Name: transplantation of neonatal mouse cardiac macrophages into adult mice
Uploaded: 2021-03-20T14:30:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS, 2016-I2M-1-015), National Key Research and Development Project of China (2019YFA0801500), National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81970243, 81770308), Beijing Natural Science Foundation (7172183, 7182140).

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen til brug og pleje af laboratoriedyr. Alle dyreprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences. Aseptisk teknik er påkrævet under hele proceduren for at forhindre forurening af det kirurgiske sted.
1. Apical resektion operation i neonatal 1-dag gamle Cx3cr1 GFP / + mus(C57BL/6 baggrund)
<ol><li>Anæstesi<ol>
<li>Tag alle museungerne ud af burene og læg dem i en ren tør kasse.</li>
		<li>Integrer hver mus i isen i ca. 2-3 minutter. Sørg for, at der er en tynd barriere såsom latex eller gaze mellem isen og museungen for at forhindre forfrysninger.</li>
		<li>Identificer tilstrækkelig anæstesi ved at observere for følgende tegn: bleg hud, manglende lemmer bevægelse, og mangel på pedal refleks.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Thoracotomi<ol>
<li>Precool bronze driftsplatform natten over ved -20 °C for at hjælpe med at opretholde anæstesi.</li>
		<li>Tag den bedøvede mus ud af iskassen og læg den på en bronze driftsplatform. Forankre musen på driftsplatformen i en liggende position ved hjælp af medicinsk tape.</li>
		<li>Sæt betjeningsplatformen med musen på den under et stereoskop.</li>
		<li>Desinficer musekisten ved hjælp af en prep pad gennemblødt med betadin og 70% alkohol eller i overensstemmelse med den institutionelle politik.</li>
		<li>Incise huden med en 1 cm skåret på den fjerde intercostal område af brysthulen og derefter adskille intercostal muskler ved hjælp af mikrokirurgisk saks, indtil hjertet er tilgængelig.</li>
		<li>Tryk skiftevis på brystet og maven ved hjælp af to sammenkrulninger, indtil hjertet er udvendigt ud af brystet uden mekanisk skade.</li>
		<li>Sæt ribbenene under og over det lille snit som en naturlig fiksering for at immobilisere hjertet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ventrikulær apex resektion<ol>
<li>Find toppen af venstre ventrikel. Skær en 1 mm diameter af ventrikulær spidsvæv ved hjælp af iridektomi saks under et stereoskop.</li>
		<li>Bekræft, at venstre ventrikulære kammer er udsat, og begynde oser.</li>
		<li>Tryk forsigtigt hjertet tilbage til brysthulen ved hjælp af en vatpind.</li>
		<li>Sutur muskler, ribben, og hud ved hjælp af 8-0 Prolene suturer.</li>
		<li>Rengør musen grundigt efter operationen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pleje efter operationen<ol>
<li>Overfør musen fra driftsplatformen til et 37 °C varmetæppe for at varme kroppen op umiddelbart efter operationen.</li>
		<li>Bekræft musens anabiose ved at observere for følgende tegn: spontan respiration restaurering, hudfarveændring fra bleg til pink og bevægelse af lemmer.</li>
		<li>Tag den opererede mus tilbage til sin mor, når den er kommet sig.</li>
		<li>Bland den opererede mus med moderens redematerialer, hvis det er nødvendigt. BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne alle de 1-dages gamle hvalpe fra moderen på én gang og derefter returnere dem alle på én gang, når alle hvalpene er kommet sig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Forberedelse af neonatal hjerte makrofag suspension
BEMÆRK: Alle disse forsøgsprocedurer skal udføres på et mørkt sted og under sterile forhold.
<ol><li>Høst hjertet af en neonatal Cx3cr1GFP/+ mus 1-dag efter apikal resektion<ol>
<li>Aflive Cx3cr1GFP/+ musen en dag efter den apikale resektion. Brug et overskud af kuldioxid og halshugge musen sekventielt at anvende aktiv dødshjælp.</li>
		<li>Tag hjertet ud af brystet og sænk det i en 10 cm skål med PBS.</li>
		<li>Skær karrene og resterende bindevæv væk fra hjertekamrene. Skær auricular tillæg og udstrømning tarmkanalen væk fra hjertet.</li>
		<li>Når hjertet holder op med at slå, skæres hjertet i 1-2 mm3 stykker i PBS buffer ved hjælp af mikrokirurgisk saks (Figur 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neonatal mus hjerte dissociation<ol>
<li>Det høstede hjertevæv overføres til et rør, der indeholder 2,5 mL forvarmet enzymblanding (Materialetabel), og røret lukkes tæt.</li>
		<li>Vend røret og læg det med hætten ned (Figur 2B).</li>
		<li>Kør neonatal hjerte dissociation program (Tabel over materialer).</li>
		<li>Tag røret ud af dissociatoren, når programmet er afsluttet.</li>
		<li>Tilsæt 7,5 mL 1x DMEM med 10% FBS til røret.</li>
		<li>Filtrer og overfør suspensionen til et 15 mL centrifugerør (Figur 2C). Centrifuge celleaffjedringen ved 300 x g i 5 minutter.</li>
		<li>Brug cellepillen igen i 1 mL blodcelle lysisopløsning og inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur.</li>
		<li>Der tilsættes 5-10 mL PBS-buffer til affjedringen og centrifugen ved 300 x g i 5 minutter.</li>
		<li>Resuspend celle pellet i 1 mL af DMEM med 10% FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neonatal hjerte makrofag isolation<ol>
<li>Sorter GFP+ neonatale hjertemakrofager efter FACS. De sorterede makrofager modtages i et sterilt rør, der indeholder 500 μL DMEM med 10% FBS.</li>
		<li>Tæl GFP+ makrofager (Figur 2D). Resuspend makrofaget i DMEM med 10% FBS i koncentration af 1 x 106 makrofager pr. 200 μL DMEM til senere injektion. BEMÆRK: Antallet af GFP+ makrofager er lille i ét neonat (ca. 1 x 105); derfor bør der anvendes mindst 10 nyfødte til at opnå nok makrofager til hver voksen museindsprøjtning.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Neonatal transplantation af hjertemakrofag
<ol><li>Udfør en myokardieinfarkt operation på en voksen (6-8-uger gammel) mandligE C57BL/6 mus ved ligation af venstre forreste kranspulsåre8.</li>
	<li>Sæt den opererede mus på et 37 °C opvarmet tæppe, indtil det kommer sig.</li>
	<li>Intravenøst injicere 200 μL AF DMEM med 1 x 106 GFP+ neonatale hjertemakrofager i den infarkterede voksne mus efter operationen (ca. 6 timer senere) via halevenen.</li>
	<li>Send musen tilbage til et rent bur.</li>
</ol>4. Resultatevaluering
<ol><li>Validering af injektionseffektivitet<ol>
<li>Bedøve den opererede mus og høste hjertet 7 dage efter myokardieinfarkt operation.</li>
		<li>Fordyb hjertet i den forkølede PBS-buffer.</li>
		<li>Fix hjertevævet med 4% polyformaldehyd i 72 timer ved stuetemperatur med rystelser.</li>
		<li>Dehydrere hjertevævet i dimethylbenzene og ethanol.</li>
		<li>Integrer hjertevævet i paraffin og skær det i sektioner med en tykkelse på 5 μm.</li>
		<li>Udfør standard immunofluorescence farvning protokol1. Brug α-actinin til at markere kardiomyocytter.</li>
		<li>Detekter GFP+ makrofager i hjertet, der modtager transplantation.</li>
		<li>Udfør standard immunofluorescence farvning protokol1. Brug α-actinin og pH3 til at markere henholdsvis kardiomyocytter og cellespredning (figur 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hjertereparationsevaluering efter transplantationen<ol>
<li>Brug ekkokardiografi på den opererede mus en måned efter handlingen1.</li>
		<li>Analysere hjertefunktionen ved at sammenligne den venstre ventrikulære udslyngningsfraktion og fraktioneret afkortning i forskellige grupper (Figur 3B).</li>
		<li>Bedøve den opererede mus og høste hjertet.</li>
		<li>Gentag trin 4.1.2-4.1.5.</li>
		<li>Udfør en Massons farvningsprotokol.</li>
		<li>Analysere det infarkte område efter makrofagsindsprøjtning (Figur 3C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gp130+Controls+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration.">gp130 Controls Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Circulation. 142 (10), 967-982 (2020).</li><li>Pei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+Sulfide+Promotes+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration+via+ROS+Scavenging.">Hydrogen Sulfide Promotes Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration via ROS Scavenging.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 1412696 (2020).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mydgf+promotes+Cardiomyocyte+proliferation+and+Neonatal+Heart+regeneration.">Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration.</a> Theranostics. 10 (20), 9100-9112 (2020).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration.">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+stimulates+a+regenerative+response+in+the+neonatal+mouse+heart.">Acute inflammation stimulates a regenerative response in the neonatal mouse heart.</a> Cell Research. 25 (10), 1137-1151 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+murine+neonatal+cardiac+macrophage+improves+adult+cardiac+repair.">Transplantation of murine neonatal cardiac macrophage improves adult cardiac repair.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. , (2020).</li><li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGFR-&#946;+Signaling+Regulates+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Myocardial+Regeneration.">PDGFR-&#946; Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration.</a> Cell Reports. 28 (4), 966-978 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+NR_045363+controls+cardiomyocyte+proliferation+and+cardiac+repair.">A long noncoding RNA NR_045363 controls cardiomyocyte proliferation and cardiac repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 105-114 (2019).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+stable+myocardial+regeneration+after+apical+resection+in+neonatal+mice.">Achieving stable myocardial regeneration after apical resection in neonatal mice.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (11), 6500-6504 (2020).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577 (7790), 405-409 (2020).</li></ol>

Ingen interessekonflikter.

Her giver vi en effektiv tilgang til at forberede, erhverve og transplantere neonatale hjertemakrofager for at fremme voksen musehjerteregenerering.
Apisk resektion er en enkel og effektiv operation for at stimulere hjerte regenerering. Vi har optimeret detaljerne i apikal resektion for at sikre den maksimale overlevelsesrate for de dyr, der er involveret i operationen10. Anæstesi tid bør ikke være længere end 3 minutter, hvilket fører til hypotermi-induceret død, eller kortere end 2 minutter, hvilket ville forårsage overdreven blødning under operationen. Standard apikale resektion skulle amputere omkring 1,5 mm diameter af apex væv. Men formålet med operationen her var at stimulere rigelige makrofag infiltration under hjerte regenerering proces. Resektion på mindre end 1,5 mm diameter var acceptabelt, da det kunne garantere en maksimal overlevelsesrate og effektiv makrofag rekruttering på samme tid. Kun operatørens dygtighed påvirkede overlevelsesraten, og de opererede mus kunne ikke overleve den langvarige driftsvarighed. Operatøren skal afslutte hele proceduren inden for 5 minutter.
I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at akut betændelse fremmes neonatal hjerte regenerering. Intramyokardiemikroinjektion af immunogen zymosan A-partikler i neonatalt musehjerte kan fremme spredning af kardiomyocyt6. For nylig hævdede Molkentin et al. at makrofaginfiltration, der stimuleres ved intracardiac injektion af zymosan A, cellerester og fryse / optø dræbte celler, kan fremme hjertereparation, hvilket bekræfter, at akut betændelse og makrofager er afgørende for hjertereparation snarere end stamceller, der differentierer sig til kardiomyocytter11. Sadek et al.5 rapporterede, at makrofager kunne fremme neonatal hjerte regenerering via angiogenese. Vores seneste undersøgelse viste, at neonatal hjerte makrofag injektion kunne fremme voksne hjerte regenerering og øge evnen til voksne kardiomyocyt spredning1,7. Neonatal hjerte makrofag transplantation kan være en lovende strategi for at fremme voksne mus hjerte regenerering. Her præsenterer vi protokollerne for at hjælpe flere forskere om den regenerative applikationsudvikling og udforske af hjerteregenereringsmekanismer.

Hjerte regenerering er en lovende strategi for at genvinde hjertefunktion efter hjerteskade og for at beskytte mod hjertesvigt1,2,3. Efter myokardieskader infiltrerer makrofager det skadede hjerte og er blevet undersøgt som nøglefaktorer under neonatal hjerteregenerering4,5,6. Udover clearing nekrotiske cellulære vragrester og fremkalde betændelse, makrofager fremme angiogenese5 og kardiomyocyt spredning7 efter neonatale mus myokardieinfarkt.
Vores tidligere undersøgelse illustrerer, at transplantation af neonatale hjertemakrofager isoleret fra skadet neonatalt hjerte forbedrer voksen hjerteregenerering7, hvilket indikerer, at neonatal hjertemakrofagstransplantation kan være en lovende strategi til behandling af hjerteskader. Her giver vi de tekniske detaljer, herunder isolering af neonatale hjertemakrofager fra apikale resektionsskadede neonatale musehjerter, transplantation af makrofager i myokardieinfarerede voksne mus og vurdering af hjerteregenerering efter makrofagtransplantation (Figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse alpha actinin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Aurora B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab239837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Heart Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany</td>
			<td>130-098-373</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of neonatal mouse cardiac macrophages into adult mice

I en såret neonatal myokardie, makrofager lette kardiomyocyt spredning og angiogenese og fremme hjerte regenerering. Den foreliggende undersøgelse viser, at transplantation af neonatale hjertemakrofager rekrutteret ved skade fremmer voksen hjerte regenerering efter myokardieinfarkt med forbedring af hjertefunktion og kardiomyocyt spredning. Resultaterne tyder på, at neonatal hjerte makrofag transplantation kunne være en lovende strategi for hjerteskade behandling. Her giver vi de tekniske detaljer, herunder isolering af neonatale hjertemakrofager fra apikale resektionsskadede neonatale musehjerter, transplantation af makrofager i myokardieinfarerede voksne mus og vurdering af hjerteregenerering efter en makrofagsgraft.

Den protokol, der er beskrevet her, er opsummeret i et rutediagram (Figur 1). Vi udførte apikal resektionsoperation på 1 dag gamle Cx3cr1GFP / + mus. Som vist i figur 2Ablev den neonatale Cx3cr1GFP/+ mus forankret på driftsplatformen under stereoskopet efter anæstesi. Vi anvendte pres skiftevis på musekassen og maven ved hjælp af to sammenklik, som kan sættes op som en tarmkanal til at guide hjertet springer ud af brystet. Enhver ekstra mekanisk skade på hjertet, der kan påvirke hjerte regenerering bør undgås. Hjertet blev immobiliseret af de omkringliggende brystvæv, hvilket lettede operationen på myokardiet. Vi fandt, at afskære mindre end en 1 mm diameter af resected apex væv af iridectomy saks var passende, når venstre ventrikulær kammer begyndte oser. En vellykket induktion af den apikale resektionsmodel er nødvendig for makrofagstransplantation8,9.
Vi sorterede GFP+ makrofager strengt efter en neonatal hjerte dissociation protokol1 (Figur 2).
Neonatale hjertemakrofager blev sprøjtet ind i det myokardieinfarkterede voksne musehjerte kort efter isolationen. For at bekræfte effektiviteten af makrofagstransplantationen udførte vi immunofluorescence farvning farvning 7 dage efter injektionen. Resultaterne viste, at GFP+ makrofager kunne findes i det voksne myokardieinfarkterede musehjerte, hvilket indikerer en vellykket transplantation af neonatal hjertemakrofag. Vi anvendte co-immunstaining af pH3 med α-actinin. Co-lokalisering blev anset for at være kardiomyocyt spredning. Resultaterne viste, at antallet af proliferative kardiomyocytter blev opreguleret i den makrofagsindsprøjtningsgruppe, hvilket indikerer, at voksne kardiomyocytforsentationsevne blev forbedret efter transplantationen (Figur 3).
Voksen musehjerte regenerering blev evalueret 1 måned efter transplantationen. Vi udførte ekkokardiogram på den voksne mus og fandt ud af, at makrofagsindsprøjtning kunne forbedre hjertefunktionen efter myokardieinfarkt. Massons farvning blev udført, og resultaterne viste, at infarkt område blev bemærkelsesværdigt reduceret efter neonatal hjertemakrofagstransplantation (Figur 3). Alle disse resultater viste, at neonatal hjerte makrofag transplantation fremmer voksne mus hjerte regenerering og kardiomyocyt spredning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62108/62108fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk repræsentation af neonatal hjerte makrofag transplantation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62108/62108fig01large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62108/62108fig02.jpg"> Figur 2: Billeder af makrofagsisolation. A) Hjerterne er skåret i små stykker. B) Musen hjerter er adskilt. C) Suspensionen filtreres og overføres til et 15 mL centrifugerør. D) Antallet af neonatale hjertemakrofager beregnes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62108/62108fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62108/62108fig03.jpg"> Figur 3: Neonatal hjerte makrofag transplantation fremmer voksne hjerte regenerering. A) (Venstre) Immunofluorescence billeder viser de proliferative kardiomyocytter (pil, pH3 grøn, α-actinin rød). (Højre) Statistisk analyse viser, at kardiomyocyt spredning stiger efter makrofag transplantation. B) (Venstre) Ekkokardiogram billeder viser hjertefunktion i voksen mus 1-måned efter myokardieinfarkt. (Højre) Statistisk analyse viser, at hjertefunktionen er forbedret efter makrofagstransplantation. C) Masson's farvning viser infarcted område i voksen mus 1-måned efter myokardieinfarkt. (Højre) Statistisk analyse viser, at infarcted område reduceres efter Mφ, makrofag transplantation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62108/62108fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice at JoVE.com

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

Vi leverer en protokol for neonatal hjerte makrofag adskillelse og transplantation i en voksen mus hjerte, som kunne være en lovende måde at fremme hjerte reparation.

Transplantation af neonatale mus hjertemakrofager i voksne mus

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...

Denne protokol viser nye midterste hjerte makrofager adskillelse og transplantation i voksne mus, som kan være en eftergivende måde at fremme hjerte reparation. Konsekvenserne af denne teknik kan udvides til hjerte regenerering felt. Begynd med at forkøle bronze driftsplatform natten over ved 20 grader Celsius.Tag den bedøvede mus ud af iskassen og læg den på platformen. Forankre musen i en liggende position ved hjælp af medicinsk tape. Sæt driftsplatformen med musen under et stereoskop, og desinficer musekisten ved hjælp af en prep pad gennemblødt med betadin og 70% alkohol.Incise huden med en centimeter skåret på den fjerde intercostal område af brysthulen, og adskille intercostal muskler ved hjælp af mikrokirurgisk saks, indtil hjertet er tilgængelig. Tryk skiftevis på brystet og maven ved hjælp af to sammenkrulninger, indtil hjertet er udvendigt ud af brystet uden mekanisk skade. Indstil ribbenene under og over det lille snit som en naturlig fiksering for at immobilisere hjertet, lokalisere toppen af venstre ventrikel og skære en diameter på en millimeter ventrikulær spidsvæv ved hjælp af din tørreektomi saks.Bekræft, at venstre ventrikulære kammer er udsat og begynder oser. Tryk forsigtigt hjertet tilbage i brysthulen ved hjælp af en vatpind, sy musklerne, ribbenene og huden ved hjælp af otte af nul prolene suturer og rengør musen grundigt efter operationen. Overfør musen fra driftsplatformen til et 37 graders varmetæppe for at opvarme kroppen umiddelbart efter operationen.Bekræft antibiologi af musen ved at observere for tegn på spontan respiration restaurering, hudfarve skifte fra bleg til pink og bevægelse af lemmer. Tag den opererede mus tilbage til sin mor, når den er kommet sig. Bland den opererede mus, og det er mors redematerialer, hvis det er nødvendigt.Høst hjertet af en aflivet neonatal CX3-CR1-GFP mus en dag efter apikal resektion og nedsænke det i en 10 centimeter skål med PBS. Skær karrene og resterende bindevæv væk fra hjertekamrene. Skær auricular tillæg og udstrømning tarmkanalen væk fra hjertet.Efter hjertet holder op med at slå skære hjertet i en til to kubik millimeter stykker i fosfat saltvand buffer ved hjælp af mikrokirurgisk saks. Overfør dem til et rør, der indeholder 2,5 milliliter forvarmet enzymblanding og luk røret tæt. Vend røret og læg det med hætten ned, og kør derefter Neonatal Heart Dissociation-programmet.Tag røret af dissociatoren, når programmet er færdigt. Tilsæt 7,5 milliliter 1x DMEM med 10%FBS til røret. Filtrer og overfør suspensionen til et 15 milliliter centrifugerør.Centrifuge celle suspensionen ved 300 gange G i fem minutter. Ophæng cellepillen igen i en milliliter blodcelle lysisopløsning og inkuberes i to minutter ved stuetemperatur. Der tilsættes 5 til 10 milliliter fosfat saltvandsbuffer til suspensionen og centrifugen ved 300 gange G i fem minutter.Re-suspendere celle pellet i en milliliter af DMEM med 10% FBS, derefter sortere GFP positive neonatale hjerte makrofager via fax. Sorter makrofager i et sterilt rør, der indeholder 500 milliliter DMEM med 10%FBS. Tæl GFP positive makrofager og suspendere dem igen i DMEM med 10% FBS i koncentrationen af en million makrofager pr 200 milliliter DMEM til senere injektion.Neonatale hjertemakrofager blev injiceret i myokardieinfarkteret voksen musehjerte, og effektiviteten af de proliferative kardiomyocytter blev bekræftet af immunfluorescent farvning. Statistisk analyse viser, at spredningen af kardiomyocyt stiger efter makrofagstransplantation. Ekkokardiogrambilleder viser hjertefunktionen i en voksen mus en måned efter myokardieinfarkt.Hjertefunktionen er forbedret efter makrofagstransplantation. Masse i farvning viser, at det infarkterede område i en voksen mus en måned efter myokardieinfarkt blev bemærkelsesværdigt reduceret efter neonatal hjertemakrofagstransplantation. Neonatal hjerte makrofag transplantation kan være en fremme strategi for at fremme voksne mund hjerte regenerering.Denne protokol hjælper forskere forfølge regenerativ applikationsudvikling og udforske hjerte regenerering mekanisme.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch Clamp optagelser på Intact dorsalrodsganglier fra voksne rotter

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

En Protein Forberedelse Metode til High-throughput Identifikation af proteiner Samspil med en Nuclear Cofactor Brug LC-MS / MS-analyse

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimeret protokol til ekstraktion af proteiner fra humanmitralventilen

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Personlig peptid Arrays for påvisning af HLA Alloantibodies i organtransplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel-fri ultrahurtig rekonstituering af membranproteiner i Lipid dobbeltlag ved hjælp af Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

At studere Protein Import til grønkorn ved hjælp af Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolering af vævs Ekstrudulære vesikler fra leveren

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikation af funktionelle Protein regioner gennem kimære Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifikation af orexin og Endocannabinoide receptorer hos voksne zebrafisk ved hjælp af Immunoperoxidase og immunofluorescens metoder

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Forbedring af engraftment af humane inducerede pluripotente stamcelle afledte Kardiomyocytter via en forbigående hæmning af Rho Kinaseaktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...