Name: optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af National Science and Engineering Research Council (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao blev finansieret af The Ram og Lekha Tumkur Memorial Scholarship gennem Biologisk Institut ved University of Waterloo og Lucy Morrison Memorial Bursary gennem IODE Ontario ud over kandidatforskningsfinansieringen fra University of Waterloo, der omfatter Graduate Research Studentship (50503-11072), Science Graduate Award og Graduate Teaching Assistantship. Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af Martin-laboratoriet for deres støtte til at forberede dette manuskript, især Stephanie Ryall, Harleen Gill og Sadia Khan, der oprindeligt hjalp med at oprette Martin Lab som forberedelse til disse undersøgelser. Forfatterne vil også gerne takke Dr. Luc Berthiaume for den venlige gave af ctHTT-GFP-konstruktionerne og Dr. Shaun Sanders for kritisk input i forberedelsen af manuskriptet. Figur 3 blev oprettet med BioRender.com.

1. Cellekultur
<ol><li>For at supplere DMEM (Dulbeccos modificerede ørnemedium) til cellekultur tilsættes 10% føtalt kvægserum (FBS), 1x penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin og 100 mM natriumpyruvat (1% vol/vol).</li>
	<li>Plade ca. 5 x 105 HEK293T celler/brønd af en 6-brønds vævskulturskål og vokse i 18 timer i en 37 °C befugtet inkubator med 5% CO2 for at nå 75%-80% sammenløbet.</li>
	<li>Fedtsyre serum deprivation<ol>
<li>For at forberede mærkningsmedier skal du forberede DMEM som ovenfor (trin 1.1) uden 10% FBS. Udskift FBS med 5% dextran-trækulbelagt FBS (DCC-FBS). Forvarm til 37 °C før brug.</li>
		<li>Vask forsigtigt cellerne med 1x fosfatbufret saltvand (PBS) ved stuetemperatur og erstat med mærkningsmedier. BEMÆRK: HEK293T-celler løsner sig let fra vævskulturplader. Pas på, når du vasker celler og udskifter medier. Minimer omrøring under overførsel til og fra inkubatoren så meget som muligt.</li>
		<li>Returner cellerne til 37 °C-inkubatoren med 5 % CO2 , og inkuber ca. 45 minutter (minimum 15 minutter er effektivt), op til 60 minutter, før du fortsætter med metabolisk mærkning med fedtsyrer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fremstilling og forsæbning af fedtsyreanaloger
<ol><li>Stamopløsningerne af alkynylfedtsyrer forberedes på forhånd ved at opløses i DMSO for at opnå følgende koncentrationer og opbevares ved -20 °C. Tø op ved stuetemperatur efter behov. Opbevar forberedelserne til deres bedste ydeevne under N2 eller Ar. Alkynyl-myristat (13-tetradecynosyre, 13-TDYA): 25 mM Alkynylpalmikat (15-hexadecynosyre; 15-HDYA): 100 mM Alkynylstearat (17-octadecynosyre; 17-ODYA): 100 mM
</li>
	<li>For at forberede 20% fedtsyrefri BSA (FAFBSA) skal du veje 2 g FAFBSA i et 50 ml engangsrør.<ol>
<li>Bring op til 10 ml med forvarmet (37 °C) DMEM.</li>
		<li>Bland ved ende-over-ende rotation eller ved hvirvel, og anbring i et 37 ° C vandbad for at opløse FAFBSA fuldstændigt.</li>
		<li>Brug 0,2 μm filter til at filtrere sterilisering af mediet.</li>
		<li>Aliquot i ca. 1 ml volumen og opbevares ved -20 °C. Tø op efter behov og varm op til 37 °C i et vandbad inden brug.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For at øge opløseligheden af fedtsyre- og fedtsyreanalogerne forsæbes ved at inkubere med 20% molært overskud af kaliumhydroxid (KOH) i 3 ml glaskoniske reaktionshætteglas. BEMÆRK: Disse hætteglas gør det muligt for saltet at forblive opløseligt, samtidig med at det sikres, at FAFBSA ikke størkner fra den høje varme. Brugen af glas forhindrer også fedtsyrer i at klæbe til plasten.<ol>
<li>Pipette ud mindst 2 μL alkynylfedtsyre analog direkte til bunden af et 3 ml konisk reaktionshætteglas. Der fremstilles 2 μL lipid pr. brønd af en 6-brønds plade, der anvendes (se tabel 1). BEMÆRK: På grund af fedtsyrernes hydrofobicitet er det bedst at belægge pipettens spids ved at tegne det ønskede volumen flere gange, før det dispenseres i reaktionshætteglasset.</li>
		<li>Fortynd 1 M KOH til koncentrationer svarende til 20% molært overskud af alkynylfedtsyreetiketten (30 mM for 13-TDYA og 120 mM for 15-HDYA og 17-ODYA).</li>
		<li>Pipette en lige stor mængde fortyndet KOH (1 μL: 1 μL fedtsyre: KOH) ud tæt på bunden af reaktionshætteglasset på kanten af glasset, således at koh'ens dispenserede volumen blandes med fedtsyren.</li>
		<li>Luk låget på hætteglasset, og tryk forsigtigt for at blande opløsningerne. BEMÆRK: Blandingen kan størkne hurtigt, især med stigende længder af fedtsyrens carbonhydridkæde. Pas på ikke at pipetere det faste stof (dvs. bland ikke ved pipettering).</li>
		<li>Reaktionshætteglasset opvarmes ved 65 °C i ca. 5 minutter, eller så snart fedtsyren er inkorporeret (opløsningen bliver klar). BEMÆRK: Fedtsyrer med et højere antal carbonatoly og nedsat opløselighed, såsom stearat (17-ODYA), kan kræve længere inkubationstider for at blive fuldt inkorporeret i KOH ved 65 °C. Hæv temperaturen til 70 °C, hvis det er nødvendigt. Et vandbad er bedst. Pas på, at væsken ikke fordamper for meget.</li>
		<li>Når fedtsyrerne er gået i opløsning, og der ikke er nogen synlige faste stoffer tilbage, forvarmede pipetten 20% FAFBSA, således at volumenforholdet mellem fedtsyrer: KOH: FAFBSA er 1: 1: 50 for at opnå en endelig koncentration af 20x BSA-bundne alkynylfedtsyrer.</li>
		<li>Bland ved at pipettere op og ned. Løsningen fremstår typisk klar uden synlige faste stoffer. BEMÆRK: Typisk vil eventuelle små faste stoffer gå i opløsning efter inkubation ved 37 °C.</li>
		<li>Inkuber fedtsyren og FAFBSA i 15 minutter ved 37 °C. BEMÆRK: Den forsæbte etiket på dette tidspunkt er stabil ud over 15 minutter. 
		 </li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samlet medievolumen (ml)</td>
			<td>Vol. fedtsyre eller fedtsyreanalog (μL)</td>
			<td>Vol. KOH (μL)</td>
			<td>Vol. 20% FAFBSA (μL)</td>
			<td>Samlet vol. af BSA-konjugeret forsæbnet etiket (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>208</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>100</td>
			<td>104</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Saponified fedtsyre mærkningsforhold. Eksperimentelle volumener af fedtsyre, KOH og FAFBSA til forsæbning af fedtsyreetiket i henhold til mængden af anvendte medier.
<ol start="4"><li>Gentag trin 2.3 som et kontrolelement. med fedtsyrer uden alkynetiket.</li>
	<li>Mærk cellerne med 1/20 volumen af 20x fedtsyre-BSA-konjugeret direkte på sultemediet (typisk 100 μL i 2 ml medier / celler) for at opnå en endelig koncentration på 1% BSA og 25 μM for alkynylmyristat eller 100 μM for alkynylpalbitat og alkynylstearat. BEMÆRK: For at minimere mængden af fysisk forstyrrelse af de vedhæftede celler skal du danne en dråbe i spidsen af pipetten tæt på overfladen af mediet i stedet for at pipettere direkte ind i mediet. Hvis du bruger acylationshæmmere, tilsættes mindst 15 minutter før de mærkede fedtsyrer. Tiderne kan variere afhængigt af de anvendte celler eller hæmmere. Det er blevet anbefalet at bruge forsæbningen til dette trin også28.<ol>
<li>Til sammenligning tilsættes ikke-forsæbte lipider ved pipettering af 2 μL (eller svarende til volumen forsæbnet) af umærket fedtsyre direkte i sultemediet.</li>
		<li>Placer celler tilbage i inkubatoren og inkuber i 3-6 timer. BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at bestemme optimal mærkningstid for hver celletype eller eksperimentel tilstand. Længere inkubationstider kan potentielt føre til nedbrydning af fedtsyrerne ved β oxidation og/eller inkorporering i andre lipidgrupper, såsom phospholipider28.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vask forsigtigt cellerne med 1x PBS ved stuetemperatur.</li>
	<li>Høst og lyser cellerne med 500 μL ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)-fri modificeret radioimmunoprecipitationsassay (RIPA) buffer (0,1% SDS, 50 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N-ethanesulfonsyre (HEPES) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% ikke-denaturerende vaskemiddel, 0,5% natriumdeoxycholat, 2 mM MgCl2 med frisk tilsat 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og 10 μg/μL Pepstatin A (eller EDTA-fri komplet proteasehæmmercocktail)) ved at vugge lysaterne i 15 minutter ved 4 °C.<ol>
<li>Lysaterne centrifugeres ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.</li>
		<li>Supernatanten opsamles i 1,7 ml mikrocentrifugerør, og opbevares ved -20 °C, indtil den er klar til at fortsætte med klikreaktionen. BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Lysater er stabile ved -20 °C i op til 1 måned. Det anbefales dog at fortsætte med klikreaktionen rettidigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kvantificer proteinkoncentrationerne ved hjælp af et passende assay i henhold til producentens protokol, såsom et vaskemiddelkompatibelt (DC) assay.</li>
</ol>3. Klik på reaktion på cellelysater
<ol><li>Forbered reagenserne til klikkemi.<ol>
<li>Opløs tris-(benzyltriazolylmethyl) amin (TBTA) i DMSO til 2 mM. Opbevares i små aliquoter med tørremiddel ved -20 °C i op til 2-3 måneder. Bedst opbevaret under N2 eller Ar.</li>
		<li>Opløs CuSO4 i ddH2O-vand for at opnå 50 mM. Opbevares ved stuetemperatur i op til 2 måneder.</li>
		<li>Tris-carboxyethylphosphin (TCEP) opløses i ddH2O-vand til 250 mM. Opbevares i mørke ved 4 °C og foretager friske 50 mM fortyndinger lige før klikreaktionen.</li>
		<li>Forbered 2 mM azid i DMSO. Opbevares i små alikvoter med tørremiddel ved -20 °C i op til 6 måneder. Bedst opbevaret under N2 eller Ar. BEMÆRK: Det blev observeret, at produkterne med tre eller flere polyethylenglycolgrupper fungerede bedst med biotin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bring 50-100 μg proteinlysater i 1,7 ml mikrocentrifugerør til samme volumen ved hjælp af den samme lysisbuffer som ovenfor. BEMÆRK: Hold reaktionsvolumenet så lille som muligt (20-100 μL).<ol>
<li>Tilsæt natriumdodecylsulfat (SDS) til hver prøve for at opnå en endelig koncentration på 1%.</li>
		<li>Forbered en masterblanding af klikreagenser, således at de endelige koncentrationer efter tilsætning til lysaterne er: 100 μM TBTA (2 mM lager), 1 mM CuSO4, (50 mM lager) 1 mM TCEP (50 mM lager) og 100 μM azid sonde (2 mM lager). Kombiner lagerløsninger i overensstemmelse hermed (se tabel 2). BEMÆRK: Ordren er vigtig. Bland helt efter tilsætning af hver komponent.</li>
		<li>Tilsæt passende mængder af masterblandingen i lysaterne. Bland ved at pipettere op og ned.</li>
		<li>Inkuber i 30 minutter i mørke i et 37 °C vandbad. Omrør /bland lejlighedsvis.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Total reaktion vol (μL)</td>
			<td>Vol. protein (μL)</td>
			<td>Vol. TBTA (2 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. CuSO4 (50 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. TCEP (50 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. azido sonde (2 mM) (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>43</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>86</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Klik på forholdet mellem reagens og proteinvolumen. Eksperimentelle volumener af klikkemiske reagenser og tilsvarende lagerkoncentrationer ud over mængderne af proteinprøver.
4. Klik på reaktion på immunudfældede proteiner
<ol><li>Alternativt er det muligt at udføre klikreaktionen på immunudfældede (IP) proteiner på eller uden for perlerne. BEMÆRK: Typisk fører det at udføre klik fra perlerne til den mindste baggrund og er bedst, når man tester nye proteiner af interesse.<ol>
<li>Transfektceller til proteinet af interesse, i dette tilfælde vildtype myristoyleret C-terminal huntingtin (HTT) smeltet sammen med GFP (myr-ctHTT-GFP) og ctHTT-GFP med en G2A-substitution ved hjælp af calciumphosphat-DNA-coprecipitation, som tidligere beskrevet41.<ol>
<li>Plade 2,5 x 105 celler / brønd i 6-brønds vævskulturplader og vokse natten over til ~ 70-80% sammenløb.</li>
			<li>Forbered DNA-blandingen ved at tilsætte 2,5 μg DNA i 10 μL med 99,75 μL molekylær kvalitet H2O til et 1,7 ml mikrocentrifugerør. Derefter tilsættes 15,25 μL CaCl2 dråbevis til DNA-blandingen.</li>
			<li>Dna/CaCl2-blandingen tilsættes til et separat rør indeholdende 125 μL 2x HEPES-bufferet saltvand (HBS, pH 7,0) på en dråbevis måde ved blanding.</li>
			<li>Tilsæt langsomt DNA/CaCl2/HBS-blandingen til cellerne. Efter 2-4 timer skal du udskifte medierne og inkubere natten over. Fortsæt med mærkning fra trin 1.3-2.8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forbered lige store mængder 500 μg protein i lysisbuffer.</li>
		<li>Udfør IP ved at inkubere med kanin anti-GFP til ctHTT-GFP roterende natten over ved 4 ° C.</li>
		<li>Tilsæt 15-20 μL protein G-perler, der er præ-ligestillet med lysisbuffer, til hvert rør, og lad det reagere ende-over-ende ved 4 °C i 3 timer.</li>
		<li>Vask perlerne med lysisbuffer og genophæns i 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES-buffer.</li>
		<li>Opvarm perlerne ved 80 °C i 15 min og inverter rørene eller omrør ca. hvert 5. minut. Drej kortvarigt rørene og vend tilbage til 80 °C.</li>
		<li>Saml supernatanten, der indeholder proteinerne, mens prøverne stadig er varme. BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og de immunudfældede prøver kan opbevares ved -20 °C eller -80 °C, hvis de ikke anvendes til klikkemi med det samme.</li>
		<li>Lad 43 μL af supernatanten reagere med 7 μL masterblanding af klikreagenser.</li>
		<li>Fortsæt med reaktionen som angivet i trin 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SDS-PAGE og western blotting
<ol><li>Reaktionen og denatureres ved at tilsætte 1x prøvebelastningsbuffer indeholdende 25 mM dithiothreitol (DTT) og varme ved 95 °C i 5 minutter. BEMÆRK: Der kan anvendes op til 100 mM DTT28. Brug ikke β-mercaptoethanol med S-acylerede proteiner, da det kan hydrolysere thioesterbindingerne og fjerne den klikkede fedtsyreanalog.</li>
	<li>Spin kort ned prøverne.</li>
	<li>Adskil proteinerne med SDS-PAGE på en polyacrylamidgel i dubletter. BEMÆRK: Der kræves to geler til alkalisk behandling med KOH for at bekræfte tilstedeværelsen af thioesterbindinger. Hvis der anvendes en fluorescerende zitidsonde, kan acylation detekteres i gel eller efter overførsel ved hjælp af den angivne excitationskanal.</li>
	<li>Overfør til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (aktiveret i methanol og skyllet i ddH2O - 5 min hver) med halvtørt overførselsapparat ved 25 V, 1,0 A (konstant) i 30 minutter.</li>
	<li>Efter kortvarig skylning af membranerne med ddH2O suges den ene replikatmembran i 0,1 M KOH i methanol/vand (9:1 v/v) og den anden i 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 i methanol/vand (9:1 v/v) som en ikke-alkalisk kontrol i 60 minutter ved stuetemperatur med skånsom gyngen.</li>
	<li>Skyl membranerne kort i ddH2O-vand efterfulgt af 6 gange 5 minutters vask i PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20). BEMÆRK: Vask grundigt.</li>
	<li>Bloker membranerne natten over i 5% skummetmælksblokerende buffer (1x PBS, 0,1% Tween20).</li>
</ol>6. Udfør western blot
<ol><li>Hvor det er angivet, sonde med fluorescerende mærket Streptavidin (1:5000) og belastningskontrol, anti-GAPDH rhodamin (1:5000) i 5% BSA-blokerende buffer (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) ved stuetemperatur i 45-60 minutter med blid rocking, i mørke.<ol>
<li>Undersøg den immunudfældede proteinplet først med primært anti-GFP-antistof i 5% skummetmælksblokerende buffer, derefter med passende sekundære antistoffer i 5% BSA som i trin 6.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vask membranerne i 5 minutter i PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) i alt fire gentagelser og skyl med ddH2O-vand inden billeddannelse.</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Direkte tilsætning af fedtsyrer til celler i kultur kan resultere i uopløselighed, udfældning af lipider og lipotoksicitet40. Derfor kan tilsætning af fedtsyrer direkte til celler ikke kun resultere i dårlig cellulær optagelse og lav tilgængelighed af fedtsyremærket, men også et nedsat antal levedygtige celler til downstream-analyse samt aktivering af off-target-veje. Imidlertid involverer mange metaboliske mærkningsprotokoller til påvisning af klikkemi direkte tilsætning af fedtsyrer, og et stort antal palmitoylproteomundersøgelser ved hjælp af klikkemidetektion til dato forsæber sjældent fedtsyreretiketterne eller inkuberer dem med BSA8,36. Det er vigtigt at overveje, at effektiviteten og følsomheden af klikkemidetektion af fedtaclylerede proteiner er afhængig af tilstrækkelig cellulær optagelse af fedtsyreanalogerne. Derfor er det rimeligt at spekulere i, at mange S-acylerede proteiner kan have undgået påvisning i proteomiske undersøgelser på grund af en lav tilgængelighed af fedtsyreetiketterne fra dårlig inkorporering i cellerne, især når den langkædede fedtsyre 17-ODYA blev brugt. 17-ODYA, eller alkynyl-stearat, har været den meget anvendte etiket til flere undersøgelser på grund af dets kommercielle tilgængelighed og dets tidlige anvendelse8,36. Resultaterne af denne protokol viser imidlertid, at forsæbning af 17-ODYA resulterer i den største stigning i påvisningen af S-acylerede proteiner sammenlignet med kortkædede fedtsyrer såsom palmitat eller myristat. Derfor kan gentagelse af disse eksperimenter med forsæbte etiketter give yderligere substrater af S-acylation, der måske tidligere er blevet overset. Yderligere, mens de fleste palmitoylacyltransferaser foretrækker palmitat til S-acylering, har nogle præferencer for andre længder af fedtsyrer, såsom stearat15,38,44. Derudover foretrækker nogle proteiner eller endda specifikke steder i proteiner en fedtsyre frem for en anden15,45. Derfor kan undersøgelser, der anvender 17-ODYA, have en bias mod proteiner S-acyleret med stearat, ikke palmitat, mens de også underrepræsenterer disse proteiner på grund af lavere påvisning.
Den forbedrede metaboliske mærkningseffektivitet for klikkemi er afhængig af forsæbning af lipider og inkubation med FAFBSA-trin samt den aflipiderede FBS. Alle fedtsyrer skal være fuldstændigt forsæbt i KOH uden synlige faste stoffer tilbage, før de fortsætter med inkubation med FAFBSA. Dette kan være et vanskeligt skridt, og timing er afgørende. Når de forsæbte fedtsyrer er gået i opløsning ved 65 °C, tilsættes varm BSA med det samme, da yderligere opvarmning vil forårsage fordampning af DMSO fra fedtsyrerne. Derudover vil den forsæbte etiket begynde at størkne igen, så snart den begynder at afkøle. Derfor skal FAFBSA være varm og tilsættes hurtigt, efter at saltet er blevet opløseligt. Glasreaktionshætteglassene og deres form er vigtige for dette trin. De tillader det forsæbte lipid at være varmt nok til at forblive opløseligt, mens det er køligt nok til at sikre, at FAFBSA ikke størkner. Tilstrækkelig blanding via pipettering er også vigtig på dette trin for at sikre en homogen opløsning til mærkning.
Reagenserne til klikkemi skal opbevares korrekt, typisk med tørremidler eller under N2 - eller Ar-gas ved -20 °C til -80 °C. Manglende acylationssignal eller svagt signal kan skyldes ustabile reagenser, især ældre TBTA- og azidlageropløsninger. Desuden skal man være forsigtig med fluorescerende zidopløsninger, som skal beskyttes mod lys så meget som muligt. Derudover kan det være nødvendigt at teste variabler såsom metode til lipidmangel og mærkningstid for at bestemme de optimale betingelser afhængigt af den anvendte celletype. For eksempel kan neuronale celler have brug for længere mærkningstider, fordi medieændringer og lipidmangel er vanskelige (ikke offentliggjort).
Fordelen ved denne protokol er mest dramatisk, når den anvendes til langkædede fedtsyrer. For kortere kæder bliver stigningen i signalintensiteten mindre dramatisk, men er stadig sandsynligvis beskyttende for cellerne. Mens de foreslåede ændringer vil forbedre proteinacylationsdetektion generelt, betragtes klikkemi stadig som en lipidcentreret metode1, der er begrænset til påvisning af dynamisk, ikke stabilt S-acylerede proteiner1. Andre begrænsninger, der skal overvejes, omfatter kravet om fedtsyremangel for at fremme mærkning og dets relativt begrænsede udvalg af kompatible celletyper sammenlignet med acyl-biotinudveksling (ABE) påvisning af S-acylation16. På trods af disse begrænsninger er detektion af klikkemi hurtigere end de fleste acyludvekslingsassays og er bedre egnet til påvisning af proteiner, der ikke tåler de gentagne proteinudfældningstrin, der kræves til acyludvekslingsassays. Derudover kan denne fremgangsmåde kombineres med samtidig mærkning ved hjælp af andre klikanalyser såsom pulsjagtanalyse38.
Anvendelsen af denne modifikation til metabolisk mærkning til klikkemi øgede den samlede påvisning af acylerede proteiner, især S-acylerede, med en række proteomiske teknikker, der anvendes sammen med klikkemi. Som vist kan fluorogen detektion anvendes som et alternativ til biotin (figur 1)28. Dette er især nyttigt, fordi der ikke er nogen endogent fluorescerende proteiner i cellelysaterne. Derudover kan fluoroforer, der først aktiveres efter klikkemi, anvendes46. Den forsæbte og FAFBSA-bundne fedtsyre til mærkning af klikkemi kan hjælpe med vanskeligheder med at detektere proteiner af interesse på grund af en samlet stigning i mængden af etiket, der er tilgængelig i cellen, og ved at begrænse toksiske virkninger af tilsætning af fedtsyrer direkte til medierne. Det kan også bruges sammen med massespektrometri27 til at øge påvisningen af proteiner med lav overflod, især når det tages sammen med de seneste fremskridt ved hjælp af maskinlæringsalgoritmer, der forhindrer overflødige målinger for at øge følsomheden over for proteiner med lav overflod, i modsætning til eksisterende dataafhængig erhvervelse, der favoriserer påvisning af de mest rigelige proteiner47 . Derudover kan klikkemi kombineres med stabil isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC) og pulsjagtmetoder til fremstilling af kvantificerbare data om dynamisk protein S-acylation27. Endelig har Hannoush-gruppen kombineret klikkemi med nærhedsligeringsassay (PLA) for at muliggøre enkeltcellevisualisering og undersøgelser af subcellulær fordeling af palmitoylerede proteiner43,48.

Fedtacylation involverer kovalent tilsætning af fedtsyrer til proteiner og er kendt for sin betydning for at fremme protein-membraninteraktioner, men har også vist sig at fremme protein-protein-interaktioner, konformationsændringer og regulere katalytiske steder af enzymer1,2,3,4,5,6,7 . Fedt acylation har vist sig som et potentielt lægemiddelmål i et utal af sygdomme, herunder infektion, kræft, betændelse og neurodegeneration, hvor forstyrrelser i palmitoylering er blevet dokumenteret8,9,10,11,12,13. Dette er primært blevet ansporet af udviklingen af nye kemiske detektionsmetoder, som muliggjorde storstilet identifikation af S-acylerede proteinmål.
Fedtacylering kan omfatte en række modifikationer, der involverer kovalent tilsætning af mættede og umættede fedtsyrer, men refererer typisk til N-myristoylering og S-acylation. N-myristoylering refererer til tilsætning af myristinsyre til N-terminale glyciner enten co-translationelt på spirende polypeptider eller post-translationelt på nyligt eksponerede N-terminale glyciner efter proteolytisk spaltning2,14. N-myristoylering sker gennem en irreversibel amidbinding. På den anden side refererer S-acylation typisk til den reversible tilsætning af langkædede fedtsyrer til cysteinrester via en thioesterbinding. Den mest almindelige form for denne ændring omfatter inkorporering af palmitat og kaldes derfor almindeligvis S-palmitoylering eller simpelthen palmitoylering11,15. På mange måder ligner S-palmitoylering fosforylering. Det er dynamisk, enzymatisk reguleret og viser sig at være meget trækbart.
Indtil det sidste årti blev studiet af fedtacylation forhindret af begrænsede detektionsmetoder, som krævede radioaktivt mærkede fedtsyrer. Dette havde flere ulemper, herunder omkostninger, sikkerhedsproblemer og meget lange detektionstider. Typisk blev enten tritieret eller ioderet palmitat anvendt til påvisning af S-acylation16. Tritiated palmitat krævede lange detektionsperioder med autoradiografifilm, som kan tage uger til måneder. Mens [125I] iod-fedtsyreanaloger forkortede detektionstiderne, udbød det en meget højere sikkerhedsrisiko og krævede tæt skjoldbruskkirtelovervågning af eksperimenter. Derudover var disse metoder ikke-kvantitative, hvilket derfor begrænsede evnen til at måle dynamisk palmitoylering og også tidskrævende at opsætte og rydde op på grund af det ekstra personlige beskyttelsesudstyr og radioaktiv overvågning. Endelig var radioaktive etiketter ikke velegnede til proteomiske undersøgelser og typisk begrænset til påvisning af lav gennemstrømning af specifikke proteiner af interesse. Efterhånden som flere substrater blev påvist, og uundgåeligt de enzymer, der formidler hver modifikation, blev identificeret, var det klart, at der var behov for nye detektionsmetoder17,18,19,20,21. Næsten samtidig opstod der flere nye metoder til påvisning af fedtaylerede proteiner. Den første udnytter reversibiliteten og reaktiviteten af thioesterbindingen af S-acylation. ACYL-biotin-udvekslingsassayet (ABE) erstatter kemisk palmitat med biotin til efterfølgende tilbagetrækning af S-acylerede proteiner ved hjælp af avidin agaroseperler og direkte påvisning ved western blot22,23,24. Dernæst blev bio-ortogonal mærkning af fedtsyrer og kemoselektiv tilsætning til tags eller håndtag udviklet, der omfattede brugen af Staudinger ligation og klikkemi25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Endelig erstatter acylharpiksassisteret fangst (RAC) i lighed med ABE i det væsentlige S-acylerede steder med thiol-reaktive perler til indfangning og påvisning af S-acylerede proteiner34,35. Sammen har udvekslings- og klikkemibaserede assays givet mere effektive og følsomme metoder til acylationsdetektion og affinitetsrensning til downstream-analyse og har efterfølgende ført til opdagelsen af tusindvis af S-acylerede proteiner8,36.
Udtrykket klikkemi omfatter en gruppe kemiske reaktioner, men refererer oftest til Cu (I) -katalyseret azido-alkyn [3 + 2] cycloadditionsreaktionsmekanisme mellem en alkynylgruppe og en azidogruppe27,28,37. Især i tilfælde af fedtacylering involverer klikkemi påvisning af S-palmitoylering eller N-myristylering ved at inkorporere bio-ortogonal 16-carbonalkynylpalnitat (15-hexadecynoinsyre; 15-HDYA) eller 14-carbonalkynylmyristat (13-tetradecynosyre; 13-TDYA) i celler for at mærke endogent acylerede proteiner28 . Efter cellelyse og immunfældning af proteinet af interesse udføres en klikkemisk reaktion (kovalent kobling mellem en alkyn og etazid) for at binde en affinitetssonde, typisk biotin, til påvisning ved western blot28,37. Alternativt kan klikkemi udføres på det samlede cellelysat, og fedt acylerede proteiner kan affinitet renses til identifikation ved massespektrometri. Den indledende klikkemireaktion med azido-biotin øgede selektiviteten og følsomheden af detektion over en million gange sammenlignet med radioaktivitet2. En anden fordel ved klikkemi er, at den kan kombineres med andre klassiske mærkningsmetoder, såsom pulsjagtanalyse af proteinomsætning ved hjælp af azido-homoalanin til kvantitativ analyse38. Derudover kan fluorescerende sonder anvendes i stedet for biotin eller andre biokemiske sonder, såsom FLAG- eller Myc-tags, for at undersøge proteinlokalisering16,28,39.
På trods af den relative brugervenlighed af klikkemi kan detektion begrænses af den lave opløselighed og potentielle toksicitet ved anvendelse af langkædede frie fedtsyrer i cellekultur40. På trods af præferencen for palmitat under S-acylation for de fleste proteiner har mange undersøgelser især anvendt 18-carbonstearat (17-octadecynsyre - 17-ODYA) snarere end palmitat (15-HDYA) til påvisning af S-acylerede proteiner på grund af dets kommercielle tilgængelighed og relativt lave omkostninger. 17-ODYA er dog meget uopløselig og kræver særlig opmærksomhed, når den bruges. Derudover kan klikkemi kræve en vis nuanceret forberedelse og opbevaring af kemikalier. Heri beskriver protokollen en mærkningsmetode, som optimerer leveringen ved hjælp af forsæbning af fedtsyrer, levering med fedtsyrefri BSA og delipideret føtalt kvægserum (FBS) for at øge opløseligheden og omgå potentielle toksiske virkninger af tilsætning af frie fedtsyrer til celler28. Denne metode virker i en række forskellige celletyper og er endda blevet brugt i levende dyr28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>90270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide/bis solution 29:1</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFDye 647 azide plus</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-tris, ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 16,000xg, 4&#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imager</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (1 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid sodium salt monohydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent compatible (DC) assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0231-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>319015CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219989950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blot Turbo Semi-dry transfer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Incubator at 37&#176;C and 5% CO2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement solution</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myristic Acid (25 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M0476-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid (100 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 10x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>450201EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A (synthetic)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-085-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-184-G005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75801-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified)</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal antibody to GFP</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>600-110-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)</td>
			<td>Soltec Ventures</td>
			<td>M115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-043-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Reagent Grade 1L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHEATON NextGen V Vials 3 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry

Fedtacylation, den kovalente tilsætning af mættede fedtsyrer til proteinsubstrater, er vigtig for at regulere et utal af cellulære funktioner ud over dets konsekvenser i kræft og neurodegenerative sygdomme. Den seneste udvikling inden for metoder til påvisning af fedtacylation har muliggjort effektiv og ikke-farlig påvisning af fedtacylaterede proteiner, især ved brug af klikkemi med bioortogonal mærkning. Imidlertid kan klikkemidetektion begrænses af den dårlige opløselighed og potentielle toksiske virkninger ved at tilføje langkædede fedtsyrer til cellekultur. Beskrevet her er en mærkningsmetode med optimeret levering ved hjælp af forsæbte fedtsyrer i kombination med fedtsyrefri BSA samt delipiderede medier, som kan forbedre påvisning af svært detekterede fedt acylerede proteiner. Denne effekt var mest udtalt med alkynyl-stearatanalogen, 17-ODYA, som har været den mest almindeligt anvendte fedtsyreanalog i klikkemidetektion af acylerede proteiner. Denne ændring vil forbedre cellulær inkorporering og øge følsomheden over for acyleret proteindetektion. Derudover kan denne tilgang anvendes i en række celletyper og kombineres med andre assays såsom pulsjagtanalyse, stabil isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur og massespektrometri til kvantitativ profilering af fedtacylerede proteiner.

Forskellen i mærkningseffektivitet mellem forsæbte og ikke-forsæbte (ikke-sap) alkynylfedtsyrer til påvisning af klikkemi kan visualiseres og sammenlignes med signalintensiteten af fede acylerede proteiner gennem western blot (figur 1). En mærkbar effekt blev observeret med stigende længde af acylkæderne. I celler mærket med alkynylstearat (alk-stear) øgede forsæbning af fedtsyren og levering med BSA til metabolisk mærkning drastisk påvisningen af S-acyleret proteinsignal gennem klikkemi og påvisning af en fluorescerende azido-sonde (figur 1, højre), hvilket tyder på en samlet stigning i cellulær inkorporering af alkynylfedtsyreetiketten. Omvendt blev der ikke observeret nogen mærkbar forskel i celler behandlet med den korteste og mest opløselige fedtsyre, alkynyl-myristat (alk-myr; 13-tetradecynosyre eller 13-TDYA). Celler mærket med alkynylpalbitat (figur 1, midten) viste en mellemliggende stigning i etiketten sammenlignet med alkynylmyristat (13-TDYA), men mindre end alkynylstearat.
Det er vigtigt, at behandling af PVDF-membraner med 0,1 M KOH stort set fjernede fedtsyreetiketterne fra celler inkuberet med alkynylpalbitat og alkynylstearat, hvilket bekræftede, at størstedelen af signalet var gennem en ester- eller thioesterbinding (figur 1, midt og højre, bundpaneler). Som forventet var inkorporeringen af alkynyl-myristat for det meste alkaliresistent (figur 1, venstre, nederste paneler) på grund af fastgørelsen af myristat til proteiner gennem en amidbinding.
Figur 2 viser alsidigheden og følsomheden af klikkemi til påvisning af fedtocylation af immunudfældede proteiner. HEK293T-celler blev transfekteret med myristoxyleret C-terminal huntingtin (HTT) smeltet sammen med GFP (myr-ctHTT-GFP) og mærket med alkynyl-myristat, som tidligere beskrevet18. Efter immunfældning blev ctHTT-GFP frigivet fra perlerne og udsat for klikkemi sammen med lysaterne. Ikke alene blev myristoylering af vildtype (WT) myr-ctHTT-GFP påvist i immunudfældningerne, men det blev stærkt påvist i lysaterne, mens G2A-mutationen fuldstændigt blokerede myristoylering af ctHTT-GFP (figur 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> Figur 1: Påvisning af fedtaylerede proteiner ved hjælp af klikkemi. HEK293T-celler blev inkuberet med de angivne fedtsyrer direkte (ikke-sap) eller efter forsæbning (sap) og inkubation med bærerproteinet BSA som beskrevet i protokol 2.1-2.7. Alkynylfedtsyrer blev forbundet med fluorescerende azid ved at udsætte 100 μg proteinlysater for klikkemi, adskilt af SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Efter behandling med 0,1 M Tris pH 7,0 eller 0,1 M KOH, for at vende thioesterbindinger, blev fedtacylation påvist under anvendelse af et fluorescerende azid. GAPDH blev brugt som belastningskontrol; anti-GAPDH rhodamin (1:5.000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> Figur 2: Påvisning af N-myristoyleret ctHTT-GFP ved hjælp af klikkemi. HEK293T-celler blev transfekteret med C-terminalt afkortet (ct) og myristoylerbar form af HTT (myr-ctHTT-GFP) og mærket med alkynyl-myristat. En ikke-myristoylerbar form med den essentielle glycin erstattet med en alanin blev inkluderet (G2A). Efter høst og lysis blev ctHTT-GFP immunudfældet ved hjælp af gede-anti-GFP. Lysater blev udsat for klikkemisk reaktion (venstre) såvel som immunfældninger efter frigivelse fra perlerne. Myristoylering blev påvist ved hjælp af Streptavidin Alexa 680 (SA680). GFP blev påvist ved hjælp af kanin anti-GFP i kombination med anti-kanin Alexa 488. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> Figur 3: Arbejdsgangsskema for eksperimentel protokol. Arbejdsgangsoversigt over de vigtigste eksperimentelle trin i protokollen. Der noteres flere punkter, hvor protokollen kan sættes på pause. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Undersøgelsen af fedtacylation har vigtige implikationer i cellulære proteininteraktioner og sygdomme. Præsenteret her er en modificeret protokol til forbedring af klikkemidetektion af fedt acylerede proteiner, som kan anvendes i forskellige celletyper og kombineres med andre assays, herunder pulsjagt og massespektrometri.

Optimeret inkorporering af alkynylfedtsyreanaloger til påvisning af fedtaylerede proteiner ved hjælp af klikkemi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Denne metode forbedrer leveringen af fedtsyrer til celler og beskytter dem mod de toksiske virkninger af fri fedtsyrelevering, hvilket sikrer mere ensartet mærkning. Følsomheden og effektiviteten af detektering af klikkemi afhænger af den effektive optagelse af fedtsyremærket. Vi har vist, at dette i høj grad kan forbedres.Flere trin i protokollen er meget specifikke og skal følges nøje. En visuel demonstration kan afklare og vise for eksempel, hvordan man undgår dannelse af faste stoffer i mærkningsblandingen. For at forberede mærkningsmediet skal du supplere DMEM med 5% dextran / trækulbelagt FBS, 1X penicillin streptomycin, to millimolære L-glutamin og 100 millimolært natriumpyruvat, og derefter forvarme det til 37 grader Celsius før brug.Vask forsigtigt HEK-293 T-cellerne, der er belagt en dag før i en seks-brønds vævskulturskål med PBS, og udskift derefter PBS med mærkningsmedier. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i ca. 45 minutter, før du fortsætter til metabolisk mærkning med fedtsyrer. For at forsæbe fedtsyreanalogerne pipetteres mindst to mikroliter alkynylfedtsyreanalog direkte ind i bunden af et hætteglas med en konisk reaktion på tre milliliter.Pipette en lige stor mængde fortyndet kaliumhydroxid tæt på bunden af reaktionshætteglasset på kanten af glasset, således at det dispenserede volumen af kaliumhydroxidet blandes med fedtsyren. Luk låget på hætteglasset, og tryk forsigtigt for at blande opløsningerne. Reaktionshætteglasset opvarmes ved 65 grader Celsius i ca. fem minutter, eller indtil opløsningen bliver klar, hvilket indikerer, at fedtsyren er inkorporeret.Pas dog på, at væsken ikke fordamper for meget. Dernæst forvarmede pipetten 20% fedtsyrefri BSA, således at volumenforholdet mellem fedtsyrer og kaliumhydroxid og fedtsyrefri BSA er 1-1-50, hvilket opnår en endelig koncentration af 20X BSA-bundne alkynylfedtsyrer. Bland opløsningen ved at pipettere op og ned, og inkuber den derefter i 15 minutter ved 37 grader Celsius.Mærk HEK-293 T-cellerne ved at tilsætte 20X fedtsyren BSA-konjugere direkte i sultemediet for at opnå en endelig koncentration på 1% BSA i 25 mikromolær alkynylmyristat eller 100 mikromolær alkynylpalbitat og alkynylstearat. Til sammenligning tilsættes ikke-forsæbte væsker ved at pipettere to mikroliter umærket fedtsyre direkte i sultemediet, og derefter placere cellerne tilbage i inkubatoren i tre til seks timer. Når inkubationen er afsluttet, vaskes cellerne forsigtigt med PBS ved stuetemperatur, høstes og lyses cellerne ved at tilsætte 500 mikroliter EDTA-fri modificeret RIPA-buffer og rotere lysaterne i 15 minutter ved fire grader Celsius.Centrifuge lysaterne ved 16.000 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius, opsaml derefter supernatanten i 1,7 ml mikrocentrifugerør og opbevar dem ved minus 20 grader Celsius. Bring 50 til 100 mikrogram proteinlysater i 1,7 milliliter mikrocentrifugerør til et lige stort volumen ved hjælp af den EDTA-fri modificerede RIPA-buffer. Hold reaktionsvolumenet så lille som muligt.Tilsæt STS til hver prøve for at opnå en endelig koncentration på 1%Forbered en masterblanding af klikreagenserne og tilsæt passende mængder i lysaterne, bland derefter ved at pipettere op og ned. Inkuber lysaterne i mørke i 30 minutter i et 37 grader Celsius vandbad med lejlighedsvis blanding. Til immunfældning blandes lysater med kanin anti-GFP og inkuberes natten over med rotation ved fire grader Celsius.Tilsæt 15 til 20 mikroliter magnetiske perler, der er for-ligevægtet med 0,1% SDS RIPA til hvert rør, og lad det reagere ende over ende ved fire grader Celsius i tre timer. Vask perlerne med lysisbuffer og resuspend i 45 mikroliter 50 millimolær HEPES-buffer indeholdende 1% SDS. Varm perlerne op ved 80 grader Celsius i 15 minutter.Under inkubationen skal du vende eller omrøre rørene cirka hvert femte minut og derefter dreje alle rørene kort. Mens prøverne stadig er varme, skal du samle supernatanten, der indeholder proteinerne. Kombiner 43 mikroliter supernatanten med syv mikroliter af klikreagensernes mastermix, og lad dem reagere i mørke i 30 minutter ved 37 grader Celsius.På et vestligt plot blev der observeret en mærkbar effekt i mærkningseffektiviteten til påvisning af klikkemi mellem forsæbte og ikke-forsæbte alkynylfedtsyrer med en stigende længde af acylkæderne. I celler mærket med alkynylstearat øgede forsæbning af fedtsyren og levering med BSA til metabolisk mærkning drastisk påvisningen af S-acyleret proteinsignal gennem klikkemi og påvisning af en fluorescerende azitoprobe, hvilket tyder på en samlet stigning i cellulær inkorporering af alkynylfedtsyreetiketten. Omvendt blev der ikke observeret nogen mærkbar forskel i celler behandlet med den korteste og mest opløselige fedtsyre alkynyl myristat.Celler mærket med alkynylpalbitat viste en mellemliggende stigning i etiketten sammenlignet med alkynylmyristat, men mindre end alkynylstearat. Det er vigtigt, at behandling af PVDF-membraner med 0,1 molært kaliumhydroxid stort set fjernede fedtsyreetiketterne fra celler inkuberet med alkynylpalbitat og alkynylstearatet, hvilket bekræftede, at størstedelen af signalet var gennem en ester- eller thioesterbinding. Som forventet var inkorporeringen af alkynyl myristat for det meste alkaliresistent på grund af fastgørelsen af myristat til proteiner gennem en amidbinding.Efter klikkemi blev myristoylering af vildtype myrististoyleret C-terminal Huntington GFP påvist i immunfældningerne såvel som lysaterne, mens G2A-mutationen fuldstændigt blokerede myristoylering af den C-terminale Huntington GFP. Efter klikkemi kan vi udføre affinitetsrensning af fedtacylerede proteiner til massespektrometri. Dette kan give en anden profil af fedt acylerede proteiner ved at beskytte celler mod toksicitet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identifikation af fedtsyrer i<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyseprodukter af en Ni-Schiff-Base Complex Brug af betingelser egnet til Bevarelse af syrelabile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimeret protokol til ekstraktion af proteiner fra humanmitralventilen

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fedtsyre 13C Isotopologue profilering giver indblik i trofiske Carbon overførsel og Lipid metabolisme af hvirvelløse forbrugere

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation

Genetiske indarbejdelse af Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og dens anvendelse på Protein konjugation

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Opsamling og identifikation af RNA-bindende proteiner ved hjælp af klik kemi-assisteret RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme til undersøgelse af bakteriel Patogenchlorid fedtsyre inkorporering i membran Fosfolipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisk screening af Nukleaseaktivitet ved hjælp af nukleinsyre sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Klikkemibaseret fluorometrisk assay for apolipoprotein N-acyltransferase fra enzymkarakterisering til screening med høj kapacitet

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support