Name: transplantation of neonatal mouse cardiac macrophages into adult mice
Uploaded: 2021-03-20T14:30:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice at JoVE.com

इस काम को चाइनीज एकेडमी ऑफ मेडिकल साइंसेज इनोवेशन फंड फॉर मेडिकल साइंसेज (सीआईएफएमएस, 2016-I2M-1-015), नेशनल की रिसर्च एंड डेवलपमेंट प्रोजेक्ट ऑफ चाइना (2019YFA0801500), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (एनएसएफसी: 81970243, 81770308), बीजिंग नेचुरल साइंस फाउंडेशन (7172183, 7182140) ने सपोर्ट किया ।

सभी प्रयोगों के उपयोग और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल के लिए गाइड के अनुसार आयोजित किया गया । सभी पशु प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC), Fuwai अस्पताल, चीनी चिकित्सा विज्ञान अकादमी द्वारा अनुमोदित किया गया । सर्जिकल साइट के प्रदूषण को रोकने के लिए प्रक्रिया के दौरान Aseptic तकनीक की आवश्यकता है।
1. नवजात 1-दिवसीय Cx3cr1 GFP/+ माउस(C57BL/6 पृष्ठभूमि) में एपिकल रिसेक्शन ऑपरेशन
<ol><li>संज्ञाहरण<ol>
<li>पिंजरों से सभी माउस पिल्ले बाहर ले लो और उन्हें एक साफ सूखी बॉक्स में डाल दिया।</li>
		<li>प्रत्येक माउस को बर्फ में लगभग 2-3 मिनट तक एम्बेड करें। सुनिश्चित करें कि ठंढ को रोकने के लिए बर्फ और माउस पिल्ला के बीच लेटेक्स या धुंध जैसी पतली बाधा है।</li>
		<li>निम्नलिखित संकेतों के लिए देख कर पर्याप्त संज्ञाहरण की पहचान करें: पीली त्वचा, अंग आंदोलन की कमी, और पेडल पलटा की कमी।</li>
	</ol>
</li>
	<li>थोराकोटॉमी<ol>
<li>संज्ञाहरण बनाए रखने में मदद करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कांस्य ऑपरेटिंग प्लेटफॉर्म प्रीकूल।</li>
		<li>एनेस्थेटाइज्ड माउस को आइस बॉक्स से बाहर निकालें और इसे ब्रॉन्ज ऑपरेटिंग प्लेटफॉर्म पर रखें। चिकित्सा चिपकने वाले टेप का उपयोग करके एक रीढ़ की स्थिति में ऑपरेटिंग प्लेटफॉर्म पर माउस को एंकर करें।</li>
		<li>एक स्टीरियोस्कोप के नीचे उस पर माउस के साथ ऑपरेटिंग मंच रखो।</li>
		<li>बीटाडीन और 70% अल्कोहल से लथपथ या संस्थागत नीति के अनुरूप एक तैयारी पैड का उपयोग करके माउस छाती को कीटाणुरहित करें।</li>
		<li>छाती गुहा के चौथे इंटरकोस्टल क्षेत्र में 1 सेमी कटौती के साथ त्वचा को चीरना और फिर हृदय तक पहुंचने तक माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके इंटरकोस्टल मांसपेशियों को अलग करें।</li>
		<li>बारी-बारी से छाती और पेट को दो संदंश की मदद से दबाएं जब तक कि दिल को बिना किसी यांत्रिक क्षति के छाती से बाहर नहीं निकाला जाता है।</li>
		<li>दिल को स्थिर करने के लिए एक प्राकृतिक निर्धारण के रूप में छोटे चीरा के नीचे और ऊपर पसलियों सेट करें।</li>
	</ol>
</li>
	<li>वेंट्रिकुलर एपेक्स रिसेक्शन<ol>
<li>बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष का पता लगाएं। एक स्टीरियोस्कोप के नीचे इरिडेक्टोमी कैंची का उपयोग करके वेंट्रिकुलर शीर्ष ऊतक का 1 मिमी व्यास काटें।</li>
		<li>पुष्टि करें कि बाएं वेंट्रिकुलर कक्ष उजागर होता है, और बहने लगते हैं।</li>
		<li>धीरे-धीरे एक कपास झाड़ू का उपयोग कर छाती गुहा को वापस दिल प्रेस।</li>
		<li>8-0 का उपयोग कर मांसपेशियों, पसलियों, और त्वचा सीवन प्रोलीन टांके।</li>
		<li>ऑपरेशन के बाद माउस को अच्छी तरह से साफ करें।</li>
	</ol>
</li>
	<li>ऑपरेशन के बाद की देखभाल<ol>
<li>ऑपरेशन के तुरंत बाद शरीर को गर्म करने के लिए माउस को ऑपरेटिंग प्लेटफॉर्म से 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग कंबल में स्थानांतरित करें।</li>
		<li>निम्नलिखित संकेतों के लिए देख कर माउस के एनाबियोसिस की पुष्टि करें: सहज श्वसन बहाली, त्वचा का रंग पीला से गुलाबी रंग में बदलता है, और अंगों का आंदोलन।</li>
		<li>एक बार ठीक हो जाने के बाद संचालित माउस को अपनी मां के पास वापस ले जाएं।</li>
		<li>यदि आवश्यक हो तो अपनी मां की घोंसले की सामग्री के साथ संचालित माउस को आपस में मिलाएं। नोट: यह एक बार में मां से सभी 1 दिन पुराने पिल्ले को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है और फिर उन सब को एक बार में वापस करने के बाद सभी पिल्ले बरामद कर रहे हैं ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. नवजात कार्डियक मैक्रोफेज निलंबन की तैयारी
नोट: इन सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को एक अंधेरे जगह में और बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए ।
<ol><li>एक नवजात Cx3cr1GFP/+ माउस 1 दिन के दिल की कटाई के बाद apical resection<ol>
<li>एपिकल रिसेक्शन के एक दिन बाद Cx3cr1GFP/+ माउस को इच्छाएं । कार्बन डाइऑक्साइड की अधिकता का उपयोग करें और इच्छामृत्यु लागू करने के लिए क्रमिक रूप से माउस को काटना।</li>
		<li>दिल को छाती से बाहर निकालकर पीबीएस के साथ 10 सेमी डिश में विसर्जित कर दें।</li>
		<li>जहाजों और शेष संयोजी ऊतकों को वेंट्रिकल्स से दूर काटें। हृदय से दूर ऑरिकुलर परिशिष्ट और बहिर्वाह पथ को काट लें।</li>
		<li>दिल की धड़कन बंद होने के बाद, माइक्रोसर्जिकल कैंची(चित्रा2 ए) का उपयोग करके पीबीएस बफर में दिल को 1-2 मिमी3 टुकड़ों में काट दें।</li>
	</ol>
</li>
	<li>नवजात माउस दिल वियोजन<ol>
<li>कटे हुए हृदय ऊतक को पहले से गर्म एंजाइम मिश्रण(सामग्रीकी तालिका) के 2.5 एमएल वाली ट्यूब में स्थानांतरित करें, और ट्यूब को कसकर बंद करें।</li>
		<li>ट्यूब को उलटें और इसे कैप डाउन(चित्रा 2B) केसाथ रखें।</li>
		<li>नवजात हृदय वियोजन कार्यक्रम(सामग्री की तालिका) चलाएं।</li>
		<li>कार्यक्रम पूरा होने के बाद वियोजन से ट्यूब को अलग करें।</li>
		<li>ट्यूब में 10% एफबीएस के साथ 1x डीएमईएम का 7.5 एमएल जोड़ें।</li>
		<li>फ़िल्टर करें और निलंबन को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब(चित्रा 2C)में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें।</li>
		<li>कोशिका गोली को रक्त कोशिका लाइसिस समाधान के 1 एमसीएल में फिर से रखें और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।</li>
		<li>5 मिनट के लिए 300 x g पर निलंबन और अपकेंद्रित्र करने के लिए पीबीएस बफर के 5-10 एमएल जोड़ें।</li>
		<li>10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 1 एमसीएल में सेल पेलेट को फिर से रीस्ब करें।</li>
	</ol>
</li>
	<li>नवजात हृदय मैक्रोफेज अलगाव<ol>
<li>FACS द्वारा जीएफपी+ नवजात कार्डियक मैक्रोफेज को सॉर्ट करें। 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 500 माइक्रोन युक्त बाँझ ट्यूब में सॉर्ट किए गए मैक्रोफेज प्राप्त करें।</li>
		<li>जीएफपी+ मैक्रोफेज(चित्रा 2D) कीगणनाएं । बाद में इंजेक्शन के लिए डीएमईएम के 200 माइक्रोन प्रति 1 x 106 मैक्रोफेज की एकाग्रता पर 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम में मैक्रोफेज को फिर से खर्च करें। नोट: जीएफपी+ मैक्रोफेज की संख्या एक नवजात (लगभग 1 x 105)में छोटी है; इसलिए, प्रत्येक वयस्क माउस इंजेक्शन के लिए पर्याप्त मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए कम से कम 10 नवजातों का उपयोग किया जाना चाहिए।</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. नवजात कार्डियक मैक्रोफेज प्रत्यारोपण
<ol><li>बाएं पूर्वाने कोरोनरी धमनी8के बंधन द्वारा एक वयस्क (6-8 सप्ताह पुराने) पुरुष C57BL/6 माउस पर एक मायोकार्डियल इंफार्क्शन ऑपरेशन करें ।</li>
	<li>37 डिग्री सेल्सियस गर्म कंबल पर संचालित माउस को तब तक रखें जब तक कि यह ठीक न हो जाए।</li>
	<li>नसों में 1 x 10 6 जीएफपी+ नवजात कार्डियक मैक्रोफेज के साथ डीएमईएम के200 माइक्रोन को ऑपरेशन के बाद इनफार्टेड वयस्क माउस में इंजेक्ट करें (लगभग 6 घंटे बाद) पूंछ नस के माध्यम से।</li>
	<li>माउस को एक साफ पिंजरे में वापस भेजें।</li>
</ol>4. रिजल्ट मूल्यांकन
<ol><li>इंजेक्शन दक्षता सत्यापन<ol>
<li>ऑपरेशन माउस को एनेस्थेटाइज करें और मायोकार्डियल इंफेक्शन ऑपरेशन के 7 दिन बाद दिल की कटाई करें।</li>
		<li>दिल को प्री-कूल्ड पीबीएस बफर में विसर्जित कर दें।</li>
		<li>हिलने के साथ कमरे के तापमान पर 72 घंटे के लिए 4% पॉलीफॉर्मेल्डिहाइड के साथ दिल के ऊतकों को ठीक करें।</li>
		<li>दिल के ऊतकों को डाइमेथिलबेंजेन और इथेनॉल में निर्जलित करें।</li>
		<li>पैराफिन में दिल के ऊतकों को एम्बेड करें और इसे 5 माइक्रोन की मोटाई के साथ वर्गों में टुकड़ा करें।</li>
		<li>मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटोकॉल1का प्रदर्शन करें । कार्डियोमायोसाइट्स को चिह्नित करने के लिए α-ऐक्टिन का इस्तेमाल करें।</li>
		<li>प्रत्यारोपण प्राप्त करने वाले हृदय में जीएफपी+ मैक्रोफेज का पता लगाएं।</li>
		<li>मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटोकॉल1का प्रदर्शन करें । कार्डियोमायोसाइट्स और सेल प्रसार को चिह्नित करने के लिए क्रमशः α-ऐक्टिन और पीएच3 का उपयोग करें(चित्रा 3 ए)।</li>
	</ol>
</li>
	<li>प्रत्यारोपण के बाद कार्डियक मरम्मत मूल्यांकन<ol>
<li>ऑपरेशन1के एक महीने बाद संचालित माउस पर इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग करें ।</li>
		<li>विभिन्न समूहों(चित्रा 3B)में बाएं वेंट्रिकुलर रिजेक्शन अंश और आंशिक छोटा होने की तुलना करके कार्डियक फ़ंक्शन का विश्लेषण करें।</li>
		<li>संचालित माउस को एनेस्थेटाइज करें और दिल की फसल करें।</li>
		<li>दोहराएं कदम 4.1.2-4.1.5।</li>
		<li>एक मैसन धुंधला प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं।</li>
		<li>मैक्रोफेज इंजेक्शन(चित्रा 3 सी)के बाद इन्फेक्टेड क्षेत्र का विश्लेषण करें।</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gp130+Controls+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration.">gp130 Controls Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Circulation. 142 (10), 967-982 (2020).</li><li>Pei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+Sulfide+Promotes+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration+via+ROS+Scavenging.">Hydrogen Sulfide Promotes Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration via ROS Scavenging.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 1412696 (2020).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mydgf+promotes+Cardiomyocyte+proliferation+and+Neonatal+Heart+regeneration.">Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration.</a> Theranostics. 10 (20), 9100-9112 (2020).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration.">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+stimulates+a+regenerative+response+in+the+neonatal+mouse+heart.">Acute inflammation stimulates a regenerative response in the neonatal mouse heart.</a> Cell Research. 25 (10), 1137-1151 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+murine+neonatal+cardiac+macrophage+improves+adult+cardiac+repair.">Transplantation of murine neonatal cardiac macrophage improves adult cardiac repair.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. , (2020).</li><li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGFR-&#946;+Signaling+Regulates+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Myocardial+Regeneration.">PDGFR-&#946; Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration.</a> Cell Reports. 28 (4), 966-978 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+NR_045363+controls+cardiomyocyte+proliferation+and+cardiac+repair.">A long noncoding RNA NR_045363 controls cardiomyocyte proliferation and cardiac repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 105-114 (2019).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+stable+myocardial+regeneration+after+apical+resection+in+neonatal+mice.">Achieving stable myocardial regeneration after apical resection in neonatal mice.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (11), 6500-6504 (2020).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577 (7790), 405-409 (2020).</li></ol>

हितों का कोई टकराव नहीं।

यहां, हम वयस्क माउस हार्ट पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए नवजात हृदय मैक्रोफेज तैयार करने, प्राप्त करने और प्रत्यारोपण करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।
एपिकल रिसेक्शन दिल के उत्थान को प्रोत्साहित करने के लिए एक सरल और प्रभावी ऑपरेशन है। हमने ऑपरेशन10में शामिल जानवरों के अधिकतम जीवित रहने की दर सुनिश्चित करने के लिए एपिकल रिसेक्शन का विवरण अनुकूलित किया है । संज्ञाहरण समय 3 मिनट से अधिक समय नहीं होना चाहिए, जो हाइपोथर्मिया-प्रेरित मौत का कारण बनता है, या 2 मिनट से कम होता है, जो ऑपरेशन के दौरान अत्यधिक रक्तस्राव का कारण बनता है। मानक एपिकल रिसेक्शन को शीर्ष ऊतक के लगभग 1.5 मिमी व्यास को काटना चाहिए था। हालांकि, यहां ऑपरेशन का उद्देश्य हृदय उत्थान प्रक्रिया के दौरान प्रचुर मात्रा में मैक्रोफेज घुसपैठ को प्रोत्साहित करना था। 1.5 मिमी से कम व्यास का रीसेक्शन स्वीकार्य था क्योंकि यह एक ही समय में अधिकतम जीवित रहने की दर और प्रभावी मैक्रोफेज भर्ती की गारंटी दे सकता था। केवल ऑपरेटर की कुशलता ने जीवित रहने की दर को प्रभावित किया, और संचालित चूहे लंबे समय तक ऑपरेशन अवधि से बच नहीं सके। ऑपरेटर को 5 मिनट के भीतर पूरी प्रक्रिया पूरी करनी चाहिए।
हमारे पूर्व अध्ययन में, हमने पाया कि तीव्र सूजन नवजात हृदय उत्थान को बढ़ावा दिया । इम्यूनोजेनिक जाइमोसन के इंट्रामायोकार्डियल माइक्रोइंजेक्शन नवजात माउस हार्ट में एक कण कार्डियोमायोसाइट प्रसार को बढ़ावा देता है6. हाल ही में, मोल्केन्टिन एट अल ने दावा किया कि मैक्रोफेज घुसपैठ जो zymosan ए, सेल मलबे के इंट्राकार्डिएक इंजेक्शन से उत्तेजित होती है, और फ्रीज/गल मारे गए कोशिकाएं हृदय की मरम्मत को बढ़ावा दे सकती हैं, इस बात की पुष्टि करती हैं कि कार्डियोमायोसाइट्स11में अंतर करने वाली स्टेम कोशिकाओं के बजाय कार्डियक रिपेयर में तीव्र सूजन और मैक्रोफेज आवश्यक हैं । सैडेक एट अल5 ने बताया कि मैक्रोफेज एंजियोजेनेसिस के माध्यम से नवजात हृदय उत्थान को बढ़ावा पहुंचा सकता है। हमारे हालिया अध्ययन से पता चला है कि नवजात हृदय मैक्रोफेज इंजेक्शन वयस्क हृदय उत्थान को बढ़ावा दे सकता है और वयस्क कार्डियोमायोसाइट प्रसार की क्षमता को बढ़ा सकता है1,7. नवजात हृदय मैक्रोफेज प्रत्यारोपण वयस्क माउस हृदय उत्थान को बढ़ावा देने के लिए एक आशाजनक रणनीति हो सकती है । यहां हम पुनर्योजी आवेदन विकास पर अधिक शोधकर्ताओं की मदद करने और हृदय उत्थान तंत्र का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं।

हृदय की चोट के बाद हृदय कार्य को ठीक करने और हृदय की विफलता से बचाने के लिए हृदय उत्थान एक आशाजनक रणनीति है1,2,3. मायोकार्डियल चोट के बाद, मैक्रोफेज घायल हृदय में घुसपैठ करते हैं और नवजात हृदय उत्थान 4 ,5,6 के दौरानप्रमुख कारकों के रूप मेंखोजेगए हैं। नेक्रोटिक सेलुलर मलबे को साफ करने और सूजन को प्रेरित करने के अलावा, मैक्रोफेज नवजात चूहों मायोकार्डियल इंफेक्शन के बाद एंजियोजेनेसिस5 और कार्डियोमायोसाइट प्रसार7 को बढ़ावा देते हैं।
हमारा पिछला अध्ययन दिखाता है कि घायल नवजात हृदय से अलग नवजात हृदय मैक्रोफेज का प्रत्यारोपण वयस्क हृदय उत्थान को बढ़ाता है7,यह दर्शाता है कि नवजात हृदय मैक्रोफेज प्रत्यारोपण हृदय की चोट के इलाज के लिए एक आशाजनक रणनीति हो सकती है । यहां हम तकनीकी विवरण प्रदान करते हैं, जिसमें एपिकल रिसेक्शन-घायल नवजात माउस दिलों से नवजात हृदय मैक्रोफेज का अलगाव, मायोकार्डियल-इनफार्केक्टेड वयस्क चूहों में मैक्रोफेज का प्रत्यारोपण, और मैक्रोफेज ग्राफ्ट(चित्र 1)के बाद हृदय उत्थान का अनुमान शामिल है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse alpha actinin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Aurora B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab239837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Heart Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany</td>
			<td>130-098-373</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of neonatal mouse cardiac macrophages into adult mice

एक घायल नवजात मायोकार्डियम में, मैक्रोफेज कार्डियोमायोसाइट प्रसार और एंजियोजेनेसिस की सुविधा प्रदान करते हैं और हृदय उत्थान को बढ़ावा देते हैं। वर्तमान अध्ययन से पता चलता है कि चोट द्वारा भर्ती नवजात कार्डियक मैक्रोफेज का प्रत्यारोपण हृदय समारोह और कार्डियोमायोसाइट प्रसार में सुधार के साथ मायोकार्डियल इंफेक्शन के बाद वयस्क हृदय उत्थान को बढ़ावा देता है । परिणामों से संकेत मिलता है कि नवजात कार्डियक मैक्रोफेज प्रत्यारोपण हृदय की चोट के इलाज के लिए एक आशाजनक रणनीति हो सकती है । यहां, हम तकनीकी विवरण प्रदान करते हैं, जिसमें एपिकल रिसेक्शन-घायल नवजात माउस दिलों से नवजात हृदय मैक्रोफेज का अलगाव, मायोकार्डियल-इनफार्केक्टेड वयस्क चूहों में मैक्रोफेज का प्रत्यारोपण, और मैक्रोफेज ग्राफ्टेड ग्राफ्ट के बाद हृदय उत्थान का अनुमान शामिल है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को प्रवाह चार्ट(चित्रा 1)में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। हमने 1-डे-ओल्ड Cx3cr1GFP/+ माउस पर एपिकल रिसेक्शन ऑपरेशन किया । जैसा कि चित्रा 2 एमें दिखाया गया है, नवजात Cx3cr1GFP/+ माउस को संज्ञाहरण के बाद स्टीरियोस्कोप के नीचे ऑपरेटिंग प्लेटफॉर्म पर लंगर डाले गए थे । हमने दो संदंश की मदद से माउस छाती और पेट पर बारी-बारी से दबाव लागू किया, जिसे छाती से बाहर निकलने वाले दिल को मार्गदर्शन करने के लिए एक पथ के रूप में स्थापित किया जा सकता है। दिल को किसी भी अतिरिक्त यांत्रिक क्षति से बचा जाना चाहिए जो दिल के उत्थान को प्रभावित कर सकता है। दिल को आसपास के छाती के ऊतकों द्वारा स्थिर किया गया था, जिसने मायोकार्डियम पर ऑपरेशन की सुविधा प्रदान की। हमने पाया कि इरिडेक्टॉमी कैंची द्वारा पुनः प्राप्त शीर्ष ऊतक के 1 मिमी व्यास से कम काटना उचित था जब बाएं वेंट्रिकुलर कक्ष बहने लगे। मैक्रोफेज प्रत्यारोपण8,9के लिए एपिकल रिसेक्शन मॉडल का सफल रूप से शामिल करना आवश्यक है ।
हमने एक नवजात हृदय वियोजन प्रोटोकॉल 1(चित्रा 2)का सख्ती से पालन करतेहुए जीएफपी+ मैक्रोफेज को हल किया।
नवजात कार्डियक मैक्रोफेज को अलगाव के कुछ ही समय बाद मायोकार्डियल इनफार्क्ड वयस्क माउस हार्ट में इंजेक्ट किया गया था । मैक्रोफेज प्रत्यारोपण की दक्षता की पुष्टि करने के लिए, हमने इंजेक्शन के 7 दिनों के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला किया। परिणामों से पता चला है कि जीएफपी+ मैक्रोफेज वयस्क मायोकार्डियल इनफार्क्ड माउस हार्ट में पाया जा सकता है, जो नवजात हृदय मैक्रोफेज के सफल प्रत्यारोपण का संकेत है । हमने α-ऐक्टिनिन के साथ pH3 के सह-इम्यूनोदाता को नियोजित किया। सह-स्थानीयकरण को कार्डियोमायोसाइट प्रसार माना जाता था। परिणामों से पता चला है कि प्रोलिफेरेटिव कार्डियोमायोसाइट्स की संख्या मैक्रोफेज-इंजेक्ट किए गए समूह में उपनियमित थी, यह दर्शाता है कि प्रत्यारोपण(चित्रा 3)के बाद वयस्क कार्डियोमायोसाइट प्रसार क्षमता में वृद्धि हुई थी।
प्रत्यारोपण के 1 महीने बाद वयस्क माउस हार्ट पुनर्जनन का मूल्यांकन किया गया। हमने वयस्क माउस पर इकोकार्डियोग्राम का प्रदर्शन किया और पाया कि मैक्रोफेज इंजेक्शन मायोकार्डियल इंफेक्शन के बाद कार्डियक फंक्शन को बढ़ा सकता है। मैसन का धुंधला प्रदर्शन किया गया था, और परिणामों ने यह स्पष्ट किया कि नवजात हृदय मैक्रोफेज प्रत्यारोपण(चित्रा 3)के बाद इनफार्केटेड क्षेत्र उल्लेखनीय रूप से कम हो गया था। इन सभी परिणामों से पता चला है कि नवजात कार्डियक मैक्रोफेज प्रत्यारोपण वयस्क माउस हार्ट पुनर्जनन और कार्डियोमायोसाइट प्रसार को बढ़ावा देता है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62108/62108fig01.jpg"> चित्र 1:नवजात कार्डियक मैक्रोफेज प्रत्यारोपण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62108/62108fig01large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62108/62108fig02.jpg"> चित्रा 2:मैक्रोफेज अलगाव की छवियां। A)दिलों को छोटे टुकड़ों में काटा जाता है । ख)माउस दिलों को अलग कर रहे हैं । ग)निलंबन फ़िल्टर किया जाता है और 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया जाता है। घ)नवजात कार्डियक मैक्रोफेज की संख्या की गणना की जाती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62108/62108fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62108/62108fig03.jpg"> चित्र 3:नवजात कार्डियक मैक्रोफेज प्रत्यारोपण वयस्क हृदय उत्थान को बढ़ावा देता है। A)(बाएं) इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां प्रोलिफेरेटिव कार्डियोमायोसाइट्स (तीर, पीएच3 ग्रीन, α-ऐक्टिनिन लाल) दिखाती हैं। (दाएं) सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चलता है कि मैक्रोफेज प्रत्यारोपण के बाद कार्डियोमायोसाइट प्रसार बढ़ जाता है। B)(बाएं) इकोकार्डियोग्राम छवियां मायोकार्डियल इंफार्क्शन के 1 महीने बाद वयस्क माउस में कार्डियक फंक्शन दिखाती हैं । (दाएं) सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चलता है कि मैक्रोफेज प्रत्यारोपण के बाद कार्डियक फंक्शन को बढ़ाया जाता है । C)मैसन का धुंधला वयस्क माउस में 1 महीने के बाद myocardial infarction में infarcted क्षेत्र से पता चलता है । (दाएं) सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चलता है कि Mφ, मैक्रोफेज प्रत्यारोपण के बाद इनफार्ट्ड क्षेत्र कम हो जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62108/62108fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice at JoVE.com

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

हम नवजात कार्डियक मैक्रोफेज जुदाई और प्रत्यारोपण के लिए एक वयस्क माउस दिल में एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो हृदय की मरम्मत को बढ़ावा देने का एक आशाजनक तरीका हो सकता है।

वयस्क चूहों में नवजात माउस कार्डियक मैक्रोफेज का प्रत्यारोपण

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...

यह प्रोटोकॉल नए मध्य कार्डियक मैक्रोफेज अलगाव और वयस्क चूहों में प्रत्यारोपण को दर्शाता है, जो हृदय की मरम्मत को बढ़ावा देने का एक स्वतंत्र तरीका हो सकता है। इस तकनीक के निहितार्थ हृदय उत्थान क्षेत्र में विस्तारित किया जा सकता है। 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कांस्य ऑपरेटिंग प्लेटफॉर्म को प्री-कूलिंग से शुरू करें।एनेस्थेटाइज्ड माउस को आइसबॉक्स से बाहर निकालकर प्लेटफॉर्म पर डाल दें। चिकित्सा चिपकने वाले टेप का उपयोग करके माउस को एक रीढ़ की स्थिति में लंगर। एक स्टीरियोस्कोप के नीचे माउस के साथ ऑपरेटिंग मंच रखो, और बीटाडीन और ७०% शराब के साथ लथपथ एक तैयारी पैड का उपयोग कर माउस छाती कीटाणुरहित ।छाती गुहा के चौथे इंटरकोस्टल क्षेत्र में एक सेंटीमीटर कटौती के साथ त्वचा को चीरना, और हृदय तक पहुंचने तक माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके इंटरकोस्टल मांसपेशियों को अलग करें। बारी-बारी से छाती और पेट को दो संदंश की मदद से दबाएं जब तक कि दिल को बिना किसी यांत्रिक क्षति के छाती से बाहर नहीं निकाला जाता है। दिल को स्थिर करने के लिए एक प्राकृतिक निर्धारण के रूप में छोटे चीरा के नीचे और ऊपर पसलियों सेट करें, बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष का पता लगाएं और अपने इरिडेक्टोमी कैंची का उपयोग करके वेंट्रिकुलर शीर्ष ऊतक के एक मिलीमीटर व्यास को काटें।पुष्टि करें कि बाएं वेंट्रिकुलर कक्ष उजागर होता है और बह शुरू होता है। धीरे-धीरे एक कपास झाड़ू का उपयोग कर छाती गुहा में दिल वापस प्रेस, मांसपेशियों, पसलियों और त्वचा शून्य प्रोलीन टांके द्वारा आठ का उपयोग कर सीवन और ऑपरेशन के बाद अच्छी तरह से माउस को साफ। ऑपरेशन के तुरंत बाद शरीर को गर्म करने के लिए माउस को ऑपरेटिंग प्लेटफॉर्म से 37 डिग्री हीटिंग कंबल में स्थानांतरित करें।सहज श्वसन बहाली, त्वचा का रंग पीला से गुलाबी और अंगों के आंदोलन के संकेतों के लिए देख कर माउस के एंटीबायोसिस की पुष्टि करें। संचालित माउस वापस ले लो यह मां को वापस ले एक बार यह बरामद किया है । संचालित माउस आपस में मिलना और यह मां के घोंसले की सामग्री है, यदि आवश्यक हो।एपिकल रिसेक्शन के एक दिन बाद एक इच्छामृत्यु नवजात CX3-CR1-GFP माउस के दिल की कटाई करें और इसे पीबीएस के साथ 10 सेंटीमीटर डिश में विसर्जित करें। जहाजों और शेष संयोजी ऊतकों को वेंट्रिकल्स से दूर काटें। हृदय से दूर ऑरिकुलर परिशिष्ट और बहिर्वाह पथ को काट लें।दिल की धड़कन बंद होने के बाद माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके फॉस्फेट खारा बफर में एक से दो घन मिलीमीटर टुकड़ों में दिल को काट दिया जाता है। उन्हें एक ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 2.5 मिलीलीटर प्रीहीटेड एंजाइम मिश्रण होता है और ट्यूब को कसकर बंद कर देता है। ट्यूब को उलटें और इसे कैप डाउन के साथ रखें, फिर नवजात हृदय वियोजन कार्यक्रम चलाएं।कार्यक्रम पूरा होने के बाद वियोजन से ट्यूब को अलग करें। ट्यूब में 10% एफबीएस के साथ 1x डीएमईएम के 7.5 मिलीलीटर जोड़ें। फ़िल्टर करें और निलंबन को 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। रक्त कोशिका लाइसिस समाधान के एक मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर सस्पेंशन और सेंट्रलाइज में 5 से 10 मिलीलीटर फॉस्फेट खारा बफर डालें।10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के एक मिलीलीटर में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, फिर फैक्स द्वारा जीएफपी सकारात्मक नवजात कार्डियक मैक्रोफेज को सॉर्ट करें। 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 500 मिलीलीटर युक्त बाँझ ट्यूब में मैक्रोफेज को सॉर्ट करें। जीएफपी सकारात्मक मैक्रोफेज की गणना करें और बाद में इंजेक्शन के लिए डीएमईएम के 200 मिलीलीटर प्रति मिलियन मैक्रोफेज की एकाग्रता पर 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम में उन्हें फिर से निलंबित करें।नवजात कार्डियक मैक्रोफेज को मायोकार्डियल इनफार्क्ड वयस्क माउस हार्ट में इंजेक्ट किया गया था और प्रोलिफेरेटिव कार्डियोमायोसाइट्स की दक्षता इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की गई थी। सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चलता है कि मैक्रोफेज प्रत्यारोपण के बाद कार्डियोमायोसाइट प्रसार बढ़ जाता है। इकोकार्डियोग्राम छवियां मायोकार्डियल इंफेक्शन के एक महीने बाद वयस्क माउस में कार्डियक फंक्शन दिखाती हैं।मैक्रोफेज प्रत्यारोपण के बाद कार्डियक फंक्शन को बढ़ाया जाता है। धुंधला में द्रव्यमान से पता चलता है कि एक वयस्क माउस में एक महीने के बाद myocardial infarction उल्लेखनीय नवजात हृदय मैक्रोफेज प्रत्यारोपण के बाद कम हो गया था । नवजात हृदय मैक्रोफेज प्रत्यारोपण वयस्क मुंह दिल उत्थान को बढ़ावा देने के लिए एक पदोन्नति रणनीति हो सकती है ।यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को पुनर्योजी आवेदन विकास का पीछा करने और हृदय उत्थान तंत्र का पता लगाने में मदद करता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

वयस्क चूहों से बरकरार पृष्ठीय रूट ganglia पर पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

एक प्रोटीन प्रोटीन की उच्च throughput पहचान नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण का प्रयोग एक परमाणु cofactor साथ बातचीत के लिए तैयारी विधि

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

मानव मैट्रल वाल्व से प्रोटीन के निष्कर्षण के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

अंग प्रत्यारोपण में एचएलए Alloantibodies का पता लगाने के लिए निजीकृत पेप्टाइड सरणियों

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

डिटर्जेंट-मुक्त Ultrafast Bilayers में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन Fusogenic पूरक का उपयोग कर Proteoliposomes आरोप लगाया ।

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Protoplasts का उपयोग Chloroplasts में प्रोटीन आयात का अध्ययन

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

जिगर से ऊतक extracellular Vesicles के अलगाव

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Chimeric प्रोटीन निर्माण के माध्यम से कार्यात्मक प्रोटीन क्षेत्रों की पहचान

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

वयस्क ज़ेब्राफ़िश में Orexin और Endocannabinoid रिसेप्टर्स की पहचान इम्यूनोपर्क्सीडेज और इम्यूनोफ्लोरेसींस तरीकों का उपयोग

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Rho Kinase गतिविधि के एक क्षणिक निषेध के माध्यम से मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के Engraftment बढ़ाना

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...