Name: optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de National Science and Engineering Research Council (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao werd gefinancierd door The Ram en Lekha Tumkur Memorial Scholarship via het Department of Biology aan de Universiteit van Waterloo, en de Lucy Morrison Memorial Bursary via IODE Ontario, naast de graduate onderzoeksfinanciering van de Universiteit van Waterloo, bestaande uit het Graduate Research Studentship (50503-11072), Science Graduate Award en Graduate Teaching Assistantship. De auteurs willen alle leden van het Martin-lab bedanken voor hun steun bij het voorbereiden van dit manuscript, met name Stephanie Ryall, Harleen Gill en Sadia Khan die in eerste instantie hebben geholpen bij het opzetten van het Martin Lab ter voorbereiding op deze studies. De auteurs willen ook Dr. Luc Berthiaume bedanken voor het vriendelijke geschenk van de ctHTT-GFP-constructies en Dr. Shaun Sanders voor de kritische input bij het voorbereiden van het manuscript. Figuur 3 is gemaakt met BioRender.com.

1. Celkweek
<ol><li>Om DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) voor celkweek aan te vullen, voegt u 10% Foetaal Runderserum (FBS), 1x Penicilline-Streptomycine, 2 mM L-glutamine en 100 mM natriumpyruvaat (1% vol /vol) toe.</li>
	<li>Plaats ongeveer 5 x 105 HEK293T cellen/put van een 6-well tissuekweekschaal en groei gedurende 18 uur in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2 om 75%-80% confluentie te bereiken.</li>
	<li>Vetzuur serum deprivatie<ol>
<li>Als u etiketteringsmedia wilt voorbereiden, bereidt u DMEM zoals hierboven (stap 1.1) voor zonder 10% FBS. Vervang FBS door 5% dextran-charcoal coated FBS (DCC-FBS). Voorverwarmen tot 37 °C voor gebruik.</li>
		<li>Was de cellen voorzichtig met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur en vervang door etiketteermedia. OPMERKING: HEK293T-cellen maken gemakkelijk los van weefselkweekplaten. Wees voorzichtig bij het wassen van cellen en het vervangen van media. Minimaliseer agitatie tijdens de overdracht van en naar de couveuse zoveel mogelijk.</li>
		<li>Breng de cellen terug naar de incubator van 37 °C met 5% CO2 en incubeer ongeveer 45 minuten (minimaal 15 minuten is effectief), tot 60 minuten, voordat u overgaat tot metabole etikettering met vetzuren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bereiding en verzeping van vetzuuranalogen
<ol><li>Bereid de stamoplossingen van alkynylvetzuren van tevoren voor door oplosbaarheid in DMSO om de volgende concentraties te bereiken en bewaar bij -20 °C. Ontdooi indien nodig op kamertemperatuur. Bewaar de voorbereidingen voor hun beste prestaties onder N2 of Ar. Alkynyl-myristaat (13-tetradecyaanzuur, 13-TDYA): 25 mM Alkynylpalmitaat (15-hexadecyaanzuur; 15-HDYA): 100 mM Alkynylstearaat (17-octadecyaanzuur; 17-ODYA): 100 mM
</li>
	<li>Om 20% vetzuurvrij BSA (FAFBSA) te bereiden, weeg je 2 g FAFBSA in een wegwerpbuis van 50 ml.<ol>
<li>Breng tot 10 ml met voorverwarmde (37 °C) DMEM.</li>
		<li>Meng door end-over-end rotatie of door vortexing en plaats in een waterbad van 37 °C om FAFBSA volledig op te lossen.</li>
		<li>Gebruik een filter van 0,2 μm om het medium te filteren.</li>
		<li>Aliquot in volumes van ongeveer 1 ml en bewaren bij -20 °C. Ontdooi indien nodig en verwarm tot 37 °C in een waterbad voor gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om de oplosbaarheid van de vetzuur- en vetzuuranalogen te verbeteren, verzeping door te incuberen met 20% molaire overmaat kaliumhydroxide (KOH) in glazen conische reactieflacons van 3 ml. OPMERKING: Deze injectieflacons zorgen ervoor dat het zout oplosbaar blijft en zorgen ervoor dat de FAFBSA niet stolt van het hoge vuur. Het gebruik van glas voorkomt ook dat vetzuren aan het plastic blijven plakken.<ol>
<li>Pipetteer ten minste 2 μL alkynylvetzuur analoog rechtstreeks naar de bodem van een conische reactieflacon van 3 ml. Bereid 2 μL lipide per putje van een gebruikte 6-putplaat (zie tabel 1). OPMERKING: Vanwege de hydrofobiciteit van vetzuren is het het beste om de punt van de pipet te coaten door het gewenste volume meerdere keren op te stellen voordat u het in de reactieflacon doseert.</li>
		<li>Verdun 1 M KOH tot concentraties gelijk aan 20% molaire overmaat van het alkynylvetzuuretiket (30 mM voor 13-TDYA en 120 mM voor 15-HDYA en 17-ODYA).</li>
		<li>Pipetteer een gelijke hoeveelheid verdund KOH (1 μL: 1 μL vetzuur: KOH) dicht bij de bodem van de reactieflacon aan de rand van het glas, zodat het afgegeven volume van de KOH zich mengt met het vetzuur.</li>
		<li>Sluit het deksel van de injectieflacon en tik voorzichtig om de oplossingen te mengen. OPMERKING: Het mengsel kan snel stollen, vooral bij toenemende lengtes van de koolwaterstofketen van het vetzuur. Zorg ervoor dat u de vaste stof niet pipettert (d.w.z. niet mengen door te pipetteren).</li>
		<li>Verwarm de reactieflacon bij 65 °C gedurende ongeveer 5 minuten of zodra het vetzuur is opgenomen (oplossing wordt helder). OPMERKING: Vetzuren met een hoger aantal koolstofatomen en verminderde oplosbaarheid, zoals stearaat (17-ODYA), kunnen langere incubatietijden nodig hebben om volledig in de KOH te worden opgenomen bij 65 °C. Verhoog indien nodig de temperatuur tot 70 °C. Een waterbad is het beste. Let er wel op dat de vloeistof niet te veel verdampt.</li>
		<li>Zodra de vetzuren in oplossing zijn gegaan en er geen zichtbare vaste stoffen overblijven, pipetteer voorgewarmd 20% FAFBSA zodanig dat de volumeverhouding van vetzuren: KOH: FAFBSA 1: 1: 50 is om een uiteindelijke concentratie van 20x BSA-gebonden alkynylvetzuren te bereiken.</li>
		<li>Meng door op en neer te pipetteren. De oplossing ziet er meestal helder uit zonder zichtbare vaste stoffen. OPMERKING: Meestal gaan kleine vaste stoffen na incubatie bij 37 °C in oplossing.</li>
		<li>Incubeer het vetzuur en FAFBSA gedurende 15 min bij 37 °C. OPMERKING: Het verzeepte etiket op dit punt is stabiel na 15 minuten. 
		 </li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Totaal mediavolume (ml)</td>
			<td>Vol. vetzuur of vetzuur analoog (μL)</td>
			<td>Vol. KOH (μL)</td>
			<td>Vol. 20% FAFBSA (μL)</td>
			<td>Totaal vol. van BSA-geconjugeerd verzeept etiket (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>208</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>100</td>
			<td>104</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Verzeepte vetzuuretiketteringsverhoudingen. Experimentele volumes van vetzuur, KOH en FAFBSA voor de verzeping van vetzuurlabel volgens het volume van de gebruikte media.
<ol start="4"><li>Herhaal als besturingselement stap 2.3. met vetzuren zonder alkynlabel.</li>
	<li>Label de cellen met 1/20 volume van het 20x vetzuur-BSA-conjugat rechtstreeks op de uithongeringsmedia (meestal 100 μL in 2 ml media / cellen) om een uiteindelijke concentratie van 1% BSA en 25 μM voor alkynyl-myristaat, of 100 μM voor alkynylpalmitaat en alkynyl-stearaat te bereiken. OPMERKING: Om de hoeveelheid fysieke verstoring van de aangesloten cellen te minimaliseren, vormt u een druppel aan de punt van de pipet dicht bij het oppervlak van het medium in plaats van rechtstreeks in de media te pipetteren. Als u acyleringsremmers gebruikt, voeg dan ten minste 15 minuten voorafgaand aan de gelabelde vetzuren toe. Tijden kunnen variëren, afhankelijk van de gebruikte cellen of remmer. Het is aanbevolen om de verzeping ook voor deze stap te gebruiken28.<ol>
<li>Voeg ter vergelijking niet-verzeepte lipiden toe door 2 μL (of equivalent aan volume verzeept) ongelabeld vetzuur rechtstreeks in de uithongeringsmedia te pipetteren.</li>
		<li>Plaats cellen terug in de couveuse en incubeer gedurende 3-6 uur. OPMERKING: De optimale timing van de etikettering moet mogelijk worden bepaald voor elk celtype of experimentele toestand. Langere incubatietijden kunnen mogelijk leiden tot de afbraak van de vetzuren door β-oxidatie en/of opname in andere lipidengroepen, zoals fosfolipiden28.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was de cellen voorzichtig met 1x PBS op kamertemperatuur.</li>
	<li>Oogst en lyseer de cellen met 500 μL ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-vrije gemodificeerde radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer (0,1% SDS, 50 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanensulfonzuur (HEPES) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% niet-denaturerend wasmiddel, 0,5% natriumdeoxycholaat, 2 mM MgCl2 met vers toegevoegde 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en 10 μg/μL Pepstatine A (of EDTA-vrije volledige proteaseremmercocktail)) door de lysaten gedurende 15 minuten bij 4 °C te laten schommelen.<ol>
<li>Centrifugeer de lysaten bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Verzamel het supernatant in microcentrifugebuizen van 1,7 ml en bewaar het bij -20 °C totdat het klaar is om door te gaan met de klikreactie. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Lysaten zijn stabiel bij -20 °C gedurende maximaal 1 maand. Het wordt echter aanbevolen om tijdig door te gaan met de klikreactie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantificeer de eiwitconcentraties met behulp van een geschikte test volgens het protocol van de fabrikant, zoals een detergentcompatibele (DC) test.</li>
</ol>3. Klikreactie op cellysaten
<ol><li>Bereid de reagentia voor op klikchemie.<ol>
<li>Los tris-(benzyltriazolylmethyl) amine (TBTA) op in DMSO tot 2 mM. Bewaren in kleine aliquots met droogmiddel bij -20 °C gedurende maximaal 2-3 maanden. Best opgeslagen onder N2 of Ar.</li>
		<li>Los CuSO4 op in ddH2O water om 50 mM te bereiken. Bewaren bij kamertemperatuur gedurende maximaal 2 maanden.</li>
		<li>Los tris-carboxyethylfosfine (TCEP) op in ddH2O water tot 250 mM. Bewaren in het donker bij 4 °C en verse verdunningen van 50 mM vlak voor de klikreactie.</li>
		<li>Bereid 2 mM azide in DMSO. Bewaren in kleine hoeveelheden met droogmiddel bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Best opgeslagen onder N2 of Ar. OPMERKING: Er werd waargenomen dat de producten met drie of meer polyethyleenglycolgroepen het beste werkten met biotine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng 50-100 μg eiwitlysaten in microcentrifugebuizen van 1,7 ml tot hetzelfde volume met dezelfde lysisbuffer als hierboven. OPMERKING: Houd het reactievolume zo klein mogelijk (20-100 μL).<ol>
<li>Voeg natriumdodecylodylsulfaat (SDS) toe aan elk monster om een uiteindelijke concentratie van 1% te bereiken.</li>
		<li>Bereid een mastermix van klikreagentia voor zodat de uiteindelijke concentraties na toevoeging aan de lysaten zijn: 100 μM TBTA (2 mM voorraad), 1 mM CuSO4, (50 mM voorraad) 1 mM TCEP (50 mM voorraad) en 100 μM azide sonde (2 mM voorraad). Combineer dienovereenkomstig voorraadoplossingen (zie tabel 2). OPMERKING: De volgorde is belangrijk. Meng volledig na toevoeging van elk onderdeel.</li>
		<li>Voeg de juiste volumes van de mastermix toe aan de lysaten. Meng door op en neer te pipetteren.</li>
		<li>Incubeer gedurende 30 minuten in het donker in een waterbad van 37 °C. Roer/meng af en toe.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Totaal reactievolume (μL)</td>
			<td>Vol. eiwit (μL)</td>
			<td>Vol. TBTA (2 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. CuSO4 (50 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. TCEP (50 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. azido sonde (2 mM) (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>43</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>86</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Klik op reagens- en eiwitvolumeverhoudingen. Experimentele volumes van de click chemistry reagentia en bijbehorende voorraadconcentraties, naast de volumes eiwitmonsters.
4. Klikreactie op immunoprecipiteerde eiwitten
<ol><li>Als alternatief is het mogelijk om de klikreactie uit te voeren op immunoprecipiteerde (IP) eiwitten op of naast de kralen. OPMERKING: Meestal leidt het uitvoeren van de klik op de kralen tot de minste achtergrond en is het het beste bij het testen van nieuwe eiwitten van belang.<ol>
<li>Transfectcellen voor het eiwit van belang, in dit geval wildtype myristoylated C-terminal huntingtine (HTT) gefuseerd met GFP (myr-ctHTT-GFP) en ctHTT-GFP met een G2A-substitutie, met behulp van calciumfosfaat DNA-coprecipitatie, zoals eerder beschreven41.<ol>
<li>Plaat 2,5 x 105 cellen /put in 6-well weefselkweekplaten en groei 's nachts tot ~ 70-80% confluentie.</li>
			<li>Bereid het DNA-mengsel voor door 2,5 μg DNA in 10 μL met 99,75 μL moleculaire kwaliteit H2O toe te voegen aan een microcentrifugebuis van 1,7 ml. Voeg vervolgens 15,25 μL CaCl2 druppelsgewijs toe aan het DNA-mengsel.</li>
			<li>Voeg DNA/CaCl2-mengsel toe aan een aparte buis met 125 μL 2x HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS, pH 7,0) op een druppelsgewijze manier met mengen.</li>
			<li>Voeg langzaam de DNA/CaCl2/HBS mix toe aan cellen. Vervang na 2-4 uur de media en incubeer 's nachts. Ga verder met labelen uit stap 1.3-2.8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereid gelijke volumes van 500 μg eiwit in lysisbuffer.</li>
		<li>Voer IP uit door te broeden met konijn anti-GFP voor ctHTT-GFP die 's nachts bij 4 °C draait.</li>
		<li>Voeg 15-20 μL eiwit G-kralen vooraf gebalanceerd met lysisbuffer toe aan elke buis en laat deze gedurende 3 uur end-over-end reageren bij 4 °C.</li>
		<li>Was de kralen met lysisbuffer en resuspend in 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES buffer.</li>
		<li>Verwarm de kralen gedurende 15 minuten op 80 °C en keer de buizen om of roer ongeveer elke 5 minuten. Draai de buizen kort rond en keer terug naar 80 °C.</li>
		<li>Verzamel het supernatant dat de eiwitten bevat terwijl de monsters nog warm zijn. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de immunoprecipiteerde monsters kunnen worden bewaard bij -20 °C of -80 °C, indien niet meteen gebruikt voor klikchemie.</li>
		<li>Laat 43 μL van het supernatant reageren met een mastermix van klikreagentia van 7 μL.</li>
		<li>Ga verder met de reactie zoals vermeld in stap 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SDS-PAGE en western blotting
<ol><li>Stop de reactie en denaturatie door 1x monsterbelastingsbuffer met 25 mM dithiothreitol (DTT) toe te voegen en gedurende 5 minuten bij 95 °C te verwarmen. OPMERKING: Tot 100 mM DTT kan worden gebruikt28. Gebruik geen β-mercaptoethanol met S-geacyleerde eiwitten, omdat dit de thioesterbindingen kan hydrolyseren en het aangeklikte vetzuuranaloog kan verwijderen.</li>
	<li>Draai de monsters kort naar beneden.</li>
	<li>Scheid de eiwitten met SDS-PAGE op een polyacrylamidegel, in duplicaten. OPMERKING: Twee gels zijn nodig voor de alkalische behandeling met KOH om de aanwezigheid van thioesterbindingen te bevestigen. Bij gebruik van een fluorescerende azidesonde kan acylering in de gel of na overdracht worden gedetecteerd met behulp van het aangegeven excitatiekanaal.</li>
	<li>Breng over op polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen (geactiveerd in methanol en gespoeld in ddH2O - elk 5 min) met semi-droge transferapparatuur op 25 V, 1,0 A (constant) gedurende 30 min.</li>
	<li>Na het kort spoelen van de membranen met ddH2O, weekt u één replicaatmembraan in 0,1 M KOH in methanol/water (9:1 v/v) en het andere in 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 in methanol/water (9:1 v/v) als een niet-alkalische regeling gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met zacht schommelen.</li>
	<li>Spoel de membranen kort in ddH2O water, gevolgd door 6 keer 5 minuten wassen in PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20). OPMERKING: Was grondig.</li>
	<li>Blokkeer de membranen 's nachts in 5% magere melkblokkerende buffer (1x PBS, 0,1% Tween20).</li>
</ol>6. Voer western blot uit
<ol><li>Indien aangegeven, sonde met fluorescerend getagd Streptavidin (1:5000) en belastingscontrole, anti-GAPDH rhodamine (1:5000) in 5% BSA-blokkeringsbuffer (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) bij kamertemperatuur gedurende 45-60 minuten met zacht schommelen, in duisternis.<ol>
<li>Onderzoek de immunoprecipiteerde eiwitvlek eerst met primair anti-GFP-antilichaam in 5% magere melkblokkerende buffer, vervolgens met geschikte secundaire antilichamen in 5% BSA zoals in stap 6.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was de membranen gedurende 5 minuten in PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) in totaal vier herhalingen en spoel af met ddH2O water voordat u gaat fotograferen.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Directe toevoeging van vetzuren aan cellen in cultuur kan leiden tot onoplosbaarheid, precipitatie van lipiden en lipotoxiciteit40. Bijgevolg kan het rechtstreeks toevoegen van vetzuren aan cellen niet alleen resulteren in een slechte cellulaire opname en lage beschikbaarheid van het vetzuuretiket, maar ook in een verminderd aantal levensvatbare cellen voor downstream-analyse, evenals activering van off-target pathways. Veel metabole etiketteringsprotocollen voor klikchemiedetectie omvatten echter directe toevoeging van vetzuren en een groot aantal palmitoyl-proteoomstudies met behulp van klikchemiedetectie tot op heden verzeept zelden de vetzuuretiketten of incubeer ze met BSA8,36. Het is belangrijk om rekening te houden met het feit dat de efficiëntie en gevoeligheid van klikchemiedetectie van vet-geacyleerde eiwitten afhankelijk zijn van voldoende cellulaire opname van de vetzuuranalogen. Daarom is het redelijk om te speculeren dat veel S-geacyleerde eiwitten mogelijk aan detectie in proteomische studies zijn ontsnapt vanwege een lage beschikbaarheid van de vetzuuretiketten door slechte opname in de cellen, vooral wanneer het vetzuur met de langere keten 17-ODYA werd gebruikt. 17-ODYA, of alkynyl-stearaat, is het meest gebruikte label bij uitstek voor verschillende studies vanwege de commerciële beschikbaarheid en het vroege gebruik8,36. De resultaten van dit protocol tonen echter aan dat verzeping van 17-ODYA resulteert in de grootste toename in de detectie van S-geacyleerde eiwitten, in vergelijking met vetzuren met een kortere keten zoals palmitaat of myristaat. Daarom kan het herhalen van deze experimenten met verzeepte labels extra substraten van S-acylering opleveren die mogelijk eerder over het hoofd zijn gezien. Verder, terwijl de meeste palmitoyl acyltransferases de voorkeur geven aan palmitaat voor S-acylering, hebben sommigen voorkeuren voor andere lengtes van vetzuren zoals stearaat15,38,44. Bovendien geven sommige eiwitten of zelfs specifieke plaatsen in eiwitten de voorkeur aan het ene vetzuur boven het andere15,45. Daarom kunnen studies met 17-ODYA een voorkeur hebben voor eiwitten S-acylated met stearaat, niet met palmitaat, terwijl ze die eiwitten ook ondervertegenwoordigd hebben vanwege een lagere detectie.
De verbeterde metabole etiketteringsefficiëntie voor klikchemie is afhankelijk van de verzeping van lipiden en incubatie met FAFBSA-stappen, evenals de gedelipide FBS. Alle vetzuren moeten volledig worden verzeept in KOH zonder zichtbare vaste stoffen voordat wordt overgegaan tot incubatie met FAFBSA. Dit kan een moeilijke stap zijn en timing is cruciaal. Nadat de verzeepte vetzuren in oplossing zijn gegaan bij 65 °C, voeg onmiddellijk warm BSA toe, omdat verdere verhitting zal leiden tot verdamping van de DMSO uit de vetzuren. Bovendien zal het verzeepte label opnieuw beginnen te stollen zodra het begint af te koelen. Daarom moet de FAFBSA warm zijn en snel worden toegevoegd nadat het zout oplosbaar is geworden. De glazen reactieflacons en hun vorm zijn belangrijk voor deze stap. Ze zorgen ervoor dat het verzeepte lipide warm genoeg is om oplosbaar te blijven, terwijl het koel genoeg is om ervoor te zorgen dat de FAFBSA niet stolt. Voldoende mengen via pipetteren is bij deze stap ook belangrijk om een homogene oplossing voor etikettering te garanderen.
De reagentia voor klikchemie moeten op de juiste manier worden opgeslagen, meestal met droogmiddelen of onder N2 - of Ar-gas bij -20 °C tot -80 °C. Gebrek aan acyleringssignaal of zwak signaal kan te wijten zijn aan onstabiele reagentia, met name oudere TBTA- en azide-stamoplossingen. Verder moet er voorzichtig worden omgegaan met fluorescerende azide-stamoplossingen, die zoveel mogelijk tegen licht moeten worden beschermd. Bovendien moeten variabelen zoals de methode van lipidedeprivatie en etiketteringstijd mogelijk worden getest om de optimale omstandigheden te bepalen, afhankelijk van het type cel dat wordt gebruikt. Neuronale cellen kunnen bijvoorbeeld langere labelingtijden nodig hebben omdat mediaveranderingen en lipidendeprivatie moeilijk zijn (ongepubliceerd).
Het voordeel van dit protocol is het meest dramatisch bij gebruik voor vetzuren met een langere keten. Voor kortere ketens wordt de toename van de signaalintensiteit minder dramatisch, maar is waarschijnlijk nog steeds beschermend voor de cellen. Hoewel de voorgestelde modificaties de detectie van eiwitacylering in het algemeen zullen verbeteren, wordt klikchemie nog steeds beschouwd als een lipidecentrische methode1 die beperkt is tot detectie van dynamisch, niet stabiel S-acyleerde eiwitten1. Andere beperkingen om te overwegen zijn onder meer de vereiste van vetzuurdeprivatie om etikettering te bevorderen, en het relatief beperkte bereik van compatibele celtypen in vergelijking met de acyl-biotine uitwisseling (ABE) detectie van S-acylatie16. Ondanks deze beperkingen is de detectie van klikchemie sneller dan de meeste acyluitwisselingstests en is deze beter geschikt voor de detectie van eiwitten die de herhaalde eiwitprecipitatiestappen die nodig zijn voor acyluitwisselingstests niet verdragen. Bovendien kan deze aanpak worden gecombineerd met gelijktijdige etikettering met behulp van andere kliktests zoals puls-achtervolgingsanalyse38.
Het gebruik van deze modificatie voor metabole etikettering voor klikchemie verhoogde de algehele detectie van geacyleerde eiwitten, met name S-acylated, met een verscheidenheid aan proteomische technieken die worden gebruikt in combinatie met klikchemie. Zoals getoond, kan fluorogene detectie worden gebruikt als alternatief voor biotine (figuur 1)28. Dit is vooral handig omdat er geen endogene fluorescerende eiwitten in de cellysaten zitten. Bovendien kunnen fluoroforen worden gebruikt die pas na klikchemie worden geactiveerd46. Het verzeepte en FAFBSA-gebonden vetzuur voor click chemistry labeling kan helpen bij het detecteren van eiwitten van belang vanwege een algehele toename van de hoeveelheid label die beschikbaar is in de cel en door het beperken van toxische effecten van het toevoegen van vetzuren rechtstreeks aan de media. Het kan ook worden gebruikt in combinatie met massaspectrometrie27 om de detectie van eiwitten met een lage abundantie te verhogen, vooral in combinatie met de recente vooruitgang met behulp van machine-learning-algoritmen die redundante metingen voorkomen om de gevoeligheid voor eiwitten met een lage abundantie te verhogen, in tegenstelling tot bestaande gegevensafhankelijke acquisitie die de detectie van de meest voorkomende eiwitten bevordert47 . Daarnaast kan klikchemie worden gecombineerd met stabiele isotoopetikettering met aminozuren in celkweek (SILAC) en pulsjachtmethoden om kwantificeerbare gegevens over dynamisch eiwit S-acylering27 te produceren. Ten slotte heeft de Hannoush-groep klikchemie gecombineerd met proximity ligation assay (PLA) om eencellige visualisatie en onderzoeken naar subcellulaire distributie van palmitoyleerde eiwitten mogelijk te maken43,48.

Vetaylering omvat de covalente toevoeging van vetzuren aan eiwitten en staat bekend om zijn belang bij het bevorderen van eiwit-membraaninteracties, maar er is ook aangetoond dat het eiwit-eiwitinteracties, conformatieveranderingen en katalytische plaatsen van enzymen bevordert1,2,3,4,5,6,7 . Vetaylering is naar voren gekomen als een potentieel medicijndoelwit in een groot aantal ziekten, waaronder infectie, kanker, ontsteking en neurodegeneratie, waar verstoringen in palmitoylatie zijn gedocumenteerd8,9,10,11,12,13. Dit is voornamelijk gestimuleerd door de ontwikkeling van nieuwe chemische detectiemethoden, die grootschalige identificatie van S-acylated protein targets mogelijk maakten.
Vetaylering kan een verscheidenheid aan modificaties omvatten waarbij de covalente toevoeging van verzadigde en onverzadigde vetzuren betrokken is, maar verwijst meestal naar N-myristoylation en S-acylatatie. N-myristoylation verwijst naar de toevoeging van myristinezuur aan N-terminale glycines, hetzij co-translationeel op ontluikende polypeptiden of posttranslationeel op nieuw blootgestelde N-terminale glycines na proteolytische splitsing2,14. N-myristoyatie vindt plaats door een onomkeerbare amidebinding. Aan de andere kant verwijst S-acylering meestal naar de omkeerbare toevoeging van lange keten vetzuren aan cysteïneresiduen via een thioesterbinding. De meest voorkomende vorm van deze wijziging omvat de opname van palmitaat en wordt daarom gewoonlijk aangeduid als S-palmitoylatie, of gewoon palmitoylatie11,15. In veel opzichten is S-palmitoylatie vergelijkbaar met fosforylering. Het is dynamisch, enzymatisch gereguleerd en blijkt zeer handelbaar te zijn.
Tot het laatste decennium werd het bestuderen van vetacylering belemmerd door beperkte detectiemethoden, waarvoor radioactief gelabelde vetzuren nodig waren. Dit had verschillende nadelen, waaronder kosten, veiligheidsproblemen en zeer lange detectietijden. Typisch werd tritiated of gejodeerd palmitaat gebruikt voor de detectie van S-acylering16. Tritiated palmitate vereiste lange detectieperioden met autoradiografiefilm, die weken tot maanden kunnen duren. Hoewel [125I] jood-vetzuuranalogen de detectietijden verkortten, vormde het een veel hoger veiligheidsrisico en vereiste het nauwlettende schildkliermonitoring van experimentatoren. Bovendien waren deze methoden niet-kwantitatief, waardoor de mogelijkheid om dynamische palmitoylatie te meten werd beperkt, en ook tijdrovend om op te zetten en op te ruimen vanwege de extra persoonlijke beschermingsmiddelen en radioactieve monitoring. Ten slotte waren radioactieve labels niet goed geschikt voor proteomische studies en meestal beperkt tot detectie van specifieke eiwitten met lage doorvoer. Naarmate er meer substraten werden gedetecteerd en onvermijdelijk de enzymen die elke modificatie bemiddelen werden geïdentificeerd, was het duidelijk dat nieuwe detectiemethoden nodig waren17,18,19,20,21. Vrijwel gelijktijdig ontstonden verschillende nieuwe methoden voor de detectie van vetgeacyleerde eiwitten. De eerste maakt gebruik van de reversibiliteit en reactiviteit van de thioesterbinding van S-acylering. De acyl-biotine uitwisseling (ABE) test vervangt chemisch palmitaat door biotine voor daaropvolgende pulldown van S-acylated eiwitten met behulp van avidine agarose kralen en directe detectie door western blot22,23,24. Vervolgens werden bio-orthogonale etikettering van vetzuren en chemoselectieve toevoeging aan tags of handvatten ontwikkeld die het gebruik van de Staudinger-ligatie en klikchemie omvatten25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Ten slotte vervangt acylhars assisted capture (RAC) net als de ABE in wezen S-acylated sites door thiol-reactieve kralen voor het vangen en detecteren van S-acylated proteins34,35. Samen hebben de op uitwisseling en klikchemie gebaseerde assays efficiëntere en gevoeligere methoden voor acyleringsdetectie en affiniteitszuivering voor downstream-analyse opgeleverd en hebben vervolgens geleid tot de ontdekking van duizenden S-geacyleerde eiwitten8,36.
De term klikchemie omvat een groep chemische reacties, maar verwijst meestal naar het Cu(I)-gekatalyseerde azido-alkyne [3+2] cycloadditiereactiemechanisme tussen een alkynylgroep en een azidogroep27,28,37. In het bijzonder, in het geval van vetaylering, omvat klikchemie de detectie van S-palmitoylering of N-myristylering door bio-orthogonale 16-koolstofalkynyl-palmitaat (15-hexadecyninezuur; 15-HDYA) of de 14-koolstofalkynyl-myristaat (13-tetradecynogeenzuur; 13-TDYA) respectievelijk in cellen op te nemen om endogene geacyleerde eiwitten te labelen28 . Na cellysis en immunoprecipitatie van het eiwit van belang, wordt een klikchemiereactie (covalente koppeling tussen een alkyn en een azide) uitgevoerd om een affiniteitsonde, typisch biotine, te binden voor detectie door western blot28,37. Als alternatief kan klikchemie worden uitgevoerd op het totale cellysaat en kunnen vet geacyleerde eiwitten worden gezuiverd voor identificatie door massaspectrometrie. De initiële klikchemiereactie met azido-biotine verhoogde de selectiviteit en gevoeligheid van detectie meer dan een miljoen keer in vergelijking met radioactiviteit2. Een ander voordeel van klikchemie is dat het kan worden gecombineerd met andere klassieke etiketteringsmethoden, zoals puls-achtervolgingsanalyse van eiwitomzet met behulp van azido-homoalanine voor kwantitatieve analyse38. Bovendien kunnen fluorescerende sondes worden gebruikt in plaats van biotine of andere biochemische sondes, zoals FLAG- of Myc-tags, om eiwitlokalisatie te onderzoeken16,28,39.
Ondanks het relatieve gebruiksgemak van klikchemie, kan de detectie worden beperkt door de lage oplosbaarheid en potentiële toxiciteit van het gebruik van lange keten vrije vetzuren in celkweek40. In het bijzonder, ondanks de voorkeur van palmitaat tijdens S-acylering voor de meerderheid van de eiwitten, hebben veel studies het 18-koolstofstearaat (17-octadecyaanzuur - 17-ODYA) gebruikt in plaats van palmitaat (15-HDYA) voor het detecteren van S-acylated eiwitten vanwege de commerciële beschikbaarheid en relatief lage kosten. 17-ODYA is echter zeer onoplosbaar en vereist speciale aandacht bij gebruik. Bovendien kan klikchemie enige genuanceerde voorbereiding en opslag van chemicaliën vereisen. Hierin beschrijft het protocol een etiketteringsbenadering, die de levering optimaliseert met behulp van verzeping van vetzuren, levering met vetzuurvrij BSA en gedelipideerd foetaal runderserum (FBS) om de oplosbaarheid te verhogen en potentiële toxische effecten van het toevoegen van vrije vetzuren aan cellen te omzeilen28. Deze methode werkt in verschillende celtypen en is zelfs gebruikt bij levende dieren28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>90270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide/bis solution 29:1</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFDye 647 azide plus</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-tris, ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 16,000xg, 4&#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imager</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (1 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid sodium salt monohydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent compatible (DC) assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0231-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>319015CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219989950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blot Turbo Semi-dry transfer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Incubator at 37&#176;C and 5% CO2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement solution</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myristic Acid (25 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M0476-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid (100 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 10x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>450201EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A (synthetic)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-085-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-184-G005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75801-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified)</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal antibody to GFP</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>600-110-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)</td>
			<td>Soltec Ventures</td>
			<td>M115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-043-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Reagent Grade 1L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHEATON NextGen V Vials 3 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry

Vetaylering, de covalente toevoeging van verzadigde vetzuren aan eiwitsubstraten, is belangrijk bij het reguleren van een groot aantal cellulaire functies, naast de implicaties ervan bij kanker en neurodegeneratieve ziekten. Recente ontwikkelingen in vetacylatiedetectiemethoden hebben een efficiënte en niet-gevaarlijke detectie van vet-acyleerde eiwitten mogelijk gemaakt, met name door het gebruik van klikchemie met bio-orthogonale etikettering. De detectie van klikchemie kan echter worden beperkt door de slechte oplosbaarheid en mogelijke toxische effecten van het toevoegen van lange keten vetzuren aan celkweek. Hier wordt een etiketteringsbenadering beschreven met geoptimaliseerde toediening met behulp van verzeepte vetzuren in combinatie met vetzuurvrij BSA, evenals gedelipide media, die de detectie van moeilijk te detecteren vet-acyleerde eiwitten kunnen verbeteren. Dit effect was het meest uitgesproken met het alkynyl-stearaatanaloog, 17-ODYA, dat het meest gebruikte vetzuuranaloog is geweest bij de detectie van geacyleerde eiwitten. Deze modificatie zal de cellulaire opname verbeteren en de gevoeligheid voor acylated protein detection verhogen. Bovendien kan deze benadering worden toegepast in verschillende celtypen en worden gecombineerd met andere assays zoals puls-chase-analyse, stabiele isotoopetikettering met aminozuren in celkweek en massaspectrometrie voor kwantitatieve profilering van vet-geacyleerde eiwitten.

Het verschil in etiketteringsefficiëntie tussen verzeepte en niet-verzeepte (niet-sap) alkynylvetzuren voor detectie van klikchemie kan worden gevisualiseerd en vergeleken door de signaalintensiteit van vetgeacyleerde eiwitten via western blot (figuur 1). Een merkbaar effect werd waargenomen bij toenemende lengte van de acylketens. In cellen gelabeld met alkynyl-stearaat (alk-stear) verhoogde verzeping van het vetzuur en toediening met BSA voor metabole etikettering de detectie van S-geacyleerd eiwitsignaal drastisch door klikchemie en detectie door een fluorescerende azido-sonde (figuur 1, rechts), wat een algehele toename van cellulaire opname van het alkynylvetzuuretiket suggereert. Omgekeerd werd geen merkbaar verschil waargenomen in cellen die werden behandeld met het kortste en meest oplosbare vetzuur, alkynyl-myristaat (alk-myr; 13-tetradecyaanzuur of 13-TDYA). Cellen gelabeld met alkynyl-palmitaat (figuur 1, midden) vertoonden een tussentijdse toename in label in vergelijking met alkynyl-myristaat (13-TDYA), maar minder dan alkynyl-stearaat.
Belangrijk is dat bij de behandeling van PVDF-membranen met 0,1 M KOH de vetzuuretiketten grotendeels werden verwijderd uit cellen geïncubeerd met alkynylpalmitaat en alkynyl-stearaat, wat bevestigt dat het grootste deel van het signaal door een ester- of thioesterbinding ging (figuur 1, midden en rechts, onderste panelen). Zoals verwacht was de opname van alkynyl-myristaat meestal alkaliresistent (figuur 1, links, onderste panelen), vanwege de hechting van myristaat aan eiwitten via een amidebinding.
Figuur 2 toont de veelzijdigheid en gevoeligheid van klikchemie om vetacylatatie van immunoprecipiteerde eiwitten te detecteren. HEK293T-cellen werden getransfecteerd met myristoylated C-terminal huntingtine (HTT) gefuseerd met GFP (myr-ctHTT-GFP) en gelabeld met alkynyl-myristaat, zoals eerder beschreven18. Na immunoprecipitatie werd ctHTT-GFP uit de kralen vrijgegeven en onderworpen aan klikchemie naast de lysaten. Niet alleen werd myristoyatie van wildtype (WT) myr-ctHTT-GFP gedetecteerd in de immunoprecipitaten, maar het werd ook sterk gedetecteerd in de lysaten, terwijl de G2A-mutatie myristoylation van de ctHTT-GFP volledig blokkeerde (figuur 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> Figuur 1: Detectie van vetgeacyleerde eiwitten met behulp van klikchemie. HEK293T-cellen werden direct geïncubeerd met de aangegeven vetzuren (niet-sap) of na verzeping (sap) en incubatie met het dragereiwit BSA, zoals beschreven in protocol 2.1-2.7. Alkynyl-vetzuren werden gekoppeld aan fluorescerend azide door 100 μg eiwitlysaten te onderwerpen aan klikchemie, gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF-membranen. Na behandeling met 0,1 M Tris pH 7,0 of 0,1 M KOH, om thioesterbindingen om te keren, werd vetacylatatie gedetecteerd met behulp van een fluorescerend azide. GAPDH werd gebruikt als laadcontrole; anti-GAPDH rhodamine (1:5.000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> Figuur 2: Detectie van N-myristoylated ctHTT-GFP met behulp van klikchemie. HEK293T-cellen werden getransfecteerd met C-terminaal afgeknotte (ct) en myristoylatable vorm van HTT (myr-ctHTT-GFP) en gelabeld met alkynyl-myristaat. Een niet-myristolestabiele vorm met de essentiële glycine vervangen door een alanine werd opgenomen (G2A). Na het oogsten en lysis werd ctHTT-GFP immunoprecipiteerd met behulp van geiten anti-GFP. Lysaten werden onderworpen aan klikchemiereactie (links) en immunoprecipitaten na afgifte van de kralen. Myristoylation werd gedetecteerd met Streptavidin Alexa 680 (SA680). GFP werd gedetecteerd met behulp van konijn anti-GFP in combinatie met anti-konijn Alexa 488. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> Figuur 3: Workflowschema van experimenteel protocol. Workflowoverzicht van de belangrijkste experimentele stappen in het protocol. Er worden verschillende punten genoteerd waar het protocol kan worden gepauzeerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

De studie van vetacylatatie heeft belangrijke implicaties in cellulaire eiwitinteracties en ziekten. Hier wordt een aangepast protocol gepresenteerd om de detectie van vet-geacyleerde eiwitten te verbeteren, die kunnen worden toegepast in verschillende celtypen en gecombineerd met andere testen, waaronder pulsachtervolging en massaspectrometrie.

Geoptimaliseerde integratie van alkynylvetzuuranalogen voor de detectie van vetacyleiwitten met behulp van Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Deze methode verbetert de afgifte van vetzuren aan cellen en beschermt ze tegen de toxische effecten van vrije vetzuurafgifte, waardoor een consistentere etikettering wordt gegarandeerd. De gevoeligheid en efficiëntie van klikchemiedetectie zijn afhankelijk van de effectieve opname van het vetzuuretiket. We hebben laten zien dat dit grotendeels kan worden verbeterd.Verschillende stappen van het protocol zijn zeer specifiek en moeten nauwlettend worden gevolgd. Een visuele demonstratie kan bijvoorbeeld verduidelijken en laten zien hoe de vorming van vaste stoffen in de etiketteringsmix kan worden voorkomen. Om de etiketteringsmedia te bereiden, vult u DMEM aan met 5% dextran / houtskool gecoat FBS, 1X penicilline streptomycine, twee millimolar L-glutamine en 100 millimolair natriumpyruvaat en verwarm het vervolgens voor tot 37 graden Celsius voor gebruik.Was de HEK-293 T-cellen die een dag eerder zijn verguld voorzichtig in een zes-well tissuekweekschaal met PBS en vervang de PBS door etiketteermedia. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende ongeveer 45 minuten voordat u overgaat tot metabole etikettering met vetzuren. Om de vetzuuranalogen te verzepen, pipetteer ten minste twee microliter van het alkynylvetzuuranaloog rechtstreeks in de bodem van een conische reactieflacon van drie milliliter.Pipetteer een gelijke hoeveelheid verdund kaliumhydroxide dicht bij de bodem van de reactieflacon aan de rand van het glas, zodat het afgegeven volume van de kaliumhydroxide zich vermengt met het vetzuur. Sluit het deksel van de injectieflacon en tik voorzichtig om de oplossingen te mengen. Verwarm de reactieflacon op 65 graden Celsius gedurende ongeveer vijf minuten of totdat de oplossing helder wordt, wat aangeeft dat het vetzuur is opgenomen.Let er wel op dat de vloeistof niet te veel verdampt. Pipetteer vervolgens voorverwarmd 20% vetzuurvrij BSA zodanig dat de volumeverhouding van vetzuren tot kaliumhydroxide tot vetzuurvrij BSA 1-1-50 is, waardoor een uiteindelijke concentratie van 20X BSA-gebonden alkynylvetzuren wordt bereikt. Meng de oplossing door op en neer te pipetteren en incubeer het vervolgens gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.Label de HEK-293 T-cellen door het 20X vetzuur BSA-conjugaat rechtstreeks in de uithongeringsmedia toe te voegen om een uiteindelijke concentratie van 1% BSA in 25 micromolaire alkynylmyristaat of 100 micromolaire alkynylpalmitaat en alkynylstearaat te bereiken. Voeg ter vergelijking niet-verzeepte vloeistoffen toe door twee microliter ongelabeld vetzuur rechtstreeks in de uithongeringsmedia te pipetteren en plaats de cellen vervolgens drie tot zes uur terug in de incubator. Nadat de incubatie is voltooid, wast u de cellen voorzichtig met PBS bij kamertemperatuur, oogst en lyseert u de cellen door 500 microliter EDTA-vrije gemodificeerde RIPA-buffer toe te voegen en de lysaten gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius te roteren.Centrifugeer de lysaten op 16.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, verzamel vervolgens het supernatant in microcentrifugebuizen van 1,7 milliliter en bewaar ze bij min 20 graden Celsius. Breng 50 tot 100 microgram eiwitlysaten in microcentrifugebuizen van 1,7 milliliter tot een gelijk volume met behulp van de EDTA-vrije gemodificeerde RIPA-buffer. Houd het reactievolume zo klein mogelijk.Voeg STS toe aan elk monster om een eindconcentratie van 1% te bereiken Bereid een hoofdmix van de klikreagentia en voeg de juiste volumes toe aan de lysaten en meng vervolgens door op en neer te pipetteren. Incubeer de lysaten in het donker gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius met af en toe mengen. Voor immunoprecipitatie, meng lysaten met konijn anti-GFP en incubateer 's nachts met rotatie bij vier graden Celsius.Voeg 15 tot 20 microliter magnetische kralen vooraf gebalanceerd met 0,1% SDS RIPA toe aan elke buis en laat deze drie uur lang end over end reageren bij vier graden Celsius. Was de kralen met lysisbuffer en resuspend in 45 microliter van 50 millimolaire HEPES-buffer met 1% SDS. Verwarm de kralen gedurende 15 minuten op 80 graden Celsius.Tijdens de incubatie keert of roert u de buizen ongeveer om de vijf minuten en draait u vervolgens kort alle buizen. Terwijl de monsters nog warm zijn, verzamel je het supernatant dat de eiwitten bevat. Combineer 43 microliter van het supernatant met zeven microliter van de klikreagentia mastermix en laat ze in het donker gedurende 30 minuten reageren bij 37 graden Celsius.Op een westerse plot werd een merkbaar effect waargenomen bij het labelen van efficiëntie voor klikchemiedetectie tussen verzeepte en niet-verzeepte alkynylvetzuren met een toenemende lengte van de acylketens. In cellen gelabeld met alkynylstearaat verhoogden verzeping van het vetzuur en toediening met BSA voor metabole etikettering de detectie van S-geacyleerd eiwitsignaal drastisch door klikchemie en detectie door een fluorescerend azitoprobe, wat een algehele toename van cellulaire opname van het alkynylvetzuuretiket suggereert. Omgekeerd werd geen merkbaar verschil waargenomen in cellen die werden behandeld met de kortste en meest oplosbare vetzuuralkynylmyristaat.Cellen gelabeld met alkynylpalmitaat vertoonden een tussentijdse toename van het label in vergelijking met alkynylmyristaat, maar minder dan alkynylstearaat. Belangrijk is dat behandeling van PVDF-membranen met 0,1 molair kaliumhydroxide grotendeels de vetzuuretiketten verwijderde van cellen geïncubeerd met alkynylpalmitaat en het alkynylstearaat, wat bevestigt dat het grootste deel van het signaal door een ester- of thioesterbinding ging. Zoals verwacht was de opname van alkynyl myristaat meestal alkaliresistent vanwege de hechting van myristaat aan eiwitten via een amidebinding.Na klikchemie werd myristoyatie van wildtype myristoylated C-terminal Huntington GFP gedetecteerd in de immunoprecipitaten, evenals de lysaten, terwijl de G2A-mutatie de myristoyatie van de C-terminale Huntington GFP volledig blokkeerde. Na klikchemie kunnen we affiniteitszuivering van vetgeacyleerde eiwitten uitvoeren voor massaspectrometrie. Dit kan een ander profiel van vetgeacyleerde eiwitten opleveren door cellen te beschermen tegen toxiciteit.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identificatie van vetzuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyse van een Ni-Schiff Base-complex onder omstandigheden geschikt voor het bewaren van zuur-labiele Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Profilering van vetzuur 13C Isotopologue geeft inzicht in de trofische Carbon overdracht en lipide metabolisme van ongewervelde consumenten

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation

Genetische opneming van levende L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) en de toepassing ervan op eiwit Woordherkomst en-opbouw

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning