Name: optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; आरजीपीआईएन-2019-04617)। लूसिया लियाओ द्वारा वित्त पोषित किया गया था राम और लेखा तुमकुर मेमोरियल छात्रवृत्ति वाटरलू विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विभाग के माध्यम से, और आईओडीई ओंटारियो के माध्यम से लुसी मॉरिसन मेमोरियल बर्सरी, वाटरलू विश्वविद्यालय से स्नातक अनुसंधान वित्त पोषण के अलावा स्नातक अनुसंधान छात्र (50503-11072), विज्ञान स्नातक पुरस्कार, और स्नातक शिक्षण सहायकता शामिल है। लेखक इस पांडुलिपि को तैयार करने में उनके समर्थन के लिए मार्टिन लैब के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं, विशेष रूप से स्टेफ़नी रयाल, हरलीन गिल और सादिया खान जिन्होंने शुरू में इन अध्ययनों की तैयारी में मार्टिन लैब स्थापित करने में मदद की। लेखकों को भी ctHTT-GFP निर्माणों और डॉ शॉन सैंडर्स पांडुलिपि तैयार करने में महत्वपूर्ण इनपुट के लिए तरह के उपहार के लिए डॉ Luc Berthiaume धन्यवाद करना चाहते हैं. चित्रा 3 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

संस्कृति में कोशिकाओं के लिए फैटी एसिड के प्रत्यक्ष जोड़ के परिणामस्वरूप अघुलनशीलता, लिपिड की वर्षा, और लिपोटॉक्सिसिटी 40 हो सकती है। नतीजतन, कोशिकाओं में सीधे फैटी एसिड जोड़ने से न केवल खराब सेलुलर अपटेक और फैटी एसिड लेबल की कम उपलब्धता हो सकती है, बल्कि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में कमी आ सकती है, साथ ही साथ ऑफ-टारगेट मार्गों की सक्रियता भी हो सकती है। हालांकि, क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने के लिए कई चयापचय लेबलिंग प्रोटोकॉल में फैटी एसिड का प्रत्यक्ष जोड़ और बड़ी संख्या में पामिटोइल-प्रोटिओम अध्ययन शामिल हैं, जो क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने का उपयोग करके शायद ही कभी फैटी एसिड लेबल को सैपोनिफाई करते हैं या उन्हें बीएसए 8,36 के साथ इनक्यूबेट करते हैं। इस तथ्य पर विचार करना महत्वपूर्ण है कि फैटी-एसाइलेटेड प्रोटीन के क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने की दक्षता और संवेदनशीलता फैटी एसिड एनालॉग्स के पर्याप्त सेलुलर अपटेक पर निर्भर करती है। इसलिए, यह अनुमान लगाना उचित है कि कोशिकाओं में खराब निगमन से फैटी एसिड लेबल की कम उपलब्धता के कारण कई एस-एसाइलेटेड प्रोटीन प्रोटिओमिक अध्ययनों में पता लगाने से बच सकते हैं, खासकर जब लंबी श्रृंखला फैटी एसिड 17-ODYA का उपयोग किया गया था। 17-ODYA, या alkynyl-stearate, इसकी वाणिज्यिक उपलब्धता और इसके शुरुआती उपयोग के कारण कई अध्ययनों के लिए पसंद का व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला लेबल रहा है8,36। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के परिणामों से पता चलता है कि 17-ODYA के सैपोनिफिकेशन के परिणामस्वरूप एस-एसाइलेटेड प्रोटीन का पता लगाने में सबसे बड़ी वृद्धि होती है, जो कि छोटी श्रृंखला फैटी एसिड जैसे कि पामिटेट या माइरिस्टेट की तुलना में होती है। इसलिए, सैपोनिफाइड लेबल के साथ इन प्रयोगों को दोहराने से एस-एसिलेशन के अतिरिक्त सब्सट्रेट प्राप्त हो सकते हैं जिन्हें पहले अनदेखा किया जा सकता है। इसके अलावा, जबकि अधिकांश palmitoyl acyltransferases S-acylation के लिए palmitate पसंद करते हैं, कुछ में फैटी एसिड की अन्य लंबाई जैसे stearate15,38,44 के लिए प्राथमिकताएं होती हैं। इसके अलावा, कुछ प्रोटीन या यहां तक कि प्रोटीन के भीतर विशिष्ट साइटें एक फैटी एसिड को दूसरे 15,45 से अधिक पसंद करती हैं। इसलिए, 17-ODYA का उपयोग करने वाले अध्ययनों में प्रोटीन एस-एसाइलेटेड के प्रति पूर्वाग्रह हो सकता है, जो कि स्टीयरेट के साथ होता है, न कि पाल्मिटेट, जबकि कम पहचान के कारण उन प्रोटीनों का भी प्रतिनिधित्व करता है।
क्लिक रसायन विज्ञान के लिए बेहतर चयापचय लेबलिंग दक्षता लिपिड के सैपोनिफिकेशन और FAFBSA चरणों के साथ इनक्यूबेशन पर निर्भर करती है, साथ ही साथ delipidated FBS भी। सभी फैटी एसिड को KOH में पूरी तरह से saponified किया जाना चाहिए जिसमें FAFBSA के साथ इनक्यूबेशन के साथ आगे बढ़ने से पहले कोई दृश्यमान ठोस शेष नहीं होना चाहिए। यह एक कठिन कदम हो सकता है और समय महत्वपूर्ण है। सैपोनिफाइड फैटी एसिड 65 डिग्री सेल्सियस पर समाधान में जाने के बाद, तुरंत गर्म बीएसए जोड़ें क्योंकि आगे हीटिंग फैटी एसिड से डीएमएसओ के वाष्पीकरण का कारण बनेगी। इसके अलावा, सैपोनिफाइड लेबल जैसे ही यह ठंडा होना शुरू होता है, फिर से ठोस होना शुरू हो जाएगा। इसलिए, FAFBSA गर्म होना चाहिए और नमक घुलनशील होने के बाद तेजी से जोड़ा जाना चाहिए। कांच की प्रतिक्रिया शीशियों, और उनके आकार इस कदम के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे सैपोनिफाइड लिपिड को घुलनशील रहने के लिए पर्याप्त गर्म होने की अनुमति देते हैं, जबकि यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त शांत होते हैं कि एफएएफबीएसए congeal नहीं करता है। लेबलिंग के लिए एक समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए इस चरण में पिपेटिंग के माध्यम से पर्याप्त मिश्रण भी महत्वपूर्ण है।
क्लिक रसायन विज्ञान के लिए अभिकर्मकों को ठीक से संग्रहीत करने की आवश्यकता होती है, आमतौर पर desiccants के साथ या N2 या Ar गैस के तहत -20 °C से -80 °C पर। एसाइलेशन सिग्नल या कमजोर सिग्नल की कमी अस्थिर अभिकर्मकों, विशेष रूप से पुराने टीबीटीए और एज़ाइड स्टॉक समाधानों के कारण हो सकती है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट एजाइड स्टॉक समाधानों के साथ देखभाल की जानी चाहिए, जिसे जितना संभव हो उतना प्रकाश से संरक्षित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, लिपिड अभाव की विधि और लेबलिंग समय जैसे चर को उपयोग किए जाने वाले सेल के प्रकार के आधार पर इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने के लिए परीक्षण करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, न्यूरोनल कोशिकाओं को लंबे समय तक लेबलिंग समय की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि मीडिया परिवर्तन और लिपिड अभाव मुश्किल (अप्रकाशित) हैं।
इस प्रोटोकॉल का लाभ सबसे नाटकीय है जब लंबी श्रृंखला फैटी एसिड के लिए उपयोग किया जाता है। छोटी श्रृंखलाओं के लिए, सिग्नल तीव्रता में वृद्धि कम नाटकीय हो जाती है, लेकिन अभी भी कोशिकाओं के लिए सुरक्षात्मक होने की संभावना है। जबकि सुझाए गए संशोधन सामान्य रूप से प्रोटीन एसाइलेशन का पता लगाने में सुधार करेंगे, क्लिक रसायन विज्ञान को अभी भी एक लिपिड-केंद्रित विधि माना जाता है1 जो गतिशील रूप से पता लगाने तक सीमित है, न कि विशेष रूप से एस-एसाइलेटेड प्रोटीन 1। विचार करने के लिए अन्य सीमाओं में लेबलिंग को बढ़ावा देने के लिए फैटी एसिड अभाव की आवश्यकता शामिल है, और एसाइल-बायोटिन एक्सचेंज (एबीई) की तुलना में संगत सेल प्रकारों की अपेक्षाकृत सीमित सीमा एसाइल-एसाइलेशन 16 का पता लगाना। इन सीमाओं के बावजूद, क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने सबसे एसाइल-एक्सचेंज assays की तुलना में तेज है और प्रोटीन का पता लगाने के लिए बेहतर अनुकूल है जो एसाइल-एक्सचेंज एसेस के लिए आवश्यक दोहराए गए प्रोटीन वर्षा चरणों को सहन नहीं करते हैं। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को पल्स-चेस विश्लेषण 38 जैसे अन्य क्लिक assays का उपयोग करके एक साथ लेबलिंग के साथ जोड़ा जा सकता है।
क्लिक रसायन विज्ञान के लिए चयापचय लेबलिंग के लिए इस संशोधन के उपयोग ने एसाइलेटेड प्रोटीन, विशेष रूप से एस-एसाइलेटेड के समग्र पता लगाने में वृद्धि की, जिसमें विभिन्न प्रकार की प्रोटिओमिक तकनीकें हैं जो क्लिक रसायन विज्ञान के साथ संयोजन के रूप में उपयोग की जाती हैं। जैसा कि दिखाया गया है, फ्लोरोजेनिक डिटेक्शन का उपयोग बायोटिन के विकल्प के रूप में किया जा सकता है (चित्र1)28। यह विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि सेल लिसेट में कोई अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन नहीं है। इसके अलावा, फ्लोरोफोरस जो केवल क्लिक रसायन विज्ञान के बाद सक्रिय होते हैं, उनका उपयोग किया जा सकता है46। क्लिक रसायन विज्ञान लेबलिंग के लिए saponified और FAFBSA-बाउंड फैटी एसिड सेल में उपलब्ध लेबल की मात्रा में समग्र वृद्धि के कारण ब्याज के प्रोटीन का पता लगाने में कठिनाइयों के साथ मदद कर सकता है और सीधे मीडिया में फैटी एसिड जोड़ने के विषाक्त प्रभावों को सीमित करके। इसका उपयोग कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री 27 के साथ संयोजन के रूप में भी किया जा सकता है, खासकर जब मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम का उपयोग करके हाल ही में हुई प्रगति के साथ लिया जाता है, जो कम बहुतायत प्रोटीन के प्रति संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए अनावश्यक माप को रोकता है, जैसा कि मौजूदा डेटा-निर्भर अधिग्रहण के विपरीत है जो सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का पता लगाने का पक्ष लेता है47 . इसके अलावा, क्लिक रसायन विज्ञान को सेल संस्कृति (एसआईएलएसी) में अमीनो एसिड के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के साथ जोड़ा जा सकता है और गतिशील प्रोटीन एस-एसाइलेशन 27 पर मात्रात्मक डेटा का उत्पादन करने के लिए पल्स-चेस विधियों को जोड़ा जा सकता है। अंत में, Hannoush समूह निकटता बंधाव परख (पीएलए) के साथ क्लिक रसायन विज्ञान संयुक्त करने के लिए एकल सेल विज़ुअलाइज़ेशन और palmitoylated प्रोटीन के उपकोशिकीय वितरण में परीक्षाओं की अनुमति देने के लिए43,48.

फैटी एसाइलेशन में प्रोटीन के लिए फैटी एसिड के सहसंयोजक जोड़ शामिल हैं और प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन को बढ़ावा देने में इसके महत्व के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है, लेकिन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, संरचनात्मक परिवर्तनों को बढ़ावा देने और एंजाइमों के उत्प्रेरक साइटों को विनियमित करने के लिए भी दिखाया गया है1,2,3,4,5,6,7 . फैटी एसाइलेशन संक्रमण, कैंसर, सूजन और न्यूरोडीजेनेरेशन सहित असंख्य बीमारियों में एक संभावित दवा लक्ष्य के रूप में उभरा है, जहां पामिटोइलेशन में व्यवधानों को 8,9,10,11,12,13 प्रलेखित किया गया है। यह मुख्य रूप से नए रासायनिक पहचान विधियों के विकास से प्रेरित है, जिसने एस-एसाइलेटेड प्रोटीन लक्ष्यों की बड़े पैमाने पर पहचान को सक्षम किया।
फैटी एसाइलेशन में संतृप्त और असंतृप्त फैटी एसिड के सहसंयोजक जोड़ को शामिल करने वाले विभिन्न संशोधन शामिल हो सकते हैं, लेकिन आमतौर पर एन-मायरिस्टोलेशन और एस-एसाइलेशन को संदर्भित करता है। एन-मायरिस्टोलेशन एन-टर्मिनल ग्लाइसिन में मायरिस्टिक एसिड के अलावा को संदर्भित करता है या तो नवजात पॉलीपेप्टाइड्स पर सह-अनुवाद रूप से या प्रोटियोलिटिक दरार 2,14 के बाद नए उजागर एन-टर्मिनल ग्लाइसिन पर पोस्ट-ट्रांसलेशनली। एन-myristoylation एक अपरिवर्तनीय एमाइड बंधन के माध्यम से होता है। दूसरी ओर, एस-एसिलेशन आमतौर पर एक थायोएस्टर बॉन्ड के माध्यम से सिस्टीन अवशेषों के लिए लंबी श्रृंखला फैटी एसिड के प्रतिवर्ती जोड़ को संदर्भित करता है। इस संशोधन के सबसे आम रूप में पाल्मिटेट का समावेश शामिल है और इसलिए, आमतौर पर एस-पाल्मिटोइलेशन के रूप में जाना जाता है, या बस पाल्मिटोइलेशन 11,15। कई मायनों में, एस-पामिटोइलेशन फॉस्फोराइलेशन के समान है। यह गतिशील, एंजाइमेटिक रूप से विनियमित है, और अत्यधिक असभ्य साबित हो रहा है।
पिछले दशक तक, फैटी एसाइलेशन का अध्ययन सीमित पहचान विधियों द्वारा बाधित किया गया था, जिसके लिए रेडियोधर्मी रूप से लेबल किए गए फैटी एसिड की आवश्यकता थी। इसके कई नुकसान थे, जिनमें लागत, सुरक्षा के मुद्दे और बहुत लंबे समय तक पता लगाने का समय शामिल था। आमतौर पर, S-acylation16 का पता लगाने के लिए या तो tritiated या iodinated palmitate का उपयोग किया गया था। Tritiated palmitate autoradiography फिल्म है, जो हफ्तों से महीनों तक ले जा सकते हैं के साथ लंबी पहचान अवधि की आवश्यकता है. जबकि [125I] आयोडो-फैटी एसिड एनालॉग्स ने पहचान के समय को कम कर दिया, इसने बहुत अधिक सुरक्षा जोखिम प्रस्तुत किया और प्रयोगकर्ताओं की करीबी थायराइड निगरानी की आवश्यकता थी। इसके अलावा, ये विधियां गैर-मात्रात्मक थीं, इसलिए, गतिशील पामिटोइलेशन को मापने की क्षमता को सीमित करती हैं, और अतिरिक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और रेडियोधर्मी निगरानी के कारण सेट-अप और सफाई के लिए समय लेती हैं। अंत में, रेडियोधर्मी लेबल प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं थे और आमतौर पर ब्याज के विशिष्ट प्रोटीन के कम थ्रूपुट का पता लगाने तक सीमित थे। जैसा कि अधिक सब्सट्रेट का पता लगाया गया था और, अनिवार्य रूप से प्रत्येक संशोधन की मध्यस्थता करने वाले एंजाइमों की पहचान की गई थी, यह स्पष्ट था कि नए पहचान विधियों की आवश्यकता थी17,18,19,20,21। लगभग एक साथ, फैटी एसिलेटेड प्रोटीन का पता लगाने के लिए कई नए तरीके उत्पन्न हुए। पहला एस-एसाइलेशन के थायोएस्टर बॉन्ड की उत्क्रमण और प्रतिक्रियाशीलता का शोषण करता है। एसाइल-बायोटिन एक्सचेंज (एबीई) परख रासायनिक रूप से एस-एसाइलेटेड प्रोटीन के बाद के पुलडाउन के लिए बायोटिन के साथ पाल्मिटेट को प्रतिस्थापित करता है, जो एविडिन एगारोज़ मोतियों का उपयोग करता है और पश्चिमी धब्बा 22,23,24 द्वारा प्रत्यक्ष पता लगाता है। इसके बाद, फैटी एसिड के जैव-ओर्थोगोनल लेबलिंग और टैग या हैंडल के लिए chemoselective इसके अलावा विकसित किए गए थे जिसमें स्टॉडिंगर बंधाव का उपयोग शामिल था और रसायन विज्ञान 25,26,27,28,29,30,31,32,33 पर क्लिक करें . अंत में, एबीई के समान, एसाइल-राल असिस्टेड कैप्चर (आरएसी) अनिवार्य रूप से एस-एसाइलेटेड प्रोटीन 34,35 को कैप्चर करने और पता लगाने के लिए थिओल-प्रतिक्रियाशील मोतियों के साथ एस-एसाइलेटेड साइटों को बदल देता है। साथ में, विनिमय और क्लिक-रसायन विज्ञान-आधारित assays ने डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एसाइलेशन का पता लगाने और आत्मीयता शुद्धिकरण के अधिक कुशल और संवेदनशील तरीके प्रदान किए हैं और बाद में हजारों एस-एसाइलेटेड प्रोटीन 8,36 की खोज के लिए नेतृत्व किया है।
क्लिक रसायन विज्ञान शब्द में रासायनिक प्रतिक्रियाओं का एक समूह शामिल है, लेकिन आमतौर पर Cu (I) को संदर्भित करता है - उत्प्रेरित azido-alkyne [3 + 2] एक एल्काइनिल समूह और एक azido समूह 27,28,37 के बीच cycloaddition प्रतिक्रिया तंत्र। विशेष रूप से, फैटी एसाइलेशन के मामले में, क्लिक रसायन विज्ञान में जैव-ओर्थोगोनल 16-कार्बन एल्काइनिल-पाल्मिटेट (15-हेक्साडेसिनोइक एसिड; 15-एचडीवाईए) या 14-कार्बन एल्काइनिल-मायरिस्टेट (13-टेट्राडेसिनोइक एसिड; 13-टीडीवाईए) को शामिल करके क्रमशः एस-पाल्मिटोइलेशन या एन-मायरिस्टिलेशन का पता लगाना शामिल है, जो अंतर्जात रूप से एसाइलेटेड प्रोटीन को लेबल करने के लिए कोशिकाओं में शामिल है28 . सेल lysis और ब्याज के प्रोटीन के immunoprecipitation के बाद, एक क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया (एक alkyne और एक azide के बीच सहसंयोजक लिंकेज) एक आत्मीयता जांच, आमतौर पर biotin, पश्चिमी धब्बा 28,37 द्वारा पता लगाने के लिए बांधने के लिए किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, क्लिक रसायन विज्ञान कुल सेल lysate पर प्रदर्शन किया जा सकता है और फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचान के लिए आत्मीयता शुद्ध किया जा सकता है। Azido-biotin के साथ प्रारंभिक क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया रेडियोधर्मिता 2 की तुलना में एक लाख से अधिक बार पता लगाने की चयनात्मकता और संवेदनशीलता में वृद्धि हुई। क्लिक रसायन विज्ञान का एक और लाभ यह है कि इसे अन्य शास्त्रीय लेबलिंग विधियों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे कि मात्रात्मक विश्लेषण 38 के लिए एज़िडो-होमोएलनिन का उपयोग करके प्रोटीन टर्नओवर का पल्स-चेस विश्लेषण। इसके अलावा, प्रोटीन स्थानीयकरण 16,28,39 की जांच करने के लिए बायोटिन या अन्य जैव रासायनिक जांच, जैसे कि फ्लैग या माइक टैग के बजाय फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग किया जा सकता है।
क्लिक रसायन विज्ञान के उपयोग की सापेक्ष आसानी के बावजूद, सेल कल्चर 40 में लंबी श्रृंखला मुक्त फैटी एसिड का उपयोग करने की कम घुलनशीलता और संभावित विषाक्तता द्वारा पहचान को सीमित किया जा सकता है। विशेष रूप से, अधिकांश प्रोटीन के लिए एस-एसाइलेशन के दौरान पामिटेट की वरीयता के बावजूद, कई अध्ययनों ने अपनी वाणिज्यिक उपलब्धता और अपेक्षाकृत कम लागत के कारण एस-एसाइलेटेड प्रोटीन का पता लगाने के लिए पामिटेट (15-एचडीवाईए) के बजाय 18-कार्बन स्टीरेट (17-ऑक्टाडेसिनोइक एसिड - 17-ओडीवाईए) का उपयोग किया है। हालांकि, 17-ODYA बहुत अघुलनशील है और उपयोग किए जाने पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, क्लिक करें रसायन विज्ञान कुछ सूक्ष्म तैयारी और रसायनों के भंडारण की आवश्यकता हो सकती है। इसमें, प्रोटोकॉल एक लेबलिंग दृष्टिकोण का वर्णन करता है, जो फैटी एसिड के सैपोनिफिकेशन का उपयोग करके डिलीवरी को अनुकूलित करता है, फैटी-एसिड मुक्त बीएसए के साथ प्रसव, और घुलनशीलता बढ़ाने और कोशिकाओं में मुक्त फैटी एसिड जोड़ने के संभावित विषाक्त प्रभावों को बाईपास करने के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को डिलिपिडेट किया जाता है। यह विधि विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में काम करती है और यहां तक कि जीवित जानवरों में भी उपयोग की गई है28।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>90270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide/bis solution 29:1</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFDye 647 azide plus</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-tris, ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 16,000xg, 4&#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imager</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (1 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid sodium salt monohydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent compatible (DC) assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0231-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>319015CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219989950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blot Turbo Semi-dry transfer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Incubator at 37&#176;C and 5% CO2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement solution</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myristic Acid (25 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M0476-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid (100 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 10x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>450201EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A (synthetic)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-085-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-184-G005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75801-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified)</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal antibody to GFP</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>600-110-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)</td>
			<td>Soltec Ventures</td>
			<td>M115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-043-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Reagent Grade 1L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHEATON NextGen V Vials 3 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry

फैटी एसाइलेशन, प्रोटीन सब्सट्रेट के लिए संतृप्त फैटी एसिड के सहसंयोजक जोड़, कैंसर और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में इसके निहितार्थ के अलावा सेलुलर कार्यों के असंख्य को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है। फैटी एसाइलेशन डिटेक्शन विधियों में हाल के विकास ने फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन के कुशल और गैर-खतरनाक पता लगाने को सक्षम किया है, विशेष रूप से जैव-ऑर्थोगोनल लेबलिंग के साथ क्लिक रसायन विज्ञान के उपयोग के माध्यम से। हालांकि, क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने को सेल संस्कृति में लंबी श्रृंखला फैटी एसिड जोड़ने के खराब घुलनशीलता और संभावित विषाक्त प्रभावों द्वारा सीमित किया जा सकता है। यहां वर्णित फैटी-एसिड मुक्त बीएसए के साथ संयोजन में सैपोनिफाइड फैटी एसिड का उपयोग करके अनुकूलित वितरण के साथ एक लेबलिंग दृष्टिकोण है, साथ ही साथ डिलिपिडेड मीडिया भी है, जो फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन का पता लगाने के लिए कठिन का पता लगाने में सुधार कर सकता है। यह प्रभाव एल्काइनिल-स्टीयरेट एनालॉग, 17-ODYA के साथ सबसे अधिक स्पष्ट था, जो एसाइलेटेड प्रोटीन के क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला फैटी एसिड एनालॉग रहा है। यह संशोधन सेलुलर निगमन में सुधार करेगा और एसाइलेटेड प्रोटीन का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि करेगा। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में लागू किया जा सकता है और अन्य assays जैसे पल्स-चेस विश्लेषण, सेल संस्कृति में अमीनो एसिड के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग, और फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन की मात्रात्मक प्रोफाइलिंग के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त किया जा सकता है।

क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने के लिए saponified और गैर saponified (गैर sap) alkynyl फैटी एसिड के बीच लेबलिंग दक्षता में अंतर की कल्पना की जा सकती है और पश्चिमी धब्बा के माध्यम से फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन की संकेत तीव्रता द्वारा तुलना की जा सकती है (चित्रा 1)। एसाइल श्रृंखलाओं की बढ़ती लंबाई के साथ एक ध्यान देने योग्य प्रभाव देखा गया था। एल्काइनिल-स्टीयरेट (एल्क-स्टीयर) के साथ लेबल की गई कोशिकाओं में, फैटी एसिड के सैपोनिफिकेशन और चयापचय लेबलिंग के लिए बीएसए के साथ वितरण ने क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से एस-एसाइलेटेड प्रोटीन सिग्नल का पता लगाने और फ्लोरोसेंट एज़िडो जांच (चित्रा 1, दाएं) द्वारा पता लगाने में काफी वृद्धि की, जो अल्काइनिल फैटी एसिड लेबल के सेलुलर निगमन में समग्र वृद्धि का सुझाव देता है। इसके विपरीत, सबसे कम और सबसे घुलनशील फैटी एसिड, एल्काइनिल-मायरिस्टेट (अल्क-मायर; 13-टेट्राडेसिनोइक एसिड या 13-टीडीवाईए) के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं में कोई ध्यान देने योग्य अंतर नहीं देखा गया था। एल्काइनिल-पाल्मिटेट (चित्रा 1, मध्य) के साथ लेबल की गई कोशिकाओं ने एल्काइनिल-माइरिस्टेट (13-टीडीवाईए) की तुलना में लेबल में एक मध्यवर्ती वृद्धि दिखाई, लेकिन अल्काइनिल-स्टीयरेट से कम।
महत्वपूर्ण रूप से, 0.1 M KOH के साथ PVDF झिल्ली के उपचार ने काफी हद तक एल्काइनिल-पाल्मिटेट और एल्काइनिल-स्टीयरेट के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं से फैटी एसिड लेबल को हटा दिया, यह पुष्टि करते हुए कि अधिकांश सिग्नल एक एस्टर या थायोएस्टर बॉन्ड (चित्रा 1, मध्य और दाएं, नीचे पैनलों) के माध्यम से था। जैसा कि अपेक्षित था, अल्काइनिल-मिरिस्टेट का निगमन ज्यादातर क्षार-प्रतिरोधी था (चित्रा 1, बाएं, नीचे पैनल), एक एमाइड बॉन्ड के माध्यम से प्रोटीन के लिए myristate के लगाव के कारण।
चित्रा 2 बहुमुखी प्रतिभा और क्लिक रसायन विज्ञान की संवेदनशीलता को दर्शाता है immunoprecipitated प्रोटीन के फैटी acylation का पता लगाने के लिए. HEK293T कोशिकाओं को myristoylated C-terminal huntingtin (HTT) के साथ संक्रमित किया गया था, जो GFP (myr-ctHTT-GFP) से जुड़ा हुआ था और अल्काइनाइल-myristate के साथ लेबल किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित किया गया था18। immunoprecipitation के बाद, ctHTT-GFP मोतियों से जारी किया गया था और lysates के साथ रसायन विज्ञान पर क्लिक करने के अधीन था। न केवल वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटी) मायर-सीटीएचटीटी-जीएफपी के मायरिस्टोइलेशन को इम्यूनोप्रिसिपिटेट्स में पाया गया था, बल्कि यह लिसेट में दृढ़ता से पाया गया था, जबकि जी 2 ए उत्परिवर्तन ने पूरी तरह से सीटीएचटीटी-जीएफपी (चित्रा 2) के मायरिस्टोइलेशन को अवरुद्ध कर दिया था।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> चित्रा 1: क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग कर फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन का पता लगाना। HEK293T कोशिकाओं को संकेतित फैटी एसिड के साथ सीधे (गैर-सैप) या सैपोनिफिकेशन (सैप) के बाद इनक्यूबेट किया गया था और वाहक प्रोटीन बीएसए के साथ इनक्यूबेशन किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल 2.1-2.7 में वर्णित है। अल्काइनिल-फैटी एसिड को रसायन विज्ञान पर क्लिक करने के लिए प्रोटीन लिसेट के 100 μg के अधीन करके फ्लोरोसेंट एज़ाइड से जोड़ा गया था, जिसे एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया था, और पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया था। 0.1 M Tris pH 7.0 या 0.1 M KOH के साथ उपचार के बाद, थायोएस्टर बांड को रिवर्स करने के लिए, फैटी एसाइलेशन को फ्लोरोसेंट एज़ाइड का उपयोग करके पाया गया था। GAPDH का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था; विरोधी GAPDH rhodamine (1: 5,000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> चित्रा 2: क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग कर N-myristoylated ctHTT-GFP का पता लगाना। HEK293T कोशिकाओं को C-terminally छोटा (ct) और HTT (myr-ctHTT-GFP) के myristoylatable रूप के साथ संक्रमित किया गया था और alkynyl-myristate के साथ लेबल किया गया था। एक अलैनिन के साथ प्रतिस्थापित आवश्यक ग्लाइसिन के साथ एक गैर-myristoylatable रूप शामिल किया गया था (G2A)। कटाई और लाइसिस के बाद, सीटीएचटी-जीएफपी को बकरी एंटी-जीएफपी का उपयोग करके इम्यूनोप्रिसिपिटेट किया गया था। Lysates क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया (बाएं) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मोतियों से रिहाई के बाद immunoprecipitates के अधीन थे. स्ट्रेप्टाविडिन एलेक्सा 680 (SA680) का उपयोग करके Myristoylation का पता लगाया गया था। जीएफपी को एंटी-खरगोश एलेक्सा 488 के साथ संयोजन में खरगोश विरोधी जीएफपी का उपयोग करके पाया गया था। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> चित्र 3: प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की वर्कफ़्लो योजना. प्रोटोकॉल में मुख्य प्रयोगात्मक चरणों की वर्कफ़्लो बाह्यरेखा. कई बिंदुओं को नोट किया जाता है जहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

फैटी एसाइलेशन के अध्ययन में सेलुलर प्रोटीन इंटरैक्शन और बीमारियों में महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। यहां प्रस्तुत एक संशोधित प्रोटोकॉल फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन के क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने में सुधार करने के लिए है, जिसे विभिन्न सेल प्रकारों में लागू किया जा सकता है और पल्स-चेस और मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित अन्य assays के साथ संयुक्त किया जा सकता है।

फैटी Acylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए Alkynyl फैटी एसिड Analogs के अनुकूलित निगमन क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग कर

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

यह विधि कोशिकाओं को फैटी एसिड के वितरण में सुधार करती है और उन्हें मुक्त फैटी एसिड वितरण के विषाक्त प्रभावों से बचाती है, इस प्रकार अधिक सुसंगत लेबलिंग सुनिश्चित करती है। क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने की संवेदनशीलता और दक्षता फैटी एसिड लेबल के प्रभावी उत्थान पर निर्भर करती है। हमने दिखाया है कि इसमें काफी हद तक सुधार किया जा सकता है।प्रोटोकॉल के कई चरण बहुत विशिष्ट हैं और इसका बारीकी से पालन करने की आवश्यकता है। एक दृश्य प्रदर्शन स्पष्ट कर सकता है और दिखा सकता है, उदाहरण के लिए, लेबलिंग मिश्रण में ठोस पदार्थों के गठन से कैसे बचें। लेबलिंग मीडिया तैयार करने के लिए, 5% डेक्सट्रान / चारकोल लेपित एफबीएस, 1एक्स पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, दो मिलीमोलर एल-ग्लूटामाइन और 100 मिलीमोलर सोडियम पाइरूवेट के साथ डीएमईएम को पूरक करें, फिर उपयोग से पहले इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म करें।धीरे से एचईके -293 टी-कोशिकाओं को पीबीएस के साथ छह-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति पकवान में एक दिन पहले मढ़वाया गया धोएं, फिर पीबीएस को लेबलिंग मीडिया के साथ बदलें। फैटी एसिड के साथ चयापचय लेबलिंग के लिए आगे बढ़ने से पहले लगभग 45 मिनट के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फैटी एसिड एनालॉग्स को सैपोनिफाई करने के लिए, पिपेट ने कम से कम दो माइक्रोलीटर अल्काइनिल फैटी एसिड एनालॉग के सीधे तीन मिलीलीटर शंक्वाकार प्रतिक्रिया शीशी के तल में।पिपेट कांच के किनारे पर प्रतिक्रिया शीशी के नीचे के करीब पतला पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड की एक समान मात्रा में होता है जैसे कि पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड की वितरित मात्रा फैटी एसिड के साथ मिश्रित होती है। शीशी के ढक्कन को बंद करें और समाधानों को मिलाने के लिए धीरे से टैप करें। प्रतिक्रिया शीशी को लगभग पांच मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें या जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए, यह दर्शाता है कि फैटी एसिड को शामिल किया गया है।हालांकि, ध्यान रखें कि तरल बहुत अधिक वाष्पित न हो। इसके बाद, पिपेट ने 20% फैटी एसिड-मुक्त बीएसए को पहले से गर्म कर दिया, जैसे कि फैटी एसिड से पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड से फैटी एसिड-मुक्त बीएसए के लिए फैटी एसिड की मात्रा का अनुपात 1-1-50 है, जो 20X बीएसए-बाउंड एल्काइनिल फैटी एसिड की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करता है। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा समाधान मिश्रण, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए incubate.25 माइक्रोमोलर अल्काइनिल myristate या 100 माइक्रोमोलर alkynyl palmitate और alkynyl stearate में 1% BSA की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए भुखमरी मीडिया में सीधे 20X फैटी एसिड बीएसए संयुग्मन को जोड़कर HEK-293 T-कोशिकाओं को लेबल करें। तुलना के लिए, भुखमरी मीडिया में सीधे बिना लेबल वाले फैटी एसिड के दो माइक्रोलीटर को पिपेट करके गैर-सैपोनिफाइड तरल पदार्थ जोड़ें, फिर कोशिकाओं को तीन से छह घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें। इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, धीरे से कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, फिर 500 माइक्रोलीटर ईडीटीए-मुक्त संशोधित आरआईपीए बफर जोड़कर कोशिकाओं को काटें और लाइस करें और चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए लिसेट को घुमाएं।चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16, 000 बार जी पर लिसेट को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर 1.7 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में सुपरनाटेंट एकत्र करें और उन्हें माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। EDTA-मुक्त संशोधित RIPA बफर का उपयोग कर एक समान मात्रा में 1.7 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में प्रोटीन लिसेट के 50 से 100 माइक्रोग्राम लाओ। प्रतिक्रिया की मात्रा को जितना संभव हो उतना छोटा रखें।1% की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने में एसटीएस जोड़ें क्लिक अभिकर्मकों का एक मास्टर मिश्रण तैयार करें और लिसेट में उपयुक्त वॉल्यूम जोड़ें, फिर ऊपर और नीचे पिपेट करके मिश्रण करें। कभी-कभी मिश्रण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए अंधेरे में लिसेट को इनक्यूबेट करें। immunoprecipitation के लिए, खरगोश विरोधी GFP के साथ lysates मिश्रण और चार डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ रात भर ऊष्मायन।प्रत्येक ट्यूब में 0.1% SDS RIPA के साथ पूर्व-संतुलित चुंबकीय मोतियों के 15 से 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे तीन घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अंत में प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें। लाइसिस बफर के साथ मोतियों को धोएं और 1% एसडीएस युक्त 50 मिलीमोलर HEPES बफर के 45 माइक्रोलीटर में पुन: निलंबित करें। मोतियों को 80 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए गर्म करें।इनक्यूबेशन के दौरान, लगभग हर पांच मिनट में ट्यूबों को उलटें या उत्तेजित करें, फिर संक्षेप में सभी ट्यूबों को स्पिन करें। जबकि नमूने अभी भी गर्म हैं, प्रोटीन युक्त supernatant इकट्ठा। क्लिक अभिकर्मक मास्टर मिश्रण के सात माइक्रोलीटर के साथ supernatant के 43 microliters गठबंधन और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देते हैं।एक पश्चिमी भूखंड पर, एसाइल श्रृंखलाओं की बढ़ती लंबाई के साथ सैपोनिफाइड और गैर-सैपोनिफाइड अल्काइनिल फैटी एसिड के बीच क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने के लिए लेबलिंग दक्षता में एक ध्यान देने योग्य प्रभाव देखा गया था। एल्काइनिल स्टीरेट के साथ लेबल की गई कोशिकाओं में, फैटी एसिड के सैपोनिफिकेशन और चयापचय लेबलिंग के लिए बीएसए के साथ डिलीवरी ने क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से एस-एसाइलेटेड प्रोटीन सिग्नल का पता लगाने और फ्लोरोसेंट एज़िटोप्रोब द्वारा पता लगाने में काफी वृद्धि की, जो एल्काइनिल फैटी एसिड लेबल के सेलुलर निगमन में समग्र वृद्धि का सुझाव देता है। इसके विपरीत, सबसे कम और सबसे घुलनशील फैटी एसिड अल्काइनिल मिरिस्टेट के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं में कोई ध्यान देने योग्य अंतर नहीं देखा गया था।एल्काइनिल पाल्मिटेट के साथ लेबल की गई कोशिकाओं ने अल्काइनिल मिरिस्टेट की तुलना में लेबल में एक मध्यवर्ती वृद्धि दिखाई, लेकिन अल्काइनिल स्टीरेट से कम। महत्वपूर्ण रूप से, 0.1 दाढ़ पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड के साथ पीवीडीएफ झिल्ली के उपचार ने काफी हद तक एल्काइनिल पाल्मिटेट और एल्काइनिल स्टीरेट के साथ ऊष्मायन कोशिकाओं से फैटी एसिड लेबल को हटा दिया, यह पुष्टि करते हुए कि अधिकांश सिग्नल एस्टर या थायोएस्टर बॉन्ड के माध्यम से था। जैसा कि अपेक्षित था, अल्काइनिल मिरिस्टेट का निगमन ज्यादातर एक एमाइड बॉन्ड के माध्यम से प्रोटीन के लिए myristate के लगाव के कारण क्षार प्रतिरोधी था।क्लिक रसायन विज्ञान के बाद, जंगली प्रकार के myristoylated सी-टर्मिनल हंटिंगटन GFP के myristoylation immunoprecipitates, साथ ही lysates में पाया गया था, जबकि G2A उत्परिवर्तन पूरी तरह से सी टर्मिनल हंटिंगटन GFP के myristoylation अवरुद्ध. क्लिक रसायन विज्ञान के बाद, हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन की आत्मीयता शुद्धिकरण कर सकते हैं। यह विषाक्तता से कोशिकाओं की रक्षा करके फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन का एक अलग प्रोफ़ाइल उत्पन्न कर सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

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Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

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Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर