Name: optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av National Science and Engineering Research Council (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao ble finansiert av The Ram og Lekha Tumkur Memorial Scholarship gjennom Institutt for biologi ved University of Waterloo, og Lucy Morrison Memorial Bursary gjennom IODE Ontario, i tillegg til forskningsfinansiering fra University of Waterloo bestående av Graduate Research Studentship (50503-11072), Science Graduate Award og Graduate Teaching Assistantship. Forfatterne vil takke alle medlemmer av Martin-laboratoriet for deres støtte til å forberede dette manuskriptet, spesielt Stephanie Ryall, Harleen Gill og Sadia Khan som i utgangspunktet hjalp til med å sette opp Martin Lab som forberedelse til disse studiene. Forfatterne vil også takke Dr. Luc Berthiaume for den slags gave av ctHTT-GFP-konstruksjonene og Dr. Shaun Sanders for kritiske innspill i forberedelsen av manuskriptet. Figur 3 ble opprettet med BioRender.com.

1. Cellekultur
<ol><li>For å supplere DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) for cellekultur, legg til 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-glutamin og 100 mM natriumpyuvatt (1% vol / vol).</li>
	<li>Plate ca 5 x 105 HEK293T celler / brønn av en 6-brønns vev kulturrett og vokse i 18 timer i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO2 for å nå 75% -80% samløp.</li>
	<li>Fettsyre serum deprivasjon<ol>
<li>For å forberede merking av medier, klargjør du DMEM som ovenfor (trinn 1.1) uten 10% FBS. Erstatt FBS med 5% dextran-kullbelagt FBS (DCC-FBS). Forvarm til 37 °C før bruk.</li>
		<li>Vask cellene forsiktig med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) ved romtemperatur og erstatt med merkemedier. MERK: HEK293T celler løsner lett fra vevskulturplater. Vær forsiktig når du vasker celler og bytter ut medier. Minimer agitasjon under overføring til og fra inkubatoren så mye som mulig.</li>
		<li>Returner cellene til 37 °C inkubatoren med 5 % CO2 og inkuber ca. 45 min (minimum 15 min er effektiv), opptil 60 min, før du fortsetter med metabolsk merking med fettsyrer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Forberedelse og saponering av fettsyreanaloger
<ol><li>Forbered lagerløsningene til alkynylfettsyrer på forhånd ved å løse i DMSO for å oppnå følgende konsentrasjoner og lagre ved -20 °C. Tine ved romtemperatur etter behov. Lagre forberedelsene for best mulig ytelse under N2 eller Ar. Alkynyl-myristate (13-tetradecynsyre, 13-TDYA): 25 mM Alkynyl-palmitat (15-heksadecynsyre; 15-HDYA): 100 mM Alkynyl-stearate (17-oktadecynsyre; 17-ODYA): 100 mM
</li>
	<li>For å forberede 20% fettsyrefri BSA (FAFBSA), vei 2 g FAFBSA i et 50 ml engangsrør.<ol>
<li>Ta opp til 10 ml med forvarmet (37 °C) DMEM.</li>
		<li>Bland ved ende-over-end rotasjon eller ved virveling, og plasser i et 37 °C vannbad for å oppløse FAFBSA helt.</li>
		<li>Bruk 0,2 μm filter for å filtrere sterilisering av mediet.</li>
		<li>Aliquot i ca 1 ml volumer og lagre ved -20 °C. Tine etter behov og varm til 37 °C i et vannbad før bruk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For å forbedre løseligheten til fettsyren og fettsyreanalogene, kan du saponere ved å inkubere med 20% molar overskudd av kaliumhydroksid (KOH) i 3 ml glasskoniske reaksjonsflasker. MERK: Disse hetteglassene gjør at saltet forblir løselig samtidig som FAFBSA ikke kommer fra den høye varmen. Bruken av glass forhindrer også at fettsyrer fester seg til plasten.<ol>
<li>Pipette ut minst 2 μL alkynylfettsyre analog direkte til bunnen av et 3 ml konisk reaksjonshette hetteglass. Forbered 2 μL lipid per brønn på en 6-brønns plate som brukes (se tabell 1). MERK: På grunn av hydrofobiskheten til fettsyrer, er det best å belegge pipettens spiss ved å trekke opp ønsket volum flere ganger før du dispenserer det inn i reaksjonshette hetteglasset.</li>
		<li>Fortynn 1 M KOH til konsentrasjoner som tilsvarer 20% molar overskudd av alkynyl fettsyreetiketten (30 mM for 13-TDYA og 120 mM for 15-HDYA og 17-ODYA).</li>
		<li>Pipette ut en lik mengde fortynnet KOH (1 μL : 1 μL fettsyre : KOH) nær bunnen av reaksjonsflasken på kanten av glasset, slik at det dispenserte volumet av KOH blandes med fettsyren.</li>
		<li>Lukk lokket på hetteglasset og trykk forsiktig for å blande løsningene. MERK: Blandingen kan størkne raskt, spesielt med økende lengder av hydrokarbonkjeden til fettsyren. Pass på at du ikke rører det faste (dvs. ikke bland ved pipettering).</li>
		<li>Varm opp hetteglasset med reaksjon ved 65 °C i ca. 5 minutter, eller så snart fettsyren er inkorporert (oppløsningen blir klar). MERK: Fettsyrer med et høyere antall karboner og redusert løselighet, som stearate (17-ODYA), kan kreve lengre inkubasjonstider for å bli fullstendig innlemmet i KOH ved 65 °C. Øk temperaturen til 70 °C om nødvendig. Et vannbad er best. Pass på at væsken ikke fordamper for mye.</li>
		<li>Når fettsyrene har gått inn i løsningen og ingen synlige faste stoffer gjenstår, pipette forhåndsvarslet 20% FAFBSA slik at volumforholdet mellom fettsyrer: KOH: FAFBSA er 1: 1: 50 for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20x BSA-bundet alkynyl fettsyrer.</li>
		<li>Bland ved å pipettere opp og ned. Løsningen fremstår vanligvis klar uten synlige faste stoffer. MERK: Vanligvis vil små faste stoffer gå i oppløsning etter inkubasjon ved 37 °C.</li>
		<li>Inkuber fettsyren og FAFBSA i 15 min ved 37 °C. MERK: Den saponifiserte etiketten på dette punktet er stabil utover 15 min. 
		 </li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Totalt medievolum (ml)</td>
			<td>Vol. fettsyre eller fettsyre analog (μL)</td>
			<td>Vol. KOH (μL)</td>
			<td>Vol. 20% FAFBSA (μL)</td>
			<td>Total vol. av BSA-konjugert saponifisert etikett (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>208</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>100</td>
			<td>104</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Saponifiserte fettsyremerkingsforhold. Eksperimentelle volumer av fettsyre, KOH og FAFBSA for saponering av fettsyreetikett i henhold til volumet av medier som brukes.
<ol start="4"><li>Som en kontroll gjentar du trinn 2.3. med fettsyrer uten alkyneetikett.</li>
	<li>Merk cellene med 1/20 volum av 20x fettsyre-BSA konjuger direkte på sultmediet (vanligvis 100 μL i 2 ml medier/celler) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1% BSA og 25 μM for alkynyl-myristate, eller 100 μM for alkynyl-palmitate og alkynyl-myristate, eller 100 μM for alkynyl-palmitate og alkynyl-stearate. MERK: For å minimere mengden fysisk forstyrrelse av de vedlagte cellene, danner du et dråpe på spissen av pipetten nær overflaten av mediet i stedet for pipettering direkte inn i mediet. Hvis du bruker acyleringshemmere, tilsett minst 15 min før de merkede fettsyrene. Tidene kan variere avhengig av cellene eller inhibitoren som brukes. Det har blitt anbefalt å bruke saponifiseringen for dette trinnet også28.<ol>
<li>Til sammenligning legger du til ikke-saponifiserte lipider ved å pipettere 2 μL (eller tilsvarende volum saponifisert) av umerket fettsyre direkte inn i sultmediet.</li>
		<li>Plasser cellene tilbake i inkubatoren og inkuber i 3-6 timer. MERK: Optimal merkingstid må kanskje bestemmes for hver celletype eller eksperimentell tilstand. Lengre inkubasjonstider kan potensielt føre til nedbrytning av fettsyrene ved β-oksidasjon og /eller inkorporering i andre lipidgrupper, for eksempel fosfolipider28.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vask cellene forsiktig med 1x PBS ved romtemperatur.</li>
	<li>Høst og lyse cellene med 500 μL etylendiamintetraacetic acid (EDTA)-fri modifisert radioimmunoprecipitation analyse (RIPA) buffer (0,1% SDS, 50 mM N-2-hydroksyethylpiperazine-N-etanesulfonsyre (HEPES) pH 7.4, 150 mM 1% ikke-denaturing vaskemiddel, 0,5% natrium deoxycholate, 2 mM MgCl2 med fersk tilsatt 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), og 10 μg/μL Pepstatin A (eller EDTA-fri komplett proteasehemmercocktail)) ved å gynge lysates i 15 min ved 4 °C.<ol>
<li>Sentrifuger lysatene ved 16 000 x g i 10 min ved 4 °C.</li>
		<li>Samle supernatanten i 1,7 ml mikrosenterrør og oppbevar dem ved -20 °C til de er klare til å fortsette med klikkreaksjon. MERK: Protokollen kan settes på pause her. Lysates er stabile ved -20 °C i opptil 1 måned. Det anbefales imidlertid å fortsette med klikkreaksjonen i tide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kvantifisere proteinkonsentrasjonene ved hjelp av en passende analyse i henhold til produsentens protokoll, for eksempel en vaskemiddelkompatibel (DC) analyse.</li>
</ol>3. Klikk reaksjon på cellelysater
<ol><li>Forbered reagensene for klikkkjemi.<ol>
<li>Løs opp tris-(benzyltriazolylmetyl) amin (TBTA) i DMSO til 2 mM. Oppbevars i små aliquots med tørkemiddel ved -20 °C i opptil 2-3 måneder. Best lagret under N2 eller Ar.</li>
		<li>Løs opp CuSO4 i ddH2O vann for å oppnå 50 mM. Oppbevars ved romtemperatur i opptil 2 måneder.</li>
		<li>Løs opp tris-carboxyethylphosphine (TCEP) i ddH2O vann til 250 mM. Oppbevar i mørke ved 4 °C og gjør ferske 50 mM-fortynninger like før klikkreaksjonen.</li>
		<li>Forbered 2 mM azide i DMSO. Oppbevars i små aliquots med tørkemiddel ved -20 °C i opptil 6 måneder. Best lagret under N2 eller Ar. MERK: Det ble observert at produktene med tre eller flere polyetylenglykolgrupper fungerte best med biotin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ta med 50-100 μg proteinlysater i 1,7 ml mikrosentrifugerør til samme volum ved hjelp av samme lysisbuffer som ovenfor. MERK: Hold reaksjonsvolumet så lite som mulig (20-100 μL).<ol>
<li>Tilsett natrium dodecylsulfat (SDS) i hver prøve for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 %.</li>
		<li>Forbered en masterblanding av klikkreagenser slik at de endelige konsentrasjonene etter tilsetning til lysatene er: 100 μM TBTA (2 mM lager), 1 mM CuSO4, (50 mM lager) 1 mM TCEP (50 mM lager) og 100 μM azide sonde (2 mM lager). Kombiner lagerløsninger tilsvarende (se tabell 2). MERK: Bestillingen er viktig. Bland helt etter tilsetning av hver komponent.</li>
		<li>Tilsett passende volumer av hovedblandingen i lysatene. Bland ved å pipettere opp og ned.</li>
		<li>Inkuber i 30 min i mørket i et 37 °C vannbad. Agiter/bland av og til.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Total reaksjon vol (μL)</td>
			<td>Vol. protein (μL)</td>
			<td>Vol. TBTA (2 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. CuSO4 (50 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. TCEP (50 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. azido sonde (2 mM) (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>43</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>86</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Klikk på reagens- og proteinvolumforhold. Eksperimentelle volumer av klikkkjemireagenser og tilsvarende lagerkonsentrasjoner, i tillegg til volumene av proteinprøver.
4. Klikk reaksjon på immunoprecipitated proteiner
<ol><li>Alternativt er det mulig å utføre klikkreaksjonen på immunoprecipitated (IP) proteiner på eller utenfor perlene. MERK: Vanligvis fører det å utføre klikk av perlene til minst bakgrunn og er best når du tester nye proteiner av interesse.<ol>
<li>Transfektceller for protein av interesse, i dette tilfellet, wildtype myristoylated C-terminal huntingtin (HTT) smeltet sammen til GFP (myr-ctHTT-GFP) og ctHTT-GFP med en G2A-substitusjon, ved hjelp av kalsiumfosfat DNA-kopulitasjon, som tidligere beskrevet41.<ol>
<li>Plate 2,5 x 105 celler/brønn i 6-brønns vevskulturplater og vokse over natten til ~ 70-80% samløp.</li>
			<li>Forbered DNA-blandingen ved å tilsette 2,5 μg DNA i 10 μL med 99,75 μL molekylær klasse H2O til et 1,7 ml mikrosenterrør. Tilsett deretter 15,25 μL CaCl2 dråpevis til DNA-blandingen.</li>
			<li>Tilsett DNA/CaCl2-blanding i et separat rør som inneholder 125 μL 2x HEPES bufret saltvann (HBS, pH 7.0) på en dråpevis måte med blanding.</li>
			<li>Tilsett DNA/CaCl2/HBS-blandingen langsomt i cellene. Etter 2-4 timer, erstatt media og inkuber over natten. Fortsett med merking fra trinn 1.3-2.8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forbered like store mengder 500 μg protein i lysisbuffer.</li>
		<li>Utfør IP ved å inkubere med kanin anti-GFP for ctHTT-GFP roterende over natten ved 4 °C.</li>
		<li>Tilsett 15-20 μL protein G perler forhåndsjustert med lysisbuffer til hvert rør og la det reagere ende-over-end ved 4 °C i 3 timer.</li>
		<li>Vask perlene med lysisbuffer og resuspend i 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES buffer.</li>
		<li>Varm perlene ved 80 °C i 15 minutter og snu rørene eller rørene i rørene eller rør ca. hvert 5. Snurr rørene kort og gå tilbake til 80 °C.</li>
		<li>Samle supernatanten som inneholder proteinene mens prøvene fortsatt er varme. MERK: Protokollen kan settes på pause her, og de immunoprecipitated prøvene kan lagres ved -20 °C eller -80 °C, hvis den ikke brukes til klikkkjemi med en gang.</li>
		<li>La 43 μL av supernatanten reagere med 7 μL masterblanding av klikkreagenser.</li>
		<li>Fortsett med reaksjonen som angitt i trinn 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SDS-SIDE og vestlig blotting
<ol><li>Stopp reaksjonen og tannåpningen ved å tilsette 1x prøvelastebuffer som inneholder 25 mM dithiothreitol (DTT) og varme ved 95 °C i 5 minutter. MERK: Opptil 100 mM DTT kan brukes28. Ikke bruk β-mercaptoetanol med S-acylerte proteiner, da det kan hydrolysere tioesterbindingene og fjerne den klikkede fettsyreanalogen.</li>
	<li>Snurr kort ned prøvene.</li>
	<li>Skill proteinene med SDS-PAGE på en polyakrylamidgel, i duplikater. MERK: To geler er nødvendig for alkalisk behandling med KOH for å bekrefte tilstedeværelsen av thioesterbindinger. Hvis du bruker en fluorescerende azide-sonde, kan akylering oppdages i gel eller etter overføring ved hjelp av den angitte eksitasjonskanalen.</li>
	<li>Overfør til polyvinyllidfluoridmembraner (PVDF) (aktivert i metanol og skyllet i ddH2O - 5 min hver) med halvtørrt overføringsapparat ved 25 V, 1,0 A (konstant) i 30 minutter.</li>
	<li>Etter kort skylling av membranene med ddH2O, suge en replikere membran i 0,1 M KOH i metanol / vann (9: 1 v / v) og den andre i 0,1 M Tris-HCl pH 7.0 i metanol / vann (9: 1 v / v) som en ikke-alkalisk kontroll i 60 min ved romtemperatur med mild rocking.</li>
	<li>Skyll membranene kort i ddH2O vann, etterfulgt av 6 ganger 5 min vasker i PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20). MERK: Vask grundig.</li>
	<li>Blokker membranene over natten i 5% skummet melk blokkering buffer (1x PBS, 0,1% Tween20).</li>
</ol>6. Utfør vestlig blott
<ol><li>Der det er indikert, sonde med fluorescerende merket Streptavidin (1:5000) og lastekontroll, anti-GAPDH rhodamin (1:5000) i 5% BSA blokkering buffer (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) ved romtemperatur i 45-60 min med mild rocking, i mørke.<ol>
<li>Sonder det immunoprecipitated proteinet blot først med primært anti-GFP-antistoff i 5% skummet melkblokkeringsbuffer, deretter med passende sekundære antistoffer i 5% BSA som i trinn 6.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vask membranene i 5 min i PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) totalt fire repetisjoner og skyll med ddH2O vann før avbildning.</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Direkte tilsetning av fettsyrer til celler i kultur kan føre til uoppløselighet, utfelling av lipider og lipotoksisitet40. Følgelig kan tilsetning av fettsyrer direkte til celler ikke bare resultere i dårlig cellulært opptak og lav tilgjengelighet av fettsyreetiketten, men også et redusert antall levedyktige celler for nedstrømsanalyse, samt aktivering av off-target veier. Imidlertid innebærer mange metabolske merkingsprotokoller for klikkkjemideteksjon direkte tilsetning av fettsyrer og et stort antall palmitoylproteomestudier ved hjelp av klikkkjemideteksjon til dags dato, og beskytter sjelden fettsyreetikettene eller inkuberer dem med BSA8,36. Det er viktig å vurdere det faktum at effektiviteten og følsomheten til klikkkjemideteksjon av fettakylerte proteiner er avhengige av tilstrekkelig cellulært opptak av fettsyreanalogene. Derfor er det rimelig å spekulere i at mange S-acylerte proteiner kan ha unnsluppet deteksjon i proteomiske studier på grunn av lav tilgjengelighet av fettsyreetikettene fra dårlig inkorporering i cellene, spesielt når den lengre kjedefettsyren 17-ODYA ble brukt. 17-ODYA, eller alkynyl-stearate, har vært den mye brukte etiketten for flere studier på grunn av kommersiell tilgjengelighet og tidlig bruk8,36. Resultatene av denne protokollen viser imidlertid at saponering av 17-ODYA resulterer i den største økningen i påvisning av S-acylaterte proteiner, sammenlignet med kortere kjedefettsyrer som palmitate eller myristate. Derfor kan gjentakelse av disse eksperimentene med saponifiserte etiketter gi ytterligere substrater av S-akriylering som tidligere kan ha blitt oversett. Videre, mens de fleste palmitoyl acyltransferaser foretrekker palmitat for S-acylering, har noen preferanser for andre lengder av fettsyrer som stearate15,38,44. I tillegg foretrekker noen proteiner eller til og med spesifikke steder i proteiner en fettsyre fremfor en annen15,45. Derfor kan studier som bruker 17-ODYA ha en skjevhet mot proteiner S-acylert medstearat, ikke palmitat, samtidig som de underreguleres på grunn av lavere deteksjon.
Den forbedrede metabolske merkingseffektiviteten for klikkkjemi er avhengig av saponering av lipider og inkubasjon med FAFBSA-trinn, samt de delipiderte FBS. Alle fettsyrer må være fullstendig saponert i KOH uten synlige faste stoffer igjen før du fortsetter med inkubasjon med FAFBSA. Dette kan være et vanskelig skritt, og timing er avgjørende. Etter at de saponifiserte fettsyrene har gått i oppløsning ved 65 °C, tilsett varm BSA umiddelbart, da ytterligere oppvarming vil føre til fordampning av DMSO fra fettsyrene. I tillegg vil den saponifiserte etiketten begynne å størkne igjen så snart den begynner å avkjøles. Derfor må FAFBSA være varm og tilsatt raskt etter at saltet er blitt oppløselig. Glassreaksjonsflaskene og deres form er viktige for dette trinnet. De tillater den saponifiserte lipiden å være varm nok til å forbli løselig, mens den er kjølig nok til å sikre at FAFBSA ikke congeal. Tilstrekkelig blanding via pipettering er også viktig på dette trinnet for å sikre en homogen løsning for merking.
Reagensene for klikkkjemi må lagres riktig, vanligvis med tørkemidler eller under N2 - eller Ar-gass ved -20 °C til -80 °C. Mangel på acyleringssignal eller svakt signal kan skyldes ustabile reagenser, spesielt eldre TBTA- og azide-lagerløsninger. Videre må det tas hensyn til fluorescerende azide lagerløsninger, som må beskyttes mot lys så mye som mulig. I tillegg kan det hende at variabler som metode for lipidmangel og merketid må testes for å bestemme de optimale forholdene avhengig av hvilken type celle som brukes. For eksempel kan nevronceller trenge lengre merketider fordi medieforandringer og lipidmangel er vanskelige (upublisert).
Fordelen med denne protokollen er mest dramatisk når den brukes til lengre kjede fettsyrer. For kortere kjeder blir økningen i signalintensiteten mindre dramatisk, men er fortsatt sannsynlig beskyttende for cellene. Mens de foreslåtte modifikasjonene vil forbedre proteinakyleringsdeteksjon generelt, anses klikkkjemi fortsatt som en lipidsentrisk metode1 som er begrenset til påvisning av dynamisk, ikke stabilt S-acylerte proteiner1. Andre begrensninger å vurdere inkluderer kravet om fettsyremangel for å fremme merking, og det relativt begrensede spekteret av kompatible celletyper sammenlignet med acyl-biotinutveksling (ABE) påvisning av S-acylering16. Til tross for disse begrensningene er klikkkjemideteksjon raskere enn de fleste acylutvekslingsanalyser og er bedre egnet for påvisning av proteiner som ikke tolererer de gjentatte proteinutfellingstrinnene som kreves for acylutvekslingsanalyser. I tillegg kan denne tilnærmingen kombineres med samtidig merking ved hjelp av andre klikkanalyser som pulsjaktanalyse38.
Bruken av denne modifikasjonen for metabolsk merking for klikkkjemi økte den totale påvisning av acylaterte proteiner, spesielt S-acylert, med en rekke proteomiske teknikker som brukes i forbindelse med klikkkjemi. Som vist kan fluorogen deteksjon brukes som et alternativ til biotin (figur 1)28. Dette er spesielt nyttig fordi det ikke er noen endogent fluorescerende proteiner i cellen lyser. I tillegg kan fluoroforer som bare aktiveres etter klikkkjemi brukes46. Den saponifiserte og FAFBSA-bundne fettsyren for klikkkjemimerking kan hjelpe med vanskeligheter med å oppdage proteiner av interesse på grunn av en generell økning i mengden etikett som er tilgjengelig i cellen og ved å begrense toksiske effekter av å legge til fettsyrer direkte til media. Det kan også brukes sammen med massespektrometri27 for å øke påvisning av proteiner med lav overflod, spesielt når det tas sammen med den nylige utviklingen ved hjelp av maskinlæringsalgoritmer som forhindrer overflødige målinger for å øke følsomheten for proteiner med lav overflod, i motsetning til eksisterende dataavhengig oppkjøp som favoriserer deteksjon av de mest tallrike proteinene47 . I tillegg kan klikkkjemi kombineres med stabil isotopmerking med aminosyrer i cellekultur (SILAC) og pulsjaktmetoder for å produsere kvantifiserbare data om dynamisk protein S-acylering27. Til slutt har Hannoush-gruppen kombinert klikkkjemi med nærhetsligasjonsanalyse (PLA) for å tillate encellet visualisering og undersøkelser i subcellulær fordeling av palmitoylerte proteiner43,48.

Fettakylering innebærer kovalent tilsetning av fettsyrer til proteiner og er kjent for sin betydning for å fremme proteinmembraninteraksjoner, men har også vist seg å fremme proteinproteininteraksjoner, konformasjonsendringer og regulere katalytiske steder av enzymer1,2,3,4,5,6,7 . Fettakylering har dukket opp som et potensielt legemiddelmål i et utall sykdommer, inkludert infeksjon, kreft, betennelse og nevrodegenerasjon, hvor forstyrrelser i palmitoylering er dokumentert8,9,10,11,12,13. Dette har først og fremst blitt ansporet av utviklingen av nye kjemiske deteksjonsmetoder, som gjorde det mulig å identifisere S-acylerte proteinmål i stor skala.
Fettakylering kan omfatte en rekke modifikasjoner som involverer kovalent tilsetning av mettede og umettede fettsyrer, men refererer vanligvis til N-myristoylering og S-akriylering. N-myristoylering refererer til tilsetning av myristisk syre til N-terminal glyciner enten co-translationally på nascent polypeptider eller post-translationally på nylig eksponerte N-terminal glyciner etter proteolytisk spalting2,14. N-myristoylering skjer gjennom et irreversibel midtbinding. På den annen side refererer S-akriylering vanligvis til den reversible tilsetningen av lange kjedefettsyrer til cysteinrester via en thioesterbinding. Den vanligste formen for denne modifikasjonen inkluderer inkorporering av palmitat og er derfor ofte referert til som S-palmitoylering, eller bare palmitoylering11,15. På mange måter ligner S-palmitoylering fosforylering. Det er dynamisk, enzymatisk regulert, og viser seg å være svært gjennomførbart.
Frem til det siste tiåret ble studier av fettakylering hindret av begrensede deteksjonsmetoder, som krevde radioaktivt merkede fettsyrer. Dette hadde flere ulemper, inkludert kostnader, sikkerhetsproblemer og svært lange deteksjonstider. Vanligvis ble enten tritiated eller jodet palmitate brukt til påvisning av S-acylering16. Tritiated palmitate krevde lange deteksjonsperioder med autoradiografifilm, noe som kan ta uker til måneder. Mens [125I] iodo-fettsyreanaloger forkortet deteksjonstider, presenterte den en mye høyere sikkerhetsrisiko og krevde tett skjoldbruskovervåking av eksperimenter. I tillegg var disse metodene ikke-kvantitative, og begrenset derfor evnen til å måle dynamisk palmitoylering, og også tidkrevende å sette opp og rydde opp på grunn av ekstra personlig verneutstyr og radioaktiv overvåking. Til slutt var radioaktive etiketter ikke godt egnet for proteomiske studier og vanligvis begrenset til lav gjennomstrømningsdeteksjon av spesifikke proteiner av interesse. Etter hvert som flere substrater ble oppdaget, og uunngåelig enzymene som formidler hver modifikasjon ble identifisert, var det klart at nye deteksjonsmetoder var nødvendige17,18,19,20,21. Nesten samtidig oppstod flere nye metoder for påvisning av fettakylerte proteiner. Den første utnytter reversibilitet og reaktivitet av thioester binding av S-akkylering. Acyl-biotin utveksling (ABE) analysen kjemisk erstatter palmitate med biotin for etterfølgende pulldown av S-acylert proteiner ved hjelp av avidin agarose perler og direkte deteksjon av vestlige blot22,23,24. Deretter ble bio-ortogonal merking av fettsyrer og kjemoktivt tillegg til tagger eller håndtak utviklet som inkluderte bruk av Staudinger-ligation og klikkkjemi25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Til slutt, i likhet med ABE, erstatter acylharpiksassistert fangst (RAC) i hovedsak S-acylerte steder med tiolreaktive perler for fangst og påvisning av S-acylaterte proteiner34,35. Sammen har de utvekslings- og klikkkjemibaserte analysene gitt mer effektive og sensitive metoder for acyleringsdeteksjon og affinitetsrensing for nedstrømsanalyse og har senere ført til oppdagelsen av tusenvis av S-acylerte proteiner8,36.
Begrepet klikkkjemi omfatter en gruppe kjemiske reaksjoner, men refererer oftest til Cu(I)-katalysert azido-alkyne [3+2] cycloaddition reaksjonsmekanisme mellom en alkynylgruppe og en azidogruppe27,28,37. Spesielt når det gjelder fettakylering, innebærer klikkkjemi påvisning av S-palmitoylering eller N-myristylering ved å inkorporere bio-ortogonal 16-karbon alkynyl-palmitate (15-heksadecynsyre; 15-HDYA) eller 14-karbon alkynyl-myristate (henholdsvis 13-tetradecynoinsyre; 13-TDYA), i celler for å merke endogene acylerte proteiner28 . Etter cellelys og immunoprecipitation av proteinet av interesse, utføres en klikkkjemireaksjon (kovalente kobling mellom en alkyne og en azide) for å binde en affinitetssonde, vanligvis biotin, for deteksjon av vestlig blot28,37. Alternativt kan klikkkjemi utføres på totalcellelyset, og fettakylerte proteiner kan affinitet renses for identifisering ved massespektrometri. Den første klikkkjemireaksjonen med azido-biotin økte selektiviteten og følsomheten til deteksjon over en million ganger sammenlignet med radioaktivitet2. En annen fordel med klikkkjemi er at den kan kombineres med andre klassiske merkingsmetoder, for eksempel pulsjaktanalyse av proteinomsetning ved hjelp av azido-homoalanin for kvantitativ analyse38. I tillegg kan fluorescerende sonder brukes i stedet for biotin eller andre biokjemiske sonder, for eksempel FLAG- eller Myc-koder, for å undersøke proteinlokalisering16,28,39.
Til tross for den relative brukervennligheten av klikkkjemi, kan deteksjon begrenses av lav løselighet og potensiell toksisitet ved bruk av lange kjedefrie fettsyrer i cellekulturen40. Spesielt, til tross for preferansen av palmitat under S-acylering for de fleste proteiner, har mange studier brukt 18-karbonstearatet (17-oktadecynsyre - 17-ODYA) i stedet for palmitat (15-HDYA) for å oppdage S-acylerte proteiner på grunn av kommersiell tilgjengelighet og relativt lave kostnader. Imidlertid er 17-ODYA veldig uoppløselig og krever spesiell oppmerksomhet når den brukes. I tillegg kan klikkkjemi kreve litt nyansert tilberedning og lagring av kjemikalier. Her beskriver protokollen en merkingstilnærming, som optimaliserer levering ved hjelp av saponering av fettsyrer, levering med fettsyrefri BSA og delipidert fosterbovinserum (FBS) for å øke løseligheten og omgå potensielle toksiske effekter av å legge til frie fettsyrer til celler28. Denne metoden fungerer i en rekke celletyper og har til og med blitt brukt i levende dyr28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>90270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide/bis solution 29:1</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFDye 647 azide plus</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-tris, ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 16,000xg, 4&#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imager</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (1 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid sodium salt monohydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent compatible (DC) assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0231-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>319015CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219989950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blot Turbo Semi-dry transfer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Incubator at 37&#176;C and 5% CO2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement solution</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myristic Acid (25 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M0476-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid (100 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 10x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>450201EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A (synthetic)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-085-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-184-G005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75801-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified)</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal antibody to GFP</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>600-110-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)</td>
			<td>Soltec Ventures</td>
			<td>M115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-043-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Reagent Grade 1L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHEATON NextGen V Vials 3 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry

Fettakylering, den kovalente tilsetningen av mettede fettsyrer til proteinsubstrater, er viktig for å regulere et utall cellulære funksjoner i tillegg til dets implikasjoner i kreft og nevrodegenerative sykdommer. Nylige utviklinger i fettakyleringsdeteksjonsmetoder har gjort det mulig med effektiv og ikke-farlig deteksjon av fettakylerte proteiner, spesielt ved bruk av klikkkjemi med bio-ortogonal merking. Imidlertid kan klikkkjemideteksjon begrenses av dårlig løselighet og potensielle toksiske effekter av å legge til lange kjedefettsyrer til cellekulturen. Beskrevet her er en merking tilnærming med optimalisert levering ved hjelp av saponified fettsyrer i kombinasjon med fettsyrefrie BSA, samt delipidated media, som kan forbedre påvisning av vanskelig å oppdage fett acylated proteiner. Denne effekten ble mest uttalt med alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, som har vært den mest brukte fettsyreanalogen i klikkkjemideteksjon av acylaterte proteiner. Denne modifikasjonen vil forbedre cellulær inkorporering og øke følsomheten for acylert proteindeteksjon. I tillegg kan denne tilnærmingen brukes i en rekke celletyper og kombineres med andre analyser som pulsjaktanalyse, stabil isotopmerking med aminosyrer i cellekultur og massespektrometri for kvantitativ profilering av fettakylerte proteiner.

Forskjellen i merkingseffektivitet mellom saponifiserte og ikke-saponifiserte (ikke-sap) alkynylfettsyrer for klikkkjemideteksjon kan visualiseres og sammenlignes med signalintensiteten til fettakylerte proteiner gjennom vestlig blot (figur 1). En merkbar effekt ble observert med økende lengde på acylkjedene. I celler merket med alkynylsteearate (alk-stear), saponering av fettsyren og levering med BSA for metabolsk merking økte deteksjonen av S-acylert proteinsignal drastisk gjennom klikkkjemi og deteksjon av en fluorescerende azidosonde (figur 1, høyre), noe som tyder på en generell økning i cellulær inkorporering av alkynylfettsyreetiketten. Omvendt ble det ikke observert merkbar forskjell i celler behandlet med den korteste og mest oppløselige fettsyren, alkynyl-myristate (alk-myr; 13-tetradecynsyre eller 13-TDYA). Celler merket med alkynyl-palmitat (figur 1 i midten) viste en mellomliggende økning i etikett sammenlignet med alkynyl-myristate (13-TDYA), men mindre enn alkynyl-stearate.
Viktigst, behandling av PVDF membraner med 0,1 M KOH fjernet i stor grad fettsyreetikettene fra celler inkubert med alkynyl-palmitate og alkynyl-stearate, og bekreftet at flertallet av signalet var gjennom en ester eller thioesterbinding (figur 1, midtre og høyre, bunnpaneler). Som forventet var innlemmelsen av alkynyl-myristate for det meste alkaliresistent (figur 1, venstre, bunnpaneler), på grunn av vedlegg av myristate til proteiner gjennom et amidbinding.
Figur 2 viser allsidigheten og følsomheten til klikkkjemi for å oppdage fettakylering av immunoprecipitated proteiner. HEK293T-celler ble transfektert med myristoylert C-terminal huntingtin (HTT) smeltet sammen til GFP (myr-ctHTT-GFP) og merket med alkynyl-myristate, som tidligere beskrevet18. Etter immunrecipitation ble ctHTT-GFP frigjort fra perlene og utsatt for klikkkjemi sammen med lysates. Ikke bare ble myristoylering av wildtype (WT) myr-ctHTT-GFP påvist i immunoprecipitates, men det ble sterkt oppdaget i lysatene, mens G2A-mutasjonen fullstendig blokkert myristoylering av ctHTT-GFP (figur 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> Figur 1: Påvisning av fettakylerte proteiner ved hjelp av klikkkjemi. HEK293T-celler ble inkubert med de angitte fettsyrene direkte (ikke-sap) eller etter saponering (sap) og inkubasjon med bærerproteinet BSA, som beskrevet i protokoll 2.1-2.7. Alkynylfettsyrer var knyttet til fluorescerende azide ved å utsette 100 μg proteinlysater for å klikke på kjemi, separert av SDS-PAGE, og overført til PVDF-membraner. Etter behandling med 0,1 M Tris pH 7,0 eller 0,1 M KOH, for å reversere thioesterbindinger, ble fettakylering oppdaget ved hjelp av en fluorescerende azide. GAPDH ble brukt som en lastekontroll; anti-GAPDH rhodamin (1:5,000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> Figur 2: Påvisning av N-myristoylert ctHTT-GFP ved hjelp av klikkkjemi. HEK293T-celler ble transfektert med C-terminalt avkortet (ct) og myristoylerbar form for HTT (myr-ctHTT-GFP) og merket med alkynyl-myristate. En ikke-myristoylatbar form med den essensielle glycin erstattet med en alanin ble inkludert (G2A). Etter høsting og lysis ble ctHTT-GFP immunoprecipitated ved hjelp av geit anti-GFP. Lysater ble utsatt for klikkkjemireaksjon (venstre) samt immunoprecipitates etter frigjøring fra perlene. Myristoylering ble oppdaget ved hjelp av Streptavidin Alexa 680 (SA680). GFP ble oppdaget ved hjelp av kanin anti-GFP i kombinasjon med anti-kanin Alexa 488. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> Figur 3: Arbeidsflytskjema for eksperimentell protokoll. Arbeidsflytdisposisjon for de viktigste eksperimentelle trinnene i protokollen. Flere punkter bemerkes hvor protokollen kan settes på pause. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Studien av fettakylering har viktige implikasjoner i cellulære proteininteraksjoner og sykdommer. Presentert her er en modifisert protokoll for å forbedre klikkkjemideteksjon av fettakylerte proteiner, som kan brukes i ulike celletyper og kombinert med andre analyser, inkludert pulsjakt og massespektrometri.

Optimalisert inkorporering av Alkynyl fettsyreanaloger for påvisning av fettakylerte proteiner ved hjelp av klikkkjemi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Denne metoden forbedrer leveringen av fettsyrer til celler og beskytter dem mot de toksiske effektene av fri fettsyrelevering, og sikrer dermed mer konsistent merking. Følsomheten og effektiviteten til klikkkjemideteksjon er avhengig av det effektive opptaket av fettsyreetiketten. Vi har vist at dette i stor grad kan forbedres.Flere trinn i protokollen er svært spesifikke og må følges nøye. En visuell demonstrasjon kan avklare og vise for eksempel hvordan man unngår dannelse av faste stoffer i etikettblandingen. For å forberede merkingsmediet, supplere DMEM med 5% dextran / kullbelagt FBS, 1X penicillin streptomycin, to millimolar L-glutamin og 100 millimolar natriumpyuvat, deretter før 37 grader Celsius før bruk.Vask FORSIKTIG HEK-293 T-cellene belagt en dag før i en seks-brønns vevskulturrett med PBS, og erstatt deretter PBS med merkemedier. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i ca. 45 minutter før du fortsetter til metabolsk merking med fettsyrer. For å saponifisere fettsyreanalogene, pipette minst to mikroliter av alkynylfettsyreanalogen direkte inn i bunnen av et tre milliliter konisk reaksjonshette hetteglass.Pipette en like stor mengde fortynnet kaliumhydroksid nær bunnen av reaksjonsflasken på kanten av glasset slik at det dispenserte volumet av kaliumhydroksidet blandes med fettsyren. Lukk lokket på hetteglasset og trykk forsiktig for å blande løsningene. Varm opp reaksjonshette hetteglasset ved 65 grader Celsius i omtrent fem minutter eller til løsningen blir klar, noe som indikerer at fettsyren er innlemmet.Pass imidlertid på at væsken ikke fordamper for mye. Deretter forvarmes pipette 20% fettsyrefri BSA slik at volumforholdet mellom fettsyrer og kaliumhydroksid til fettsyrefri BSA er 1-1-50, og oppnår en endelig konsentrasjon på 20X BSA-bundet alkynylfettsyrer. Bland løsningen ved å pipettere opp og ned, og inkuber den deretter i 15 minutter ved 37 grader Celsius.Merk HEK-293 T-cellene ved å legge til 20X fettsyreN BSA konjugerer direkte inn i sultmediet for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1%BSA i 25 mikromolar alkynyl myristate eller 100 mikromolar alkynyl palmitate og alkynylstearat. Til sammenligning legger du til ikke-saponerte væsker ved å pipettere to mikrolitere av umerket fettsyre direkte inn i sultmediet, og plasser deretter cellene tilbake i inkubatoren i tre til seks timer. Etter at inkubasjonen er fullført, vask forsiktig cellene med PBS ved romtemperatur, høst og lyse cellene ved å legge til 500 mikroliter EDTA-fri modifisert RIPA-buffer og rotere lysatene i 15 minutter ved fire grader Celsius.Sentrifuger lysatene ved 16.000 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og samle deretter supernatanten i 1,7 milliliter mikrocentrifuge rør og lagre dem på minus 20 grader Celsius. Ta med 50 til 100 mikrogram proteinlysater i 1,7 milliliter mikrocentrifugerør til et likt volum ved hjelp av den EDTA-frie modifiserte RIPA-bufferen. Hold reaksjonsvolumet så lite som mulig.Tilsett STS i hver prøve for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1%Forbered en hovedblanding av klikkreagensene og legg til passende volumer i lysatene, og bland deretter ved å pipettere opp og ned. Inkuber lysatene i mørket i 30 minutter i et 37 graders Celsius vannbad med sporadisk blanding. For immunsipping, bland lysater med kanin anti-GFP og inkuber over natten med rotasjon ved fire grader Celsius.Tilsett 15 til 20 mikroliter magnetiske perler forhåndsjustert med 0,1% SDS RIPA til hvert rør og la det reagere ende over ende ved fire grader Celsius i tre timer. Vask perlene med lysisbuffer og resuspend i 45 mikroliter med 50 millimolar HEPES buffer som inneholder 1%SDS. Varm perlene ved 80 grader Celsius i 15 minutter.Under inkubasjonen, snu eller rørene omtrent hvert femte minutt, og spinn deretter kort alle rørene. Mens prøvene fortsatt er varme, samle supernatanten som inneholder proteinene. Kombiner 43 mikroliter av supernatanten med syv mikroliter av klikkreagenser master mix og la dem reagere i mørket i 30 minutter ved 37 grader Celsius.På en vestlig tomt ble det observert en merkbar effekt i merkingseffektiviteten for klikkkjemideteksjon mellom saponifiserte og ikke-saponifiserte alkynylfettsyrer med en økende lengde på acylkjedene. I celler merket med alkynylstearat økte saponering av fettsyren og leveringen med BSA for metabolsk merking drastisk påvisning av S-acylert proteinsignal gjennom klikkkjemi og deteksjon av en fluorescerende azitoprobe, noe som tyder på en generell økning i cellulær inkorporering av alkynylfettsyreetiketten. Omvendt ble det ikke observert merkbar forskjell i celler behandlet med den korteste og mest oppløselige fettsyren alkynyl myristate.Celler merket med alkynyl palmitate viste en mellomliggende økning i etiketten sammenlignet med alkynyl myristate, men mindre enn alkynylstearat. Viktigst, behandling av PVDF membraner med 0,1 molar kaliumhydroksid fjernet i stor grad fettsyreetikettene fra celler inkubert med alkynyl palmitate og alkynylstearatet, og bekreftet at flertallet av signalet var gjennom en ester eller thioesterbinding. Som forventet var inkorporering av alkynyl myristate for det meste alkaliresistent på grunn av vedlegg av myristate til proteiner gjennom et amidbinding.Etter klikkkjemi ble myristoylering av vill type myristoylert C-terminal Huntington GFP oppdaget i immunoprecipitates, samt lysates, mens G2A-mutasjonen fullstendig blokkert myristoylering av C-terminal Huntington GFP. Etter klikkkjemi kan vi utføre affinitetsrensing av fettakylerte proteiner for massespektrometri. Dette kan gi en annen profil av fettakylerte proteiner ved å beskytte celler mot toksisitet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identifisering av fettsyrer i<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyse av en Ni-Schiff-basekompleks ved hjelp av betingelser som er egnet for oppbevaring av syre-labil beskyttelsesgrupper

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimalisert protokoll for ekstraksjon av proteiner fra Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fettsyrer 13C Isotopologue profilering gir innsikt i Trophic karbon overføring og Lipid metabolismen av virvelløse forbrukere

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation

Genetisk innlemmelse av Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og sin søknad til Protein Bøyning

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fangst og identifikasjon av RNA-bindende proteiner ved hjelp av Klikk kjemi-assistert RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av lipoprotein partikler fra Chicken egg eggeplomme for studier av bakteriell patogen fatty acid innlemmelse i membran fosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Klikkkjemibasert fluorometrisk analyse for apolipoprotein N-acyltransferase fra enzymkarakterisering til høy gjennomstrømningsscreening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte