Name: optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00
Duration: 7 min 27 s
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この研究は、National Science and Engineering Research Council(NSERC;RGPIN-2019-04617)。Lucia Liaoは、ウォータールー大学の生物学部を通じたラム・トゥムクル記念奨学金と、オンタリオ州インド洋ダイポール大学を通じたルーシー・モリソン記念奨学金に加えて、大学院研究学生(50503-11072)、科学大学院賞、大学院教育助手で構成されるウォータールー大学からの大学院研究資金によって資金提供されました。著者らは、この原稿の作成を支援してくれたマーティン研究所のすべてのメンバー、特にこれらの研究の準備のためにマーティン研究所を最初に設立するのを手伝ったステファニー・ライアル、ハーリーン・ギル、サディア・カーンに感謝したいと思います。著者らはまた、ctHTT-GFPコンストラクトの親切な贈り物をしてくれたLuc Berthiaume博士と、原稿の準備に重要なインプットをくれたShaun Sanders博士に感謝したいと思います。図 3 は、BioRender.com で作成したものです。

1. 細胞培養
<ol><li>細胞培養用のDMEM(ダルベッコの改変イーグル培地)を補うには、10%ウシ胎児血清(FBS)、1xペニシリン-ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、および100mMピルビン酸ナトリウム(1%体積/体積)を加える。</li>
	<li>6ウェル組織培養皿の約5 x 105 HEK293T細胞/ウェルをプレートし、5%CO2を含む37°C加湿インキュベーター内で18時間増殖させ、75%〜80%のコンフルエントに達する。</li>
	<li>脂肪酸血清欠乏<ol>
<li>ラベリングメディアを準備するには、上記のようにDMEMを10%FBSなしで準備します(ステップ1.1)。FBS を 5% デキストラン木炭コーティング FBS (DCC-FBS) に置き換えます。使用前に37°Cに予め加温してください。</li>
		<li>室温で細胞を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で穏やかに洗浄し、標識培地と交換する。 注:HEK293T細胞は組織培養プレートから容易に剥離する。細胞を洗浄し、培地を交換するときは注意してください。インキュベーターへの移送中およびインキュベーターからの移動中の攪拌を可能な限り最小限に抑えます。</li>
		<li>細胞を5%CO2 で37°Cのインキュベーターに戻し、脂肪酸による代謝標識を進める前に、約45分間(最低15分が有効)、最大60分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 脂肪酸類似体の調製およびケン化
<ol><li>DMSOで可溶化してアルキニル脂肪酸の原液を予め調製し、以下の濃度を達成し、-20°Cで保存する。 必要に応じて室温で解凍する。最高のパフォーマンスを得るための準備をN2 またはArの下に保管してください。 アルキニルミリスチン酸(13-テトラデシン酸、13-TDYA):25mM アルキニルパルミチン酸(15-ヘキサデシン酸;15-HDYA):100mM アルキニルステアリン酸塩(17-オクタデシン酸;17-ODYA):100mM
</li>
	<li>20%脂肪酸遊離BSA(FAFBSA)を調製するために、50mL使い捨てチューブに2gのFAFBSAを秤量する。<ol>
<li>予め加温した(37°C)DMEMで10mLまで持たせる。</li>
		<li>エンドオーバーエンド回転またはボルテックスによって混合し、37°Cのウォーターバスに入れてFAFBSAを完全に溶解させる。</li>
		<li>0.2 μm フィルターを使用して、培地をろ過滅菌します。</li>
		<li>約1mL容量のアリコートし、-20°Cで保存する。 必要に応じて解凍し、使用前にウォーターバスで37°Cに温めてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脂肪酸および脂肪酸類似体の溶解度を高めるために、3mLガラス円錐形反応バイアル中で20%モル過剰の水酸化カリウム(KOH)と共にインキュベートすることによってケン化を行う。 注:これらのバイアルは、FAFBSAが高熱から固まらないようにしながら、塩を可溶性に保つことを可能にします。ガラスの使用はまた、脂肪酸がプラスチックに付着するのを防ぎます。<ol>
<li>少なくとも2 μLのアルキニル脂肪酸類似体を3 mL円錐形反応バイアルの底に直接ピペットで取り出します。使用した6ウェルプレートの1ウェルあたり2μLの脂質を調製する( 表1参照)。 注:脂肪酸の疎水性のため、反応バイアルに分注する前に、所望の体積を数回引き上げてピペットの先端をコーティングするのが最善です。</li>
		<li>1 M KOHをアルキニル脂肪酸標識の20%モル過剰に等しい濃度(13-TDYAの場合は30 mM、15-HDYAおよび17-ODYAの場合は120 mM)に希釈する。</li>
		<li>等量の希釈されたKOH(1 μL:1 μL脂肪酸:KOH)をガラスの端の反応バイアルの底の近くに出して、KOHの分注された体積が脂肪酸と混合するようにする。</li>
		<li>バイアルの蓋を閉じ、静かにタップして溶液を混合します。 注:混合物は、特に脂肪酸の炭化水素鎖の長さが長くなるにつれて、迅速に固化する可能性がある。固体をピペッティングしないように注意してください(すなわち、ピペッティングによって混合しないでください)。</li>
		<li>反応バイアルを65°Cで約5分間、または脂肪酸が取り込まれたらすぐに加熱する(溶液が透明になる)。 注:ステアリン酸塩(17-ODYA)などの炭素数が高く、溶解度が低下している脂肪酸は、65°CでKOHに完全に取り込まれるためにより長いインキュベーション時間を必要とする場合があります。 必要に応じて70°Cまで温度を上げます。水風呂が一番です。液体が蒸発しすぎないように注意してください。</li>
		<li>脂肪酸が溶液に入り、目に見える固体が残らなくなったら、ピペットで20%FAFBSAを予備加温し、脂肪酸の体積比:KOH:FAFBSAが1:1:50になるようにして、BSA結合アルキニル脂肪酸の最終濃度を20倍にしました。</li>
		<li>上下にピペッティングして混ぜる。この溶液は、通常、目に見える固体がなく、透明に見えます。 注:通常、小さな固体は、37°Cでのインキュベーション後に溶液に入ります。</li>
		<li>脂肪酸とFAFBSAを37°Cで15分間インキュベートする。 注:この時点でのケン化ラベルは15分を超えて安定しています。 
		 </li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>総媒体量(mL)</td>
			<td>脂肪酸または脂肪酸類似体(μL)</td>
			<td>Vol. KOH (μL)</td>
			<td>Vol. 20% FAFBSA (μL)</td>
			<td>BSA結合ケン化標識の総体積(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>208</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>100</td>
			<td>104</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:ケン化脂肪酸標識率。 脂肪酸標識のケン化のための脂肪酸、KOH、およびFAFBSAの実験体積は、使用した培地の体積に従った。
<ol start="4"><li>コントロールとして、手順 2.3 を繰り返します。アルキン標識のない脂肪酸を含む。</li>
	<li>1/20 容量の 20x 脂肪酸-BSA コンジュゲートで細胞を飢餓培地 (通常、2 mL 培地/細胞中 100 μL) に直接標識して、最終濃度 1% BSA およびアルキニル - ミリスチン酸塩の場合は 25 μM、アルキニル - パルミチン酸およびアルキニル - ステアレートの場合は 100 μM の最終濃度を達成します。 注: 付着した細胞への物理的外乱の量を最小限に抑えるには、培地に直接ピペッティングするのではなく、ピペットの先端にメディアの表面に近い液滴を形成します。アシル化阻害剤を使用する場合は、標識脂肪酸に少なくとも15分前に添加する。時間は、使用する細胞または阻害剤によって異なり得る。この工程にもケン化処理を使用することが推奨されています28。<ol>
<li>比較のために、非ケン化脂質を2μL(またはケン化容量に相当)の非標識脂肪酸を飢餓培地に直接ピペッティングして添加する。</li>
		<li>細胞をインキュベーターに戻し、3〜6時間インキュベートする。 注:最適な標識タイミングは、細胞タイプまたは実験条件ごとに決定する必要があるかもしれません。インキュベーション時間が長くなると、リン脂質などの他の脂質基へのβ酸化および/または取り込みによって脂肪酸が分解される可能性があります28。</li>
	</ol>
</li>
	<li>室温で1x PBSで細胞を穏やかに洗浄する。</li>
	<li>500 μL エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) フリー修飾ラジオ免疫沈降アッセイ (RIPA) バッファー (0.1% SDS、50 mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸 (HEPES) pH 7.4、150 mM NaCl、1% 非変性洗剤、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、2 mM MgCl2 を新たに添加した 1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド (PMSF)、および 10 μg/μL ペプスタチン A (または EDTA 非含有完全プロテアーゼ阻害剤カクテル)) で細胞を回収し、溶解液を 4 °C で 15 分間揺らします。<ol>
<li>溶解物を16,000 x g で4°Cで10分間遠心分離する。</li>
		<li>上清を1.7 mL微量遠心チューブに集め、クリック反応を進行させる準備ができるまで-20°Cで保存する。 メモ: プロトコルはここで一時停止できます。溶解物は-20°Cで最大1ヶ月間安定である。ただし、クリック反応をタイムリーに進めることをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗剤適合性(DC)アッセイなどの製造業者のプロトコールに従って適切なアッセイを使用してタンパク質濃度を定量する。</li>
</ol>3. 細胞溶解液に対するクリック反応
<ol><li>クリックケミストリー用の試薬を準備します。<ol>
<li>トリス-(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン(TBTA)をDMSOに溶解して2mMにする。乾燥剤を入れた小さなアリコートに-20°Cで最大2〜3ヶ月間保管してください。N2またはArの下に保存するのが最適です。</li>
		<li>CuSO4をddH2O水に溶解して50mMを達成する。室温で最大2ヶ月間保存してください。</li>
		<li>トリスカルボキシエチルホスフィン(TCEP)をddH2O水に250mMまで溶解する。4°Cの暗闇の中で保存し、クリック反応の直前に新鮮な50mM希釈液を作ります。</li>
		<li>DMSO中に2mMのアジドを調製する。乾燥剤を入れた小さなアリコートを-20°Cで最大6ヶ月間保管してください。N2またはArの下に保存するのが最適です。 注:3つ以上のポリエチレングリコール群を有する生成物がビオチンで最もよく作用することが観察された。</li>
	</ol>
</li>
	<li>上記と同じ溶解バッファーを使用して、1.7 mL マイクロ遠心チューブ内の 50 ~ 100 μg のタンパク質溶解液を同じ容量に持ってきてください。 注:反応容量はできるだけ小さくしてください(20-100 μL)。<ol>
<li>各サンプルにドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加えて、最終1%濃度を達成します。</li>
		<li>溶解物に添加した後の最終濃度が100 μM TBTA(2 mMストック)、1 mM CuSO4、(50 mMストック)1 mM TCEP(50 mMストック)、および100 μMアジドプローブ(2 mMストック)となるように、クリック試薬のマスターミックスを調製する。それに応じてストックソリューションを組み合わせます( 表2参照)。 メモ: 順序は重要です。各成分の添加後に完全に混合する。</li>
		<li>マスターミックスの適切なボリュームを溶解物に加える。上下にピペッティングして混ぜる。</li>
		<li>37°Cの水浴中で暗所で30分間インキュベートする。時折攪拌/混合する。</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>全反応量(μL)</td>
			<td>ボリュームタンパク質(μL)</td>
			<td>Vol. TBTA (2 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. CuSO4 (50 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. TCEP (50 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. アジドプローブ (2 mM) (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>43</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>86</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:クリック試薬とタンパク質体積比。 クリックケミストリー試薬および対応するストック濃度の実験体積は、タンパク質試料の体積に加えて。
4. 免疫沈降タンパク質のクリック反応
<ol><li>あるいは、ビーズ上 またはオフ 側で免疫沈降(IP)タンパク質上でクリック反応を行うことができる。 注:通常、ビーズ のクリックオフ を実行するとバックグラウンドが最も少なくなり、目的の新しいタンパク質をテストする場合に最適です。<ol>
<li>目的のタンパク質に対する細胞のトランスフェクトは、この場合、野生型ミリストイル化C末端ハンチンチン(HTT)をG2A置換でGFP(myr−ctHTT-GFP)およびctHTT−GFPに融合させ、先に記載したようにリン酸カルシウムDNA共沈法を用いる41。<ol>
<li>6ウェル組織培養プレートに2.5 x 105 細胞/ウェルのプレートを入れ、一晩で約70〜80%のコンフルエントになるまで増殖させる。</li>
			<li>1.7 mL マイクロ遠心管に 2.5 μg DNA を 10 μL と 99.75 μL の分子グレードの H2O を加えて DNA ミックスを調製します。次いで、15.25 μL CaCl2を DNAミックスに滴下して加える。</li>
			<li>DNA/CaCl2 混合物を、125 μL 2x HEPES緩衝生理食塩水(HBS、pH 7.0)を含む別のチューブに滴下しながら加え、混合する。</li>
			<li>DNA/CaCl2/HBSミックスを細胞にゆっくりと加える。2〜4時間後、培地を交換し、一晩インキュベートする。ステップ 1.3-2.8 からラベル付けを続行します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>溶解バッファーに等量の500μgのタンパク質を調製する。</li>
		<li>ctHTT-GFP用ウサギ抗GFPとインキュベートしてIPを4°Cで一晩回転させる。</li>
		<li>溶解バッファーで事前に平衡化した 15 ~ 20 μL のプロテイン G ビーズを各チューブに追加し、4 °C でエンドオーバーエンドで 3 時間反応させます。</li>
		<li>ビーズを溶解バッファーで洗浄し、45 μL 1% SDS 50 mM HEPESバッファーに再懸濁します。</li>
		<li>ビーズを80°Cで15分間加熱し、チューブを反転させるか、約5分ごとに攪拌します。チューブを短時間回転させ、80°Cに戻します。</li>
		<li>サンプルがまだ暖かいうちにタンパク質を含む上清を収集します。 注:プロトコルはここで一時停止することができ、免疫沈降サンプルは、クリックケミストリーに使用しない場合、-20°Cまたは-80°Cで保存することができます。</li>
		<li>43 μL の上清を 7 μL のクリック試薬のマスターミックスと反応させます。</li>
		<li>ステップ3.2.3に記載したとおりに反応を進行させる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SDS-PAGEとウェスタンブロッティング
<ol><li>25mMジチオスレイトール(DTT)を含む1xサンプルローディングバッファーを加え、95°Cで5分間加熱することにより反応を停止し、変性させた。 メモ: 最大 100 mM DTT まで使用できます28。β-メルカプトエタノールはチオエステル結合を加水分解し、クリックされた脂肪酸類似体を除去する可能性があるため、S-アシル化タンパク質とともに使用しないでください。</li>
	<li>サンプルを簡単にスピンダウンします。</li>
	<li>ポリアクリルアミドゲル上のSDS-PAGEでタンパク質を二重に分離する。 注:チオエステル結合の存在を確認するためにKOHによるアルカリ処理には2つのゲルが必要です。蛍光アジドプローブを使用する場合、アシル化は、ゲル内または示された励起チャネルを用いた転写後に検出することができる。</li>
	<li>ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜への転写(メタノール中で活性化し、ddH2Oでリンスする - それぞれ5分間)を、25V、1.0A(一定)で30分間半乾燥転写装置で行う。</li>
	<li>ddH2Oで膜を短時間すすぎた後、1つの複製膜をメタノール/水(9:1 v/v)で0.1 M KOHに浸し、もう1つをメタノール/水(9:1 v/v)の0.1 M Tris-HCl pH 7.0に浸し、室温で60分間穏やかに揺らします。</li>
	<li>ddH2O水で膜を短時間すすぎ、続いてPBS-T(1x PBS、0.1% Tween 20)で5分間6回洗浄します。 注:よく洗ってください。</li>
	<li>膜を5%スキムミルクブロッキングバッファー(1x PBS、0.1% Tween20)で一晩ブロックします。</li>
</ol>6. ウェスタンブロットの実行
<ol><li>指示された場合、蛍光タグ付きストレプトアビジン(1:5000)およびローディングコントロール、抗GAPDHローダミン(1:5000)を5%BSAブロッキングバッファー(0.01% SDS、1x PBS、0.1% Tween20)に室温で45〜60分間、暗闇の中で緩やかに揺らしながらプローブします。<ol>
<li>免疫沈降タンパク質ブロットを、まず5%脱脂粉乳ブロッキングバッファー中の一次抗GFP抗体でプローブし、次いでステップ6.1のように5%BSA中の適切な二次抗体でプローブする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS-T(1x PBS、0.1% Tween20)で膜を合計4回繰り返して5分間洗浄し、イメージング前にddH2O水ですすいでください。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

培養中の細胞に脂肪酸を直接添加すると、不溶性、脂質の沈殿、脂肪毒性をもたらす可能性があります40。その結果、脂肪酸を細胞に直接添加すると、細胞の取り込みが悪くなり、脂肪酸標識の利用可能性が低くなるだけでなく、下流分析のための生細胞の数が減少し、オフターゲット経路が活性化される可能性があります。しかし、クリックケミストリー検出のための多くの代謝標識プロトコルには、脂肪酸の直接添加と、クリックケミストリー検出を用いた多数のパルミトイル - プロテオーム研究が含まれ、今日まで脂肪酸標識をケン化したり、BSA8,36とインキュベートしたりすることはめったにありません。脂肪アシル化タンパク質のクリック化学検出の効率および感度は、脂肪酸類似体の十分な細胞取り込みに依存するという事実を考慮することが重要である。したがって、多くのSアシル化タンパク質は、特に長鎖脂肪酸17-ODYAが使用された場合、細胞への取り込み不良から脂肪酸標識の利用可能性が低いため、プロテオミクス研究における検出を免れた可能性があると推測することは合理的である。17-ODYA、またはアルキニルステアリン酸塩は、その商業的入手可能性およびその早期使用のために、いくつかの研究において広く使用されているラベルとして選択されている8,36。しかし、このプロトコールの結果は、17-ODYAのケン化が、パルミチン酸塩やミリスチン酸塩などの短鎖脂肪酸と比較して、Sアシル化タンパク質の検出において最大の増加をもたらすことを実証する。したがって、ケン化標識を用いてこれらの実験を繰り返すと、以前は見過ごされていた可能性のあるSアシル化のさらなる基質が生じる可能性がある。さらに、ほとんどのパルミトイルアシルトランスフェラーゼはS-アシル化のためにパルミチン酸を好むが、ステアリン酸15、38、44などの他の長さの脂肪酸を好むものもある。さらに、一部のタンパク質またはタンパク質内の特定の部位でさえ、ある脂肪酸を他の脂肪酸よりも好む15,45。したがって、17-ODYAを用いた研究は、パルミチン酸塩ではなくステアリン酸塩でSアシル化されたタンパク質に偏りがあり、検出率が低いためこれらのタンパク質を過小評価している可能性があります。
クリックケミストリーの代謝標識効率の向上は、脂質のケン化、FAFBSAステップによるインキュベーション、ならびに脱脂質化FBSに依存しています。すべての脂肪酸は、FAFBSAとのインキュベーションに進む前に、目に見える固体が残っていない状態でKOHで完全にケン化されなければなりません。これは困難なステップであり、タイミングが重要です。ケン化処理脂肪酸が65°Cで溶液に入った後、さらに加熱すると脂肪酸からDMSOが蒸発するので、すぐに暖かいBSAを加える。さらに、ケン化ラベルは、冷却し始めるとすぐに再凝固し始めます。したがって、FAFBSAは温かく、塩が可溶性になった後に迅速に添加されなければならない。ガラス反応バイアル、およびそれらの形状は、このステップにとって重要である。それらは、ケン化脂質が可溶性のままであるのに十分に暖かく、FAFBSAが固結しないように十分に冷たくすることを可能にする。ピペッティングによる十分な混合も、標識のための均質な溶液を確保するために、このステップで重要です。
クリックケミストリー用の試薬は、通常、乾燥剤と共に、または-20°C〜 -80°CのN2またはArガス下で適切に保存する必要があります。 アシル化シグナルまたは弱いシグナルの欠如は、不安定な試薬、特に古いTBTAおよびアジドストック溶液に起因する可能性がある。さらに、蛍光アジドストック溶液には注意が必要であり、可能な限り光から保護する必要があります。さらに、脂質欠乏の方法や標識時間などの変数は、使用される細胞の種類に応じて最適な条件を決定するために試験する必要があるかもしれません。例えば、神経細胞は、培地変化および脂質欠乏が困難であるため、より長い標識時間を必要とする可能性がある(未発表)。
このプロトコルの利点は、長鎖脂肪酸に使用すると最も劇的です。より短い鎖の場合、シグナル強度の増加はそれほど劇的ではないが、依然として細胞を保護する可能性が高い。提案された改変は、一般的にタンパク質アシル化検出を改善するでしょうが、クリックケミストリーは依然として脂質中心の方法1と考えられており、安定的にSアシル化タンパク質を検出することに限定されています1。考慮すべき他の制限には、標識を促進するための脂肪酸欠乏の要件、およびS-アシル化のアシルビオチン交換(ABE)検出と比較した場合の適合性細胞型の比較的限られた範囲が含まれる16。これらの制限にもかかわらず、クリックケミストリー検出は、ほとんどのアシル交換アッセイよりも高速であり、アシル交換アッセイに必要な繰り返されるタンパク質沈殿ステップを許容しないタンパク質の検出に適しています。さらに、このアプローチは、パルスチェイス分析などの他のクリックアッセイを用いた同時標識と組み合わせることができます38。
クリックケミストリーのための代謝標識のためのこの修飾の使用は、クリックケミストリーと組み合わせて使用される様々なプロテオーム技術を用いて、アシル化タンパク質、特にSアシル化の全体的な検出を増加させた。図に示すように、蛍光発生検出はビオチンの代替として使用することができる(図1)28。これは、細胞溶解物中に内因的に蛍光タンパク質が存在しないため、特に有用である。さらに、クリックケミストリー後にのみ活性化される蛍光色素も使用できます46。クリックケミストリー標識用のケン化およびFAFBSA結合脂肪酸は、細胞内で利用可能な標識の量の全体的な増加および培地への脂肪酸の直接添加による毒性作用の制限により、目的のタンパク質の検出が困難になるのを助けることができる。また、質量分析法27と組み合わせて利用して、特に、最も豊富なタンパク質の検出に有利な既存のデータ依存取得とは対照的に、冗長な測定を防止する機械学習アルゴリズムを使用した最近の進歩と組み合わせて、低存在量のタンパク質の検出を増加させることもできます47.さらに、クリックケミストリーを細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識(SILAC)およびパルスチェイス法と組み合わせて、動的タンパク質Sアシル化に関する定量可能なデータを生成することができます27。最後に、Hannoushグループはクリックケミストリーと近接ライゲーションアッセイ(PLA)を組み合わせて、単一細胞の可視化とパルミトイル化タンパク質の細胞内分布の検査を可能にしました43,48。

脂肪アシル化は、タンパク質への脂肪酸の共有結合付加を含み、タンパク質 - 膜相互作用を促進する上での重要性でよく知られているが、タンパク質間相互作用、立体構造変化を促進し、酵素の触媒部位を調節することも示されている1,2,3,4,5,6,7 .脂肪アシル化は、感染、癌、炎症、神経変性を含む無数の疾患において潜在的な薬物標的として浮上しており、パルミトイル化の破壊が文書化されている8、9、10、11、12、13。これは主に、Sアシル化タンパク質標的の大規模な同定を可能にした新しい化学検出法の開発によって促進されてきた。
脂肪酸アシル化は、飽和および不飽和脂肪酸の共有結合付加を含む様々な修飾を含み得るが、典型的には、N−ミリストイル化およびS−アシル化を指す。N-ミリストイル化とは、タンパク質分解的切断後に新たに露出したN末端グリシン上で、新生ポリペプチド上で共翻訳的に、または翻訳後のいずれかで、N末端グリシンにミリスチン酸を添加することをいう2,14。N-ミリストイル化は不可逆的なアミド結合を介して起こる。一方、Sアシル化は、典型的には、チオエステル結合を介してシステイン残基に長鎖脂肪酸を可逆的に付加することを指す。この修飾の最も一般的な形態は、パルミチン酸塩の取り込みを含み、したがって、一般に、S−パルミトイル化、または単にパルミトイル化11,15と呼ばれる。多くの点で、S-パルミトイル化はリン酸化に類似している。それは動的で、酵素的に調節され、そして非常に扱いやすいことが証明されています。
過去10年間、脂肪アシル化の研究は、放射性標識された脂肪酸を必要とする限られた検出方法によって妨げられていました。これには、コスト、安全性の問題、非常に長い検出時間など、いくつかの欠点がありました。典型的には、トリチウム化またはヨウ素化パルミチン酸塩のいずれかがS-アシル化の検出に使用された16。トリチウム化されたパルミテートは、オートラジオグラフィーフィルムで長い検出期間を必要とし、数週間から数ヶ月かかることがあります。[125I] ヨード脂肪酸類似体は検出時間を短縮したが、安全性リスクがはるかに高く、実験者の甲状腺モニタリングが必要だった。さらに、これらの方法は非定量的であったため、動的パルミトイル化を測定する能力が制限され、追加の個人用保護具および放射性モニタリングのためにセットアップおよびクリーンアップに時間がかかった。最後に、放射性標識はプロテオーム研究にはあまり適しておらず、典型的には、目的の特定のタンパク質の低スループット検出に限られていた。より多くの基質が検出され、必然的に各修飾を媒介する酵素が同定されるにつれて、新しい検出方法が必要であることは明らかでした17,18,19,20,21。ほぼ同時に、脂肪アシル化タンパク質を検出するためのいくつかの新しい方法が生じた。第1は、Sアシル化のチオエステル結合の可逆性と反応性を利用する。アシル-ビオチン交換(ABE)アッセイは、パルミチン酸塩をビオチンで化学的に置換し、アビジンアガロースビーズを使用してSアシル化タンパク質をプルダウンし、ウェスタンブロット22、23、24による直接検出を行います。次に、脂肪酸の生体直交標識およびタグまたはハンドルへの化学選択的付加が開発され、シュタウディンガーライゲーションおよびクリックケミストリーの使用を含む25,26,27,28,29,30,31,32,33.最後に、ABEと同様に、アシル樹脂支援捕捉(RAC)は、本質的にS-アシル化タンパク質の捕捉および検出のために、S-アシル化部位をチオール反応性ビーズで置き換える34,35。交換およびクリックケミストリーベースのアッセイを組み合わせることで、下流分析のためのアシル化検出およびアフィニティー精製のより効率的で高感度な方法が提供され、その後、何千ものSアシル化タンパク質が発見されました8,36。
クリックケミストリーという用語は化学反応のグループを包含するが、最も一般的には、アルキニル基とアジド基との間のCu(I)触媒アジドアルキン[3+2]環付加反応機構を指す27,28,37。特に、脂肪アシル化の場合、クリックケミストリーは、生体直交する16-炭素アルキニルパルミチン酸(15-ヘキサデシン酸;15-HDYA)または14-炭素アルキニルミリスチン酸(13-テトラデシン酸;13-TDYA)をそれぞれ細胞に組み込んで内在的にアシル化されたタンパク質を標識することにより、S-パルミトイル化またはN-ミリスチル化の検出を含む28.目的のタンパク質の細胞溶解および免疫沈降後、クリック化学反応(アルキンとアジドとの間の共有結合結合)が行われ、ウェスタンブロットによる検出のためにアフィニティープローブ(典型的にはビオチン)が結合する28,37。あるいは、全細胞溶解物に対してクリックケミストリーを行うことができ、脂肪アシル化タンパク質は、質量分析による同定のために親和性精製することができる。アジド-ビオチンによる最初のクリック化学反応は、放射能と比較して検出の選択性と感度を100万倍以上に向上させました2。クリックケミストリーのもう1つの利点は、定量分析のためにアジドホモアラニンを用いたタンパク質代謝回転のパルスチェイス分析など、他の古典的な標識法と組み合わせることができることです38。さらに、タンパク質の局在を調べるために、ビオチンまたは他の生化学的プローブ(FLAGまたはMycタグなど)の代わりに蛍光プローブを使用することができる16,28,39。
クリックケミストリーの比較的使いやすさにもかかわらず、検出は、細胞培養において長鎖遊離脂肪酸を使用することの溶解度が低く、潜在的な毒性が低いことによって制限され得る40。特に、大多数のタンパク質に対するSアシル化中のパルミチン酸塩の選好にもかかわらず、多くの研究は、その商業的入手可能性および比較的低コストのために、パルミチン酸(15−HDYA)ではなく18−炭素ステアリン酸塩(17−オクタデシン酸−17−ODYA)をSアシル化タンパク質を検出するために使用している。しかし、17-ODYAは非常に不溶性であり、使用される際には特別な注意が必要である。さらに、クリックケミストリーは、化学物質の微妙な調製と保管を必要とする場合があります。本明細書では、このプロトコルは、脂肪酸のケン化、脂肪酸遊離BSAによる送達、および脱脂ウシ胎児血清(FBS)を用いた送達を最適化して溶解性を高め、遊離脂肪酸を細胞に添加することによる潜在的な毒性作用をバイパスする標識アプローチを記載している28。この方法は様々な細胞タイプで機能し、生きた動物でも使用されています28。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>90270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide/bis solution 29:1</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFDye 647 azide plus</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-tris, ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 16,000xg, 4&#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imager</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (1 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid sodium salt monohydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent compatible (DC) assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0231-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>319015CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219989950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blot Turbo Semi-dry transfer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Incubator at 37&#176;C and 5% CO2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement solution</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myristic Acid (25 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M0476-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid (100 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 10x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>450201EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A (synthetic)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-085-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-184-G005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75801-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified)</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal antibody to GFP</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>600-110-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)</td>
			<td>Soltec Ventures</td>
			<td>M115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-043-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Reagent Grade 1L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHEATON NextGen V Vials 3 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry

脂肪アシル化は、タンパク質基質への飽和脂肪酸の共有結合的付加であり、癌および神経変性疾患におけるその含意に加えて、無数の細胞機能を調節する上で重要である。脂肪アシル化検出法における最近の開発により、特に生体直交標識によるクリックケミストリーの使用により、脂肪アシル化タンパク質の効率的で非危険な検出が可能になりました。しかし、クリックケミストリー検出は、細胞培養物に長鎖脂肪酸を添加することによる溶解性の悪さと潜在的な毒性作用によって制限される可能性があります。ここで説明するのは、ケン化脂肪酸を脂肪酸フリーBSAと組み合わせて使用する送達を最適化した標識アプローチ、および脱脂培地であり、検出が困難な脂肪酸アシル化タンパク質の検出を改善することができます。この効果は、アシル化タンパク質のクリックケミストリー検出において最も一般的に使用されている脂肪酸類似体であるアルキニル - ステアリン酸類似体、17-ODYAで最も顕著であった。この修飾は、細胞取り込みを改善し、アシル化タンパク質検出に対する感度を高める。さらに、このアプローチは、さまざまな細胞タイプに適用し、パルスチェイス分析、細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識、脂肪アシル化タンパク質の定量プロファイリングのための質量分析などの他のアッセイと組み合わせることができます。

クリックケミストリー検出用のケン化アルキニル脂肪酸と非ケン化(非樹液)アルキニル脂肪酸の標識効率の違いを可視化し、ウェスタンブロットによる脂肪アシル化タンパク質のシグナル強度で比較することができます(図1)。アシル鎖の長さの増加とともに顕著な効果が観察された。アルキニル-ステアリン酸塩(alk-stear)で標識された細胞では、脂肪酸のケン化および代謝標識のためのBSAによる送達により、クリックケミストリーおよび蛍光アジドプローブによる検出によるSアシル化タンパク質シグナルの検出が劇的に増加し(図1、右)、アルキニル脂肪酸標識の細胞内取り込みの全体的な増加が示唆された。逆に、最短かつ最も可溶性の脂肪酸であるアルキニルミリスチン酸(alk-myr;13-テトラデシン酸または13-TDYA)で処理した細胞では顕著な差は認められなかった。アルキニルパルミチン酸塩で標識された細胞(図1、中央)は、アルキニルミリスチン酸塩(13-TDYA)と比較して標識の中間的な増加を示したが、アルキニル - ステアリン酸塩よりも少ない。
重要なことに、PVDF膜を0.1 M KOHで処理し、アルキニル - パルミチン酸塩およびアルキニル - ステアリン酸塩と共にインキュベートした細胞から脂肪酸標識の大部分を大幅に除去し、シグナルの大部分がエステル結合またはチオエステル結合を介していたことを確認した(図1、中央および右、下部パネル)。予想通り、ミリスチン酸アルキニルの取り込みは、アミド結合を介してタンパク質にミリスチン酸が結合するため、ほとんどがアルカリ耐性であった(図1、左、下のパネル)。
図2は、免疫沈降タンパク質の脂肪アシル化を検出するためのクリックケミストリーの汎用性と感度を示しています。HEK293T細胞を、GFP(myr-ctHTT-GFP)に融合させたミリストイル化C末端ハンチンチン(HTT)でトランスフェクトし、前述のようにアルキニルミリスチン酸で標識した18。免疫沈降に続いて、ctHTT-GFPをビーズから放出し、溶解物と共にクリックケミストリーを行った。野生型(WT)myr-ctHTT-GFPのミリストイル化が免疫沈降物で検出されただけでなく、溶解物でも強く検出されたが、G2A変異はctHTT-GFPのミリストイル化を完全にブロックした(図2)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> 図1:クリックケミストリーを用いた脂肪アシル化タンパク質の検出 HEK293T細胞を、プロトコル2.1〜2.7に記載されているように、示された脂肪酸と直接(非樹液)またはケン化(sap)に続いてキャリアタンパク質BSAと共にインキュベートしてインキュベートした。アルキニル脂肪酸を蛍光アジドに連結させたのは、100μgのタンパク質溶解物をクリックケミストリーに供し、SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写した。pH7.0または0.1 M KOHの0.1 M Trisで処理した後、チオエステル結合を逆にするために、蛍光アジドを用いて脂肪アシル化を検出した。GAPDH はローディング コントロールとして使用されました。抗GAPDHローダミン(1:5,000)。Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> 図2:クリックケミストリーを用いたN-ミリストイル化ctHTT-GFPの検出 HEK293T細胞を、C末端切断型(ct)およびミリストイラブル型のHTT(myr-ctHTT-GFP)でトランスフェクトし、アルキニルミリスチン酸塩で標識した。必須グリシンをアラニンに置き換えた非ミリストイラタブル形態が含まれていた(G2A)。採取および溶解に続いて、ctHTT-GFPをヤギ抗GFPを用いて免疫沈降させた。溶解物を、ビーズからの放出に続くクリック化学反応(左)ならびに免疫沈降物に供した。ミリストイル化は、ストレプトアビジンAlexa 680(SA680)を用いて検出した。GFPは、抗ウサギAlexa 488と組み合わせたウサギ抗GFPを用いて検出した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> 図3:実験プロトコールのワークフロースキーム。 プロトコルにおける主要な実験ステップのワークフロー概要。プロトコルが一時停止される可能性があるいくつかの点が指摘されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

脂肪アシル化の研究は、細胞タンパク質相互作用および疾患において重要な意味を有する。ここでは、脂肪アシル化タンパク質のクリックケミストリー検出を改善するための修正プロトコルを示しており、これは様々な細胞タイプに適用し、パルスチェイスおよび質量分析を含む他のアッセイと組み合わせることができる。

クリックケミストリーを用いた脂肪酸アシル化タンパク質の検出のためのアルキニル脂肪酸類似体の最適化された組み込み

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

この方法は、細胞への脂肪酸の送達を改善し、遊離脂肪酸送達の毒性作用から細胞を保護し、したがって、より一貫した標識を保証する。クリックケミストリー検出の感度と効率は、脂肪酸標識の効果的な取り込みに依存します。私たちは、これが大幅に改善できることを示しました。プロトコルのいくつかのステップは非常に具体的であり、厳密に従う必要があります。視覚的なデモンストレーションは、例えば、ラベリングミックス中の固体の形成を回避する方法を明確にし、示すことができる。標識培地を調製するには、DMEMに5%デキストラン/木炭コーティングFBS、1Xペニシリンストレプトマイシン、2ミリモルL-グルタミン、および100ミリモルピルビン酸ナトリウムを補充し、使用前に摂氏37度に予温します。1日前に6ウェル組織培養皿に播種したHEK-293 T細胞をPBSで穏やかに洗浄し、次いでPBSを標識培地と交換する。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で約45分間インキュベートしてから、脂肪酸による代謝標識に進みます。脂肪酸類似体をケン化するために、少なくとも2マイクロリットルのアルキニル脂肪酸類似体を3ミリリットルの円錐形反応バイアルの底部に直接ピペットする。等量の希釈水酸化カリウムをガラスの端の反応バイアルの底部近くにピペットで、分注された量の水酸化カリウムが脂肪酸と混合するようにする。バイアルの蓋を閉じ、静かにタップして溶液を混合します。反応バイアルを摂氏65度で約5分間、または溶液が透明になるまで加熱し、脂肪酸が組み込まれたことを示す。ただし、液体が蒸発しすぎないように注意してください。次に、ピペットで脂肪酸非含有BSAに対する脂肪酸対水酸化カリウムの体積比が1~1~50となるように脂肪酸非含有BSAを予め加温し、終濃度20倍のBSA結合アルキニル脂肪酸を達成した。溶液を上下にピペッティングして混合し、摂氏37度で15分間インキュベートする。20X脂肪酸BSAコンジュゲートを飢餓培地に直接添加してHEK-293 T細胞を標識し、25マイクロモルのミリスチン酸アルキニルまたは100マイクロモルのパルミチン酸アルキニルおよびステアリン酸アルキニル中の1%BSAの最終濃度を達成します。比較のために、2マイクロリットルの非標識脂肪酸を飢餓培地に直接ピペッティングすることによって非ケン化液体を加え、次いで細胞をインキュベーターに3〜6時間戻した。インキュベーションが完了した後、室温でPBSで細胞を穏やかに洗浄し、次いで500マイクロリットルのEDTA非含有修飾RIPA緩衝液を添加し、溶解物を摂氏4度で15分間回転させることによって細胞を回収および溶解する。溶解液を16,000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を1.7ミリリットルの微量遠心チューブに集め、マイナス20°Cで保存します。EDTAフリーの改変RIPAバッファーを使用して、1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに50~100マイクログラムのタンパク質溶解液を等量に持ち込みます。反応量はできるだけ小さくしてください。各サンプルにSTSを加えて最終濃度1%を達成するクリック試薬のマスターミックスを調製し、溶解物に適切な量を加え、上下にピペッティングして混合します。溶解物を暗所で30分間、摂氏37度の水浴中で時折混合しながらインキュベートする。免疫沈降のために、溶解物をウサギ抗GFPと混合し、摂氏4度で回転させて一晩インキュベートする。0.1%SDS RIPAで予め平衡化した15~20マイクロリットルの磁気ビーズを各チューブに加え、摂氏4度で3時間、端から端まで反応させます。ビーズを溶解バッファーで洗浄し、1%SDS を含む 45 マイクロリットルの 50 ミリモル HEPESバッファーに再懸濁します。ビーズを摂氏80度で15分間加熱する。インキュベーション中は、チューブを約5分ごとに反転または攪拌し、すべてのチューブを短時間回転させます。サンプルがまだ温かいうちに、タンパク質を含む上清を収集します。43マイクロリットルの上清と7マイクロリットルのクリック試薬マスターミックスを組み合わせ、37°Cで30分間暗闇の中で反応させます。西洋のプロットでは、アシル鎖の長さが長くなったケン化アルキニル脂肪酸と非ケン化アルキニル脂肪酸の間のクリックケミストリー検出の標識効率に顕著な効果が観察されました。ステアリン酸アルキニルで標識された細胞では、脂肪酸のケン化および代謝標識のためのBSAによる送達により、クリックケミストリーおよび蛍光アジトプローブによる検出によるSアシル化タンパク質シグナルの検出が劇的に増加し、アルキニル脂肪酸標識の細胞内包の全体的な増加が示唆された。逆に、ミリスチン酸アルキニルを最短かつ最も可溶性の脂肪酸で処理した細胞では顕著な差は認められなかった。パルミチン酸アルキニルで標識された細胞は、ミリスチン酸アルキニルと比較して標識の中間的な増加を示したが、ステアリン酸アルキニルよりも少ない。重要なことに、PVDF膜を0.1モルの水酸化カリウムで処理すると、パルミチン酸アルキニルおよびステアリン酸アルキニルと共にインキュベートした細胞から脂肪酸標識の大部分が除去され、シグナルの大部分がエステル結合またはチオエステル結合を介していたことが確認された。予想通り、ミリスチン酸アルキニルの取り込みは、アミド結合を介してタンパク質にミリスチン酸が結合するため、ほとんどがアルカリ耐性であった。クリックケミストリーに続いて、野生型ミリストイル化C末端ハンチントンGFPのミリストイル化が免疫沈降物および溶解物中に検出されたが、G2A変異はC末端ハンチントンGFPのミリストイル化を完全に遮断した。クリックケミストリーに続いて、質量分析用の脂肪アシル化タンパク質のアフィニティー精製を行うことができます。これは、細胞を毒性から保護することによって脂肪アシル化タンパク質の異なるプロファイルをもたらし得る。

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Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

核酸プローブを用いたヌクレアーゼ活性の運動スクリーニング

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support