Name: optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

Эта работа финансировалась Национальным советом по научным и инженерным исследованиям (NSERC; РГПИН-2019-04617). Лючия Ляо финансировалась Мемориальной стипендией Рама и Лекхи Тумкур через кафедру биологии в Университете Ватерлоо и Мемориальной стипендией Люси Моррисон через IODE Онтарио, в дополнение к финансированию исследований выпускников из Университета Ватерлоо, включая аспирантуру (50503-11072), премию для выпускников науки и ассистента преподавателя для выпускников. Авторы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Мартина за их поддержку в подготовке этой рукописи, в частности Стефани Райалл, Харлин Гилл и Садию Хан, которые помогли первоначально создать лабораторию Мартина в подготовке к этим исследованиям. Авторы также хотели бы поблагодарить доктора Люка Бертиома за добрый подарок конструкций ctHTT-GFP и доктора Шона Сандерса за критический вклад в подготовку рукописи. Рисунок 3 был создан с помощью BioRender.com.

Авторам нечего раскрывать.

Прямое добавление жирных кислот к клеткам в культуре может привести к нерастворимости, осаждению липидов и липотоксичности40. Следовательно, добавление жирных кислот непосредственно в клетки может привести не только к плохому поглощению клеток и низкой доступности метки жирных кислот, но и к уменьшению количества жизнеспособных клеток для последующего анализа, а также к активации нецелевых путей. Тем не менее, многие протоколы метаболической маркировки для обнаружения химии щелчков включают прямое добавление жирных кислот и большое количество исследований пальмитоил-протеома с использованием обнаружения химии щелчков на сегодняшний день редко омыляют этикетки жирных кислот или инкубируют их с помощью BSA8,36. Важно учитывать тот факт, что эффективность и чувствительность химического обнаружения жирно-ацилированных белков зависят от достаточного клеточного поглощения аналогов жирных кислот. Поэтому разумно предположить, что многие S-ацилированные белки, возможно, избежали обнаружения в протеомных исследованиях из-за низкой доступности меток жирных кислот из-за плохого включения в клетки, особенно когда использовалась жирная кислота с более длинной цепью 17-ODYA. 17-ODYA, или алкинил-стеарат, был широко используемой этикеткой выбора для нескольких исследований из-за его коммерческой доступности и его раннего использования8,36. Однако результаты этого протокола показывают, что омыление 17-ODYA приводит к наибольшему увеличению обнаружения S-ацилированных белков по сравнению с жирными кислотами с более короткой цепью, такими как пальмитат или миристат. Поэтому повторение этих экспериментов с омыленными метками может дать дополнительные субстраты S-ацилирования, которые, возможно, ранее были упущены из виду. Кроме того, в то время как большинство пальмитоилацилтрансфераз предпочитают пальмитат для S-ацилирования, некоторые из них имеют предпочтения для других длин жирных кислот, таких как стеарат15,38,44. Кроме того, некоторые белки или даже определенные участки в белках предпочитают одну жирную кислоту другой15,45. Таким образом, исследования с использованием 17-ODYA могут иметь уклон в сторону белков S-ацилированных стеаратом, а не пальмитатом, а также недостаточно представлять эти белки из-за более низкого обнаружения.
Улучшенная эффективность метаболической маркировки для химии щелчков зависит от омыления липидов и инкубации с помощью этапов FAFBSA, а также делипидированного FBS. Все жирные кислоты должны быть полностью омылены в KOH без видимых твердых веществ, прежде чем приступать к инкубации с FAFBSA. Это может быть трудным шагом, и время имеет решающее значение. После того, как омыленные жирные кислоты вошли в раствор при 65 °C, немедленно добавьте теплый BSA, так как дальнейший нагрев вызовет испарение DMSO из жирных кислот. Кроме того, омыленная этикетка начнет повторно затвердевать, как только начнет остывать. Поэтому FAFBSA должна быть теплой и быстро добавляться после того, как соль стала растворимой. Стеклянные реакционные флаконы и их форма важны для этого этапа. Они позволяют омыленному липиду быть достаточно теплым, чтобы оставаться растворимым, в то время как достаточно холодным, чтобы гарантировать, что FAFBSA не застынет. Достаточное перемешивание путем пипетки также важно на этом этапе для обеспечения однородного раствора для маркировки.
Реагенты для химии щелчка должны быть надлежащим образом сохранены, как правило, с осушителями или под N2 или Ar газом при температуре от -20 °C до -80 °C. Отсутствие сигнала ацилирования или слабый сигнал может быть вызвано нестабильными реагентами, особенно старыми растворами TBTA и азидов. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность с флуоресцентными растворами азида, которые должны быть максимально защищены от света. Кроме того, такие переменные, как метод липидной депривации и время маркировки, возможно, потребуется протестировать для определения оптимальных условий в зависимости от типа используемой клетки. Например, нейрональным клеткам может потребоваться более длительное время маркировки, потому что изменения среды и липидная депривация затруднены (не опубликованы).
Польза этого протокола наиболее драматична при использовании для длинноцепочечных жирных кислот. Для более коротких цепей увеличение интенсивности сигнала становится менее драматичным, но по-прежнему, вероятно, защищает клетки. В то время как предлагаемые модификации улучшат обнаружение ацилирования белка в целом, химия щелчков по-прежнему считается липидоцентричным методом1, который ограничен обнаружением динамически, а не стабильно S-ацилированных белков1. Другие ограничения, которые следует учитывать, включают требование депривации жирных кислот для стимулирования маркировки и ее относительно ограниченный диапазон совместимых типов клеток по сравнению с обнаружением ацил-биотинового обмена (ABE) S-ацилирования16. Несмотря на эти ограничения, обнаружение химии щелчков происходит быстрее, чем большинство ацилообменных анализов, и лучше подходит для обнаружения белков, которые не переносят повторные этапы осаждения белка, необходимые для ацилообменных анализов. Кроме того, этот подход можно комбинировать с одновременной маркировкой с использованием других анализов щелчков, таких как анализ погони за импульсами38.
Использование этой модификации для метаболической маркировки химии щелчков увеличило общее обнаружение ацилированных белков, особенно S-ацилированных, с различными протеомными методами, которые используются в сочетании с химией щелчков. Как показано, фторогенное обнаружение может быть использовано в качестве альтернативы биотину (рисунок 1)28. Это особенно полезно, потому что в лизатах клеток нет эндогенно флуоресцентных белков. Кроме того, можно использовать флуорофоры, которые активируются только после щелчка химии46. Омыленная и связанная с FAFBSA жирная кислота для маркировки химии щелчка может помочь с трудностями обнаружения белков, представляющих интерес из-за общего увеличения количества этикетки, доступной в клетке, и путем ограничения токсических эффектов добавления жирных кислот непосредственно в среду. Он также может быть использован в сочетании с масс-спектрометрией27 для улучшения обнаружения белков с низким содержанием, особенно в сочетании с недавним прогрессом с использованием алгоритмов машинного обучения, предотвращающих избыточные измерения для повышения чувствительности к белкам с низким содержанием, в отличие от существующего зависимого от данных сбора, который способствует обнаружению наиболее распространенных белков47. . Кроме того, химия щелчков может быть объединена со стабильной изотопной маркировкой аминокислотами в клеточной культуре (SILAC) и методами погони за импульсами для получения количественных данных о динамическом S-ацилировании белка27. Наконец, группа Ханнуша объединила химию щелчков с анализом бесконтактного лигирования (PLA), чтобы обеспечить визуализацию и исследование одноклеточной визуализации и исследования субклеточного распределения пальмитоилированных белков43,48.

Жировое ацилирование включает в себя ковалентное добавление жирных кислот к белкам и хорошо известно своей важностью в стимулировании белково-мембранных взаимодействий, но также было показано, что оно способствует белково-белковым взаимодействиям, конформационным изменениям и регулирует каталитические участки ферментов1,2,3,4,5,6,7 . Жировая ацилляция стала потенциальной мишенью для лекарств при множестве заболеваний, включая инфекцию, рак, воспаление и нейродегенерацию, где были задокументированы нарушения пальмитоилирования8,9,10,11,12,13. Это было в первую очередь стимулировано разработкой новых методов химического обнаружения, которые позволили крупномасштабно идентифицировать S-ацилированные белковые мишени.
Жировое ацилирование может включать в себя различные модификации, включающие ковалентное добавление насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, но обычно относится к N-миристоилированию и S-ацилированию. N-миристоилирование относится к добавлению миристиновой кислоты к N-концевым глицинам либо котрансляционно на зарождающихся полипептидах, либо посттрансляционно на вновь подвергшихся воздействию N-концевых глицинов после протеолитического расщепления2,14. N-миристоилирование происходит через необратимую амидную связь. С другой стороны, S-ацилирование обычно относится к обратимому добавлению длинноцепочечных жирных кислот к остаткам цистеина через тиофирную связь. Наиболее распространенная форма этой модификации включает включение пальмитата и, следовательно, обычно упоминается как S-пальмитоилирование, или просто пальмитоилирование11,15. Во многом S-пальмитоилирование похоже на фосфорилирование. Он динамичен, ферментативно регулируется и оказывается очень податливым.
Вплоть до последнего десятилетия изучение жирового ацилирования затруднялось ограниченными методами обнаружения, которые требовали радиоактивно меченых жирных кислот. Это имело несколько недостатков, включая стоимость, проблемы безопасности и очень длительное время обнаружения. Как правило, для обнаружения S-ацилирования16 использовали либо тритиированный, либо йодированный пальмитат. Тритиированный пальмитат требует длительных периодов обнаружения с ауторадиографической пленкой, которые могут занять от нескольких недель до месяцев. В то время как [125I] аналоги йодо-жирных кислот сокращали время обнаружения, они представляли гораздо более высокий риск безопасности и требовали тщательного мониторинга щитовидной железы экспериментаторов. Кроме того, эти методы были неколичественными, поэтому ограничивали возможность измерения динамического пальмитоилирования, а также трудоемкие для настройки и очистки из-за дополнительных средств индивидуальной защиты и радиоактивного мониторинга. Наконец, радиоактивные метки не очень хорошо подходили для протеомных исследований и обычно ограничивались обнаружением специфических белков, представляющих интерес, с низкой пропускной способностью. По мере того, как было обнаружено больше субстратов и неизбежно были идентифицированы ферменты, опосредующие каждую модификацию, стало ясно, что требуются новые методы обнаружения17,18,19,20,21. Практически одновременно возникло несколько новых методов обнаружения жировых ацилированных белков. Первый использует обратимость и реакционную способность тиоэфирной связи S-ацилирования. Анализ ацил-биотинового обмена (ABE) химически заменяет пальмитат биотином для последующего вытягивания S-ацилированных белков с использованием шариков авидина агарозы и прямого обнаружения западным блотом22,23,24. Затем была разработана биоортогональная маркировка жирных кислот и хемоселективное добавление к меткам или ручкам, которые включали использование лигирования Штаудингера и химии щелчков25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Наконец, подобно ABE, захват с помощью ацил-смолы (RAC) по существу заменяет S-ацилированные участки тиол-реактивными шариками для захвата и обнаружения S-ацилированных белков34,35. В совокупности анализы обмена и щелковой химии обеспечили более эффективные и чувствительные методы обнаружения ацилирования и аффинной очистки для последующего анализа и впоследствии привели к открытию тысяч S-ацилированных белков8,36.
Термин щелкающая химия охватывает группу химических реакций, но чаще всего относится к Cu(I)-катализируемому азидо-алкину [3+2] механизму реакции циклоприсоединения между алкиниловой группой и азидогруппой27,28,37. В частности, в случае жирового ацилирования химия щелчка включает обнаружение S-пальмитоилирования или N-миристилирования путем включения биоортогонального 16-углеродного алкинил-пальмитата (15-гексадециновая кислота; 15-HDYA) или 14-углеродного алкинил-миристата (13-тетрадециновая кислота; 13-TDYA), соответственно, в клетки для маркировки эндогенно ацилированных белков28 . После лизиса клеток и иммунопреципитации интересующего белка проводится химическая реакция щелчка (ковалентная связь между алкином и азидом) для связывания аффинного зонда, обычно биотина, для обнаружения западным блотом28,37. Альтернативно, щелкающая химия может быть выполнена на общем клеточном лизате, а жирные ацилированные белки могут быть аффинно очищены для идентификации с помощью масс-спектрометрии. Начальная щелчок химической реакции с азидо-биотином повысила селективность и чувствительность обнаружения более чем в миллион раз по сравнению с радиоактивностью2. Еще одним преимуществом щелковой химии является то, что ее можно комбинировать с другими классическими методами маркировки, такими как импульсный анализ оборота белка с использованием азидо-гомоаланина для количественного анализа38. Кроме того, флуоресцентные зонды могут использоваться вместо биотина или других биохимических зондов, таких как метки FLAG или Myc, для изучения локализации белка16,28,39.
Несмотря на относительную простоту использования щелкающей химии, обнаружение может быть ограничено низкой растворимостью и потенциальной токсичностью использования длинноцепочечных свободных жирных кислот в клеточной культуре40. В частности, несмотря на предпочтение пальмитата во время S-ацилирования для большинства белков, во многих исследованиях использовался 18-углеродный стеарат (17-октадециновая кислота - 17-ODYA), а не пальмитат (15-HDYA) для обнаружения S-ацилированных белков из-за его коммерческой доступности и относительно низкой стоимости. Тем не менее, 17-ODYA очень нерастворим и требует особого внимания при использовании. Кроме того, щелкающая химия может потребовать некоторой тонкой подготовки и хранения химических веществ. В настоящем документе описывается подход к маркировке, который оптимизирует доставку с использованием омыления жирных кислот, доставки с BSA без жирных кислот и делипидированной фетальной бычьей сывороткой (FBS) для повышения растворимости и обхода потенциальных токсических эффектов добавления свободных жирных кислот в клетки28. Этот метод работает в различных типах клеток и даже использовался у живых животных28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>90270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide/bis solution 29:1</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFDye 647 azide plus</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-tris, ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 16,000xg, 4&#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imager</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (1 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid sodium salt monohydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent compatible (DC) assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0231-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>319015CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219989950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blot Turbo Semi-dry transfer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Incubator at 37&#176;C and 5% CO2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement solution</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myristic Acid (25 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M0476-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid (100 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 10x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>450201EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A (synthetic)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-085-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-184-G005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75801-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified)</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal antibody to GFP</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>600-110-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)</td>
			<td>Soltec Ventures</td>
			<td>M115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-043-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Reagent Grade 1L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHEATON NextGen V Vials 3 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry

Жировое ацилирование, ковалентное добавление насыщенных жирных кислот к белковым субстратам, важно для регулирования множества клеточных функций в дополнение к его последствиям при раке и нейродегенеративных заболеваниях. Последние разработки в области методов обнаружения жирового ацилирования позволили эффективно и неопасно обнаруживать жирные ацилированные белки, в частности, за счет использования химии щелчков с биоортогональной маркировкой. Тем не менее, обнаружение химии щелчка может быть ограничено плохой растворимостью и потенциальными токсическими эффектами добавления длинноцепочечных жирных кислот в клеточную культуру. Здесь описан подход к маркировке с оптимизированной доставкой с использованием омыленных жирных кислот в сочетании с BSA, не содержащим жирных кислот, а также делипидированных сред, которые могут улучшить обнаружение трудно обнаруживаемых жирных ацилированных белков. Этот эффект был наиболее выражен с аналогом алкинил-стеарата, 17-ODYA, который был наиболее часто используемым аналогом жирных кислот в химическом обнаружении ацилированных белков. Эта модификация улучшит клеточную инкорпорацию и повысит чувствительность к обнаружению ацилированного белка. Кроме того, этот подход может применяться в различных типах клеток и сочетаться с другими анализами, такими как анализ погони за импульсами, маркировка стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре и масс-спектрометрия для количественного профилирования жирных ацилированных белков.

Разница в эффективности маркировки между омыленными и неагломеренными (без сока) алкиниловыми жирными кислотами для обнаружения химии щелчков может быть визуализирована и сравнена по интенсивности сигнала жирных ацилированных белков через вестерн-блот (рисунок 1). Заметный эффект наблюдался при увеличении длины ацильных цепей. В клетках, меченных алкинил-стеаратом (alk-stear), омыление жирных кислот и доставка BSA для метаболической маркировки резко увеличили обнаружение сигнала S-ацилированного белка через химию щелчков и обнаружение флуоресцентным зондом азидо (рисунок 1, справа), что свидетельствует об общем увеличении клеточного включения метки алкиниловых жирных кислот. И наоборот, не наблюдалось заметной разницы в клетках, обработанных самой короткой и наиболее растворимой жирной кислотой, алкинилмиристатом (алк-мир; 13-тетрадециновая кислота или 13-ТДЯ). Клетки, меченные алкинилпальмитатом (рисунок 1, середина), показали промежуточное увеличение метки по сравнению с алкинил-миристатом (13-TDYA), но меньше, чем алкинил-стеарат.
Важно отметить, что обработка PVDF-мембран с 0,1 М КОН в значительной степени удаляла метки жирных кислот из клеток, инкубированных алкинилпальмитатом и алкинилстеаратом, подтверждая, что большая часть сигнала проходила через эфирную или тиофирную связь (рисунок 1, средняя и правая, нижние панели). Как и ожидалось, включение алкинил-миристата было в основном щелочестойким (рисунок 1, слева, нижние панели), из-за прикрепления миристата к белкам через амидную связь.
Рисунок 2 демонстрирует универсальность и чувствительность химии щелчков для обнаружения жирового ацилирования иммунопреципитированных белков. Клетки HEK293T трансфектировали миристоилированным С-концевым гентингтином (HTT), слитым с GFP (myr-ctHTT-GFP) и помеченным алкинил-миристатом, как описано ранее18. После иммунопреципитации ctHTT-GFP высвобождался из шариков и подвергался щелчковой химии вместе с лизатами. Миристоилирование дикого типа (WT) myr-ctHTT-GFP не только было обнаружено в иммунопреципитатах, но и было сильно обнаружено в лизатах, тогда как мутация G2A полностью блокировала миристоилирование ctHTT-GFP (рисунок 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> Рисунок 1: Обнаружение жирных ацилированных белков с помощью щелчковой химии. Клетки HEK293T инкубировали с указанными жирными кислотами непосредственно (без сока) или после омыления (сока) и инкубации с белком-носителем BSA, как описано в протоколе 2.1-2.7. Алкиниловые жирные кислоты связывали с флуоресцентным азидом путем подвергания 100 мкг белковых лизатов щелкающей химии, разделенной SDS-PAGE и перенесенной на мембраны PVDF. После обработки 0,1 М Трис рН 7,0 или 0,1 М КОН, чтобы обратить вспять тиоэфирные связи, жирное ацилирование было обнаружено с использованием флуоресцентного азида. В качестве регулятора нагрузки использовался GAPDH; анти-GAPDH родамин (1:5,000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> Рисунок 2: Обнаружение N-миристоилированного ctHTT-GFP с помощью щелковой химии. Клетки HEK293T трансфектировали С-терминально усеченной (ct) и миритоилатируемой формой HTT (myr-ctHTT-GFP) и маркировали алкинил-миристатом. Была включена немиристоилатируемая форма с существенным глицином, замененным аланином (G2A). После сбора урожая и лизиса ctHTT-GFP был иммунопреципитирован с использованием козьего анти-GFP. Лизаты подвергали химической реакции щелчка (слева), а также иммунопреципитатам после высвобождения из шариков. Миристоилирование было обнаружено с помощью Стрептавидина Alexa 680 (SA680). GFP был обнаружен с использованием анти-GFP кролика в сочетании с анти-rabbit Alexa 488. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> Рисунок 3: Схема рабочего процесса экспериментального протокола. Описание рабочего процесса основных экспериментальных шагов в протоколе. Отмечено несколько моментов, где протокол может быть приостановлен. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Изучение жирового ацилирования имеет важное значение для клеточных белковых взаимодействий и заболеваний. Здесь представлен модифицированный протокол для улучшения химического обнаружения жировых ацилированных белков, который может применяться в различных типах клеток и сочетаться с другими анализами, включая импульсную погоню и масс-спектрометрию.

Оптимизированное включение аналогов алкиниловых жирных кислот для обнаружения жирных ацилированных белков с помощью Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Этот метод улучшает доставку жирных кислот к клеткам и защищает их от токсического воздействия доставки свободных жирных кислот, обеспечивая тем самым более последовательную маркировку. Чувствительность и эффективность обнаружения химии щелчков зависят от эффективного поглощения этикетки жирных кислот. Мы показали, что это можно в значительной степени улучшить.Некоторые этапы протокола являются весьма конкретными и требуют тщательного соблюдения. Визуальная демонстрация может прояснить и показать, например, как избежать образования твердых веществ в маркировочной смеси. Чтобы подготовить этикетировочную среду, дополните DMEM 5% декстраном / древесным углем, покрытым FBS, 1X пенициллином стрептомицином, двумя миллимолярами L-глютамина и 100 миллимолярным пируватом натрия, затем предварительно прогрейте его до 37 градусов Цельсия перед использованием.Аккуратно вымойте Т-клетки HEK-293, покрытые за день до этого, в чашке для культивирования тканей с шестью лунками pBS, а затем замените PBS маркировочной средой. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение примерно 45 минут, прежде чем перейти к метаболической маркировке жирными кислотами. Чтобы омылить аналоги жирных кислот, пипетка по меньшей мере двух микролитров аналога алкиниловой жирной кислоты непосредственно в дно трехмиллилитрового конического реакционного флакона.Пипетка с равным количеством разбавленного гидроксида калия близка к дну реакционного флакона по краю стакана таким образом, чтобы дозированный объем гидроксида калия смешивался с жирной кислотой. Закройте крышку флакона и осторожно постучите, чтобы перемешать растворы. Нагревайте реакционный флакон при 65 градусах Цельсия в течение примерно пяти минут или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным, указывая на то, что жирная кислота была включена.Однако позаботьтесь о том, чтобы жидкость не испарялась слишком сильно. Далее пипетку предварительно нагревают 20% без жирных кислот BSA таким образом, что объемное отношение жирных кислот к гидроксиду калия к BSA без жирных кислот составляет 1-1-50, достигая конечной концентрации 20X BSA-связанных алкиниловых жирных кислот. Перемешайте раствор путем пипетки вверх и вниз, затем высиживайте его в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия.Маркируют Т-клетки HEK-293 путем добавления конъюгата 20X жирных кислот BSA непосредственно в среду голодания для достижения конечной концентрации 1% BSA в 25 микромолярного алкинилмиристате или 100 микромоляльных алкинилпальмитате и алкинилстеарате. Для сравнения, добавьте омыленные жидкости, пипетируя два микролитра немаркированной жирной кислоты непосредственно в среду голодания, а затем поместите клетки обратно в инкубатор на три-шесть часов. После того, как инкубация завершена, осторожно промыть клетки PBS при комнатной температуре, затем собрать и лизировать клетки, добавив 500 микролитров модифицированного буфера RIPA без ЭДТА и вращая лизаты в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.Центрифугируйте лизаты в 16 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, затем соберите супернатант в 1,7-миллилитровые микроцентрифужные трубки и храните их при минус 20 градусах Цельсия. Доведите от 50 до 100 микрограммов белковых лизатов в 1,7-миллилитровых микроцентрифужных трубках до равного объема, используя модифицированный буфер RIPA без ЭДТА. Держите объем реакции как можно меньше.Добавьте STS к каждому образцу, чтобы достичь конечной концентрации 1% Подготовьте мастер-смесь реагентов и добавьте соответствующие объемы в лизаты, а затем перемешайте путем пипетирования вверх и вниз. Инкубируйте лизаты в темноте в течение 30 минут на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия с периодическим перемешиванием. Для иммунопреципитации смешайте лизаты с анти-GFP кролика и инкубируйте в течение ночи с вращением при четырех градусах Цельсия.Добавьте в каждую трубку от 15 до 20 микролитров магнитных шариков, предварительно уравновешенных 0,1% SDS RIPA, и дайте ей вступить в реакцию при четырех градусах Цельсия в течение трех часов. Бусины промыть буфером лизиса и повторно суспендировать в 45 микролитрах 50-миллимолярного буфера HEPES, содержащего 1% SDS. Нагревайте бусины при 80 градусах Цельсия в течение 15 минут.Во время инкубации инвертируйте или перемешивайте трубки примерно каждые пять минут, затем ненадолго раскрутите все трубки. Пока образцы еще теплые, соберите супернатант, содержащий белки. Соедините 43 микролитра супернатанта с семью микролитрами мастер-смеси реагентов и дайте им вступить в реакцию в темноте в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.На западном графике наблюдался заметный эффект в эффективности маркировки для обнаружения химии щелчка между омыленными и неомыленными алкиниловыми жирными кислотами с увеличением длины ацильных цепей. В клетках, меченных алкинилстеаратом, омыление жирной кислоты и доставка BSA для метаболической маркировки резко увеличили обнаружение сигнала S-ацилированного белка через химию щелчка и обнаружение флуоресцентным азотопробом, что свидетельствует об общем увеличении клеточного включения метки алкиниловых жирных кислот. И наоборот, не наблюдалось заметной разницы в клетках, обработанных самым коротким и наиболее растворимым жирным кислотным алкинилмиристатом.Клетки, помеченные алкинилпальмитатом, показали промежуточное увеличение метки по сравнению с алкинилмиристатом, но меньше, чем алкинилстеарат. Важно отметить, что обработка мембран PVDF 0,1 молярным гидроксидом калия в значительной степени удаляла метки жирных кислот из клеток, инкубированных алкинилпальмитатом и алкинилстеаратом, подтверждая, что большая часть сигнала проходила через эфир или тиофирную связь. Как и ожидалось, включение алкинилмиристата было в основном щелочно-устойчивым из-за прикрепления миристата к белкам через амидную связь.После щелковой химии в иммунопреципитатах, а также лизатах было обнаружено миристоилирование миристоилированного С-концевого GFP Гентингтона дикого типа, тогда как мутация G2A полностью блокировала миристоилирование С-концевого ГФП Хантингтона. Следуя химии щелчка, мы можем выполнить аффинную очистку жирных ацилированных белков для масс-спектрометрии. Это может дать другой профиль жировых ацилированных белков, защищая клетки от токсичности.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Определение жирных кислот в<em&gt; Эхиноцереус бациллы</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Гидролиз Ni-Шифф-Base комплекс Использование Условия Пригодные для удержания кислотно-лабильных защитных групп

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Оптимизированный протокол для извлечения белков из митрального клапана человека

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Жирные кислоты 13C Isotopologue профилирования обеспечивает проницательность в трофических углерода передачи и метаболизма липидов беспозвоночных потребителей

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation

Генетическая включение Biosynthesized L-Диоксифенилаланин (ДОПЫ) и ее применение для белка спряжение

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Изоляция частиц липопротеинов из куриного яичного желтка для изучения бактериального патогена жирной кислоты Инкорпорации в Мембрана фосфолипиды

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Кинетический скрининг nuclease деятельности с использованием нуклеиновой кислоты зондов

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Флюорометрический анализ на основе Click-Химии для аполипопротеин N-ацилтрансферазы от характеристики ферментов до высокопроизводительного скрининга

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации