添加非皂化液体，然后将细胞放回培养箱中三到六个小时。孵育完成后，在室温下用PBS轻轻洗涤细胞，然后通过加入500微升不含EDTA的改性RIPA缓冲液并在4摄氏度下旋转裂解物15分钟来收获和裂解细胞。将裂解物以16， 000 g在4摄氏度下离心10分钟，然后将上清液收集在1.7毫升微量离心管中并将其储存在零下20摄氏度。使用不含EDTA的改性RIPA缓冲液，将1.7毫升微量离心管中的50至100微克蛋白质裂解物取至等体积。保持反应量尽可能小。向每个样品中加入STS以达到1%的最终浓度 制备点击试剂的预混液，并将适当体积添加到裂解液中，然后通过上下移液进行混合。将裂解物在37摄氏度的水浴中在黑暗中孵育30分钟，偶尔混合。对于免疫沉淀，将裂解物与兔抗GFP混合，并在4摄氏度下旋转孵育过夜。向每个管中加入15至20微升预先平衡的0.1%SDS RIPA磁珠，并使其在4摄氏度下末端反应三小时。用裂解缓冲液洗涤珠子，并重悬于含有1%SDS的45微升50毫摩尔HEPES缓冲液中。将珠子在80摄氏度下加热15分钟。在孵育期间，大约每五分钟倒置或搅拌一次管子，然后短暂旋转所有管子。当样品仍然温热时，收集含有蛋白质的上清液。将43微升上清液与7微升的点击试剂预混液混合，并让它们在37摄氏度下在黑暗中反应30分钟。在西方图中，随着酰链长度的增加，在皂化和非皂化炔基脂肪酸之间的点击化学检测的标记效率中观察到显着的影响。在用硬脂酸炔基标记的细胞中，脂肪酸的皂化和用于代谢标记的BSA递送通过点击化学和荧光氮杂探针检测大大增加了S-酰化蛋白信号的检测，表明炔基脂肪酸标记的细胞掺入总体上增加。相反，在用最短和最易溶性脂肪酸烷炔基肉豆蔻酸酯处理的细胞中未观察到显着差异。与肉豆蔻酸炔基酯相比，用棕榈酸炔基标记的细胞显示出标记的中间增加，但小于硬脂酸炔基。重要的是，用0.1摩尔氢氧化钾处理PVDF膜在很大程度上从用棕榈酸炔酯和硬脂酸炔酯孵育的细胞中去除了脂肪酸标记，证实大部分信号是通过酯或硫酯键。正如预期的那样，由于肉豆蔻酸酯通过酰胺键附着在蛋白质上，因此炔基肉豆蔻酸酯的掺入主要是耐碱的。点击化学后，在免疫沉淀物和裂解物中检测到野生型肉豆蔻酰化C端亨廷顿GFP的肉豆蔻酰化，而G2A突变完全阻断了C端亨廷顿GFP的肉豆蔻酰化。点击化学后，我们可以对脂肪酰化蛋白进行亲和纯化以进行质谱分析。这可能通过保护细胞免受毒性而产生脂肪酰化蛋白的不同谱。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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脂肪酸鉴定<em&gt;蜡状芽孢杆菌</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

科研

生物化学

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镍 - 席夫碱的水解复杂环境条件适宜酸不稳定保护基团的保留

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