Denne protokollen demonstrerer ny midtre hjertemakrofagsseparasjon og transplantasjon til voksne mus, noe som kan være en tillatt måte å fremme hjertereparasjon på. Implikasjonene av denne teknikken kan utvides til hjerteregenereringsfeltet. Begynn med å forhåndskjøle bronseplattformen over natten ved 20 grader Celsius.
Ta den bedøvede musen ut av isboksen og legg den på plattformen. Forankre musen i en liggende stilling ved hjelp av medisinsk tape. Sett driftsplattformen med musen under et stereoskop, og desinfiser musekisten ved hjelp av en prep pad gjennomvåt med betadine og 70% alkohol.
Øk huden med en centimeter kutt i det fjerde intercostalområdet i brysthulen, og skill intercostalmuskulaturen ved hjelp av mikrokirurgisk saks til hjertet er tilgjengelig. Trykk vekselvis brystet og magen ved hjelp av to tang til hjertet er eksteriørisert ut av brystet uten mekanisk skade. Sett ribbenene under og over det lille snittet som en naturlig fiksering for å immobilisere hjertet, finn toppen av venstre ventrikel og kutt en millimeter diameter av ventrikulært apexvev ved hjelp av iridectomy saks.
Kontroller at venstre ventrikulære kammer er eksponert og begynner å ose. Trykk forsiktig hjertet tilbake i brysthulen ved hjelp av en bomullspinne, suturer musklene, ribbeina og huden ved hjelp av åtte til null prolen suturer og rengjør musen grundig etter operasjonen. Overfør musen fra driftsplattformen til et 37 graders varmeteppe for å varme opp kroppen umiddelbart etter operasjonen.
Bekreft musens antibiose ved å observere for tegn på spontan respirasjonsrestaurering, hudfargeendring fra blek til rosa og bevegelse av lemmer. Ta den opererte musen tilbake til moren når den er gjenopprettet. Mingle den opererte musen og det er mors hekkematerialer, om nødvendig.
Høst hjertet av en euthanized neonatal CX3-CR1-GFP mus en dag etter apikal reseksjon og dypp den i en 10 centimeter tallerken med PBS. Klipp karene og gjenværende bindevev vekk fra ventriklene. Klipp det aurikulære tillegget og utstrømningskanalen bort fra hjertet.
Etter at hjertet slutter å slå, kutt hjertet i en til to kubikkmillimeterstykker i fosfat saltvannsbuffer ved hjelp av mikrokirurgisk saks. Overfør dem til et rør som inneholder 2,5 milliliter forvarmet enzymblanding og lukk røret tett. Snu røret og plasser det med hetten nede, og kjør deretter Neonatal Heart Dissociation-programmet.
Koble røret fra dissosiatoren etter at programmet er fullført. Tilsett 7,5 milliliter 1x DMEM med 10% FBS i røret. Filtrer og overfør suspensjonen til et sentrifugerør på 15 milliliter.
Sentrifuger cellefjæringen ved 300 ganger G i fem minutter. Re-suspendere cellepellet i en milliliter blodcelle lysis løsning og inkubere i to minutter ved romtemperatur. Tilsett 5 til 10 milliliter fosfat saltvannsbuffer til suspensjonen og sentrifugen ved 300 ganger G i fem minutter.
Re-suspendere cellepellet i en milliliter DMEM med 10%FBS, deretter sortere GFP positive neonatal hjerte makrofager ved faks. Sorter makrofager i et sterilt rør som inneholder 500 milliliter DMEM med 10% FBS. Tell GFP positive makrofager og re-suspendere dem i DMEM med 10% FBS i konsentrasjonen av en million makrofager per 200 milliliter DMEM for senere injeksjon.
Neonatale hjertemakrofager ble injisert i det hjerteinfarktte voksne musehjertet, og effektiviteten til de proliferative kardiomyocyttene ble bekreftet av immunfluorescerende farging. Statistisk analyse viser at kardiomyocyttproliferasjon øker etter makrofagtransplantasjon. Ekkokardiogrambilder viser hjertefunksjonen i en voksen mus en måned etter hjerteinfarkt.
Hjertefunksjonen forbedres etter makrofagtransplantasjon. Masse i farging viser at det infarkterte området i en voksen mus en måned etter hjerteinfarkt ble bemerkelsesverdig redusert etter neonatal hjertemakrofagtransplantasjon. Neonatal hjertemakrofagtransplantasjon kan være en kampanjestrategi for å fremme regenerering av voksne munnhjerter.
Denne protokollen hjelper forskere med å forfølge regenerativ applikasjonsutvikling og utforske hjerteregenereringsmekanismen.
