यह प्रोटोकॉल नए मध्य कार्डियक मैक्रोफेज अलगाव और वयस्क चूहों में प्रत्यारोपण को दर्शाता है, जो हृदय की मरम्मत को बढ़ावा देने का एक स्वतंत्र तरीका हो सकता है। इस तकनीक के निहितार्थ हृदय उत्थान क्षेत्र में विस्तारित किया जा सकता है। 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कांस्य ऑपरेटिंग प्लेटफॉर्म को प्री-कूलिंग से शुरू करें।
एनेस्थेटाइज्ड माउस को आइसबॉक्स से बाहर निकालकर प्लेटफॉर्म पर डाल दें। चिकित्सा चिपकने वाले टेप का उपयोग करके माउस को एक रीढ़ की स्थिति में लंगर। एक स्टीरियोस्कोप के नीचे माउस के साथ ऑपरेटिंग मंच रखो, और बीटाडीन और ७०% शराब के साथ लथपथ एक तैयारी पैड का उपयोग कर माउस छाती कीटाणुरहित ।
छाती गुहा के चौथे इंटरकोस्टल क्षेत्र में एक सेंटीमीटर कटौती के साथ त्वचा को चीरना, और हृदय तक पहुंचने तक माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके इंटरकोस्टल मांसपेशियों को अलग करें। बारी-बारी से छाती और पेट को दो संदंश की मदद से दबाएं जब तक कि दिल को बिना किसी यांत्रिक क्षति के छाती से बाहर नहीं निकाला जाता है। दिल को स्थिर करने के लिए एक प्राकृतिक निर्धारण के रूप में छोटे चीरा के नीचे और ऊपर पसलियों सेट करें, बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष का पता लगाएं और अपने इरिडेक्टोमी कैंची का उपयोग करके वेंट्रिकुलर शीर्ष ऊतक के एक मिलीमीटर व्यास को काटें।
पुष्टि करें कि बाएं वेंट्रिकुलर कक्ष उजागर होता है और बह शुरू होता है। धीरे-धीरे एक कपास झाड़ू का उपयोग कर छाती गुहा में दिल वापस प्रेस, मांसपेशियों, पसलियों और त्वचा शून्य प्रोलीन टांके द्वारा आठ का उपयोग कर सीवन और ऑपरेशन के बाद अच्छी तरह से माउस को साफ। ऑपरेशन के तुरंत बाद शरीर को गर्म करने के लिए माउस को ऑपरेटिंग प्लेटफॉर्म से 37 डिग्री हीटिंग कंबल में स्थानांतरित करें।
सहज श्वसन बहाली, त्वचा का रंग पीला से गुलाबी और अंगों के आंदोलन के संकेतों के लिए देख कर माउस के एंटीबायोसिस की पुष्टि करें। संचालित माउस वापस ले लो यह मां को वापस ले एक बार यह बरामद किया है । संचालित माउस आपस में मिलना और यह मां के घोंसले की सामग्री है, यदि आवश्यक हो।
एपिकल रिसेक्शन के एक दिन बाद एक इच्छामृत्यु नवजात CX3-CR1-GFP माउस के दिल की कटाई करें और इसे पीबीएस के साथ 10 सेंटीमीटर डिश में विसर्जित करें। जहाजों और शेष संयोजी ऊतकों को वेंट्रिकल्स से दूर काटें। हृदय से दूर ऑरिकुलर परिशिष्ट और बहिर्वाह पथ को काट लें।
दिल की धड़कन बंद होने के बाद माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके फॉस्फेट खारा बफर में एक से दो घन मिलीमीटर टुकड़ों में दिल को काट दिया जाता है। उन्हें एक ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 2.5 मिलीलीटर प्रीहीटेड एंजाइम मिश्रण होता है और ट्यूब को कसकर बंद कर देता है। ट्यूब को उलटें और इसे कैप डाउन के साथ रखें, फिर नवजात हृदय वियोजन कार्यक्रम चलाएं।
कार्यक्रम पूरा होने के बाद वियोजन से ट्यूब को अलग करें। ट्यूब में 10% एफबीएस के साथ 1x डीएमईएम के 7.5 मिलीलीटर जोड़ें। फ़िल्टर करें और निलंबन को 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। रक्त कोशिका लाइसिस समाधान के एक मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर सस्पेंशन और सेंट्रलाइज में 5 से 10 मिलीलीटर फॉस्फेट खारा बफर डालें।
10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के एक मिलीलीटर में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, फिर फैक्स द्वारा जीएफपी सकारात्मक नवजात कार्डियक मैक्रोफेज को सॉर्ट करें। 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 500 मिलीलीटर युक्त बाँझ ट्यूब में मैक्रोफेज को सॉर्ट करें। जीएफपी सकारात्मक मैक्रोफेज की गणना करें और बाद में इंजेक्शन के लिए डीएमईएम के 200 मिलीलीटर प्रति मिलियन मैक्रोफेज की एकाग्रता पर 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम में उन्हें फिर से निलंबित करें।
नवजात कार्डियक मैक्रोफेज को मायोकार्डियल इनफार्क्ड वयस्क माउस हार्ट में इंजेक्ट किया गया था और प्रोलिफेरेटिव कार्डियोमायोसाइट्स की दक्षता इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की गई थी। सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चलता है कि मैक्रोफेज प्रत्यारोपण के बाद कार्डियोमायोसाइट प्रसार बढ़ जाता है। इकोकार्डियोग्राम छवियां मायोकार्डियल इंफेक्शन के एक महीने बाद वयस्क माउस में कार्डियक फंक्शन दिखाती हैं।
मैक्रोफेज प्रत्यारोपण के बाद कार्डियक फंक्शन को बढ़ाया जाता है। धुंधला में द्रव्यमान से पता चलता है कि एक वयस्क माउस में एक महीने के बाद myocardial infarction उल्लेखनीय नवजात हृदय मैक्रोफेज प्रत्यारोपण के बाद कम हो गया था । नवजात हृदय मैक्रोफेज प्रत्यारोपण वयस्क मुंह दिल उत्थान को बढ़ावा देने के लिए एक पदोन्नति रणनीति हो सकती है ।
यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को पुनर्योजी आवेदन विकास का पीछा करने और हृदय उत्थान तंत्र का पता लगाने में मदद करता है।
