Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

نود أن نشكر مختبر Balázsi على التعليقات والاقتراحات ، والدكتور كارل ب. جيرهاردت والدكتور جيفري ج. تابور لمساعدتنا في بناء أول LPA ، والدكتور ويلفريد ويبر لمشاركة بلازميدات LOV2-degron. وقد دعمت هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة [R35 GM122561 و T32 GM008444]؛ مركز لوفر للبيولوجيا الفيزيائية والكمية. وزمالة الدراسات العليا في علوم وهندسة الدفاع الوطني (NDSEG). تمويل رسوم الوصول المفتوح: المعاهد الوطنية للصحة [R35 GM122561].
مساهمات المؤلف: M.T.G. و G.B. تصور المشروع. أجرى كل من M.T.G. و D.C. و L.G. التجارب. قام كل من M.T.G. و D.C. و L.G. و G.B. بتحليل البيانات وإعداد المخطوطة. أشرف G.B. و M.T.G. على المشروع.

1. تصميم الدوائر الجينية
<ol><li>حدد المكونات الجينية لتتحد في دائرة جينية واحدة / بلازميد واحد (على سبيل المثال ، زخارف تسلسل تكامل الحمض النووي للثدييات 32 ، العناصر المستجيبة للضوء33 ، أو الجينات الوظيفية 34).</li>
	<li>باستخدام أي هندسة وراثية و/أو برنامج اس...

يمكن لقراء هذه المقالة اكتساب نظرة ثاقبة على الخطوات الحيوية لتوصيف الدوائر الجينية البصرية (بالإضافة إلى أنظمة التعبير الجيني الأخرى) ، بما في ذلك 1) تصميم الدوائر الجينية وبنائها والتحقق من صحتها. 2) هندسة الخلايا لإدخال الدوائر الجينية في خطوط الخلايا المستقرة (على سبيل المثال ، إعادة ت?...

وعلى غرار التخصصات الهندسية الأخرى، تهدف البيولوجيا التركيبية إلى توحيد البروتوكولات، مما يسمح باستخدام الأدوات ذات الوظائف القابلة للتكرار للغاية لاستكشاف الأسئلة ذات الصلة بالنظم البيولوجية1،2. أحد المجالات في البيولوجيا التركيبية حيث تم بناء العديد من أنظمة التحكم هو مجال تنظيم التعبير الجيني3,4. يمكن أن يستهدف التحكم في التعبير الجيني كلا من مستويات البروتين والتباين (الضوضاء أو معامل التباين ، CV = σ / μ ، مقاسا على أنه الانحراف المعياري عن المتوسط) ، وهي خصائص خلوية حاسمة بسبب أدوارها في الحالات الخلوية الفسيولوجية والمرضية5،6،7،8. تم تصميم العديد من الأنظمة الاصطناعية التي يمكنها التحكم في مستويات البروتين والضوضاء4،9،10،11،12 ، مما يخلق فرصا لتوحيد البروتوكولات عبر الأدوات.
إحدى الأدوات الجديدة التي يمكنها التحكم في شبكات الجينات التي ظهرت مؤخرا هي علم البصريات الوراثي ، مما يتيح استخدام الضوء للتحكم في التعبير الجيني13،14،15،16،17. على غرار سابقاتها الكيميائية، يمكن إدخال دوائر الجينات البصرية الجينية في أي نوع من الخلايا، بدءا من البكتيريا إلى الثدييات، مما يسمح بالتعبير عن أي جين في اتجاه مجرى النهر محل اهتمام18،19. ومع ذلك ، بسبب التوليد السريع للأدوات البصرية الجينية الجديدة ، ظهرت العديد من الأنظمة التي تختلف في بنية الدوائر الجينية ، وآلية التعبير (على سبيل المثال ، التكامل القائم على البلازميد مقابل التكامل الفيروسي) ، ومعدات التحكم في إمدادات الضوء 11،16،20،21،22،23،24،25 . لذلك ، فإن هذا يترك مجالا لتوحيد السمات البصرية الجينية مثل بناء الدوائر الجينية وتحسينها ، وطريقة استخدام النظام (على سبيل المثال ، التكامل مقابل التعبير العابر) ، والأدوات التجريبية المستخدمة في الحث ، وتحليل النتائج.
لإحراز تقدم في توحيد البروتوكولات البصرية الجينية في خلايا الثدييات، يصف هذا البروتوكول خط أنابيب تجريبي لهندسة الأنظمة البصرية الجينية في خلايا الثدييات باستخدام دائرة جينية ذات ردود فعل سلبية (NF) مدمجة في خلايا HEK293 (خط خلايا الكلى الجنينية البشرية) كمثال. NF هو نظام مثالي لإثبات التوحيد القياسي لأنه وفير للغاية26،27،28 في الطبيعة ، مما يسمح بضبط مستويات البروتين وتقليل الضوضاء. باختصار ، يسمح NF بالتحكم الدقيق في التعبير الجيني بواسطة المثبط الذي يقلل من تعبيره بسرعة كافية ، وبالتالي يحد من أي تغيير بعيدا عن الحالة الثابتة. يمكن تغيير الحالة الثابتة بواسطة محفز يعطل أو يزيل المثبط للسماح بمزيد من إنتاج البروتين حتى يتم الوصول إلى حالة مستقرة جديدة لكل تركيز محفز. في الآونة الأخيرة، تم إنشاء نظام بصري وراثي NF مصمم هندسيا يمكنه إنتاج استجابة ديناميكية واسعة للتعبير الجيني، والحفاظ على ضوضاء منخفضة، والاستجابة للمحفزات الضوئية مما يسمح بإمكانية التحكم في التعبير الجيني المكاني11. هذه الأدوات ، المعروفة باسم الموالفات المستحثة للضوء (LITers) ، مستوحاة من الأنظمة السابقة التي سمحت بالتحكم في التعبير الجيني في الخلايا الحية4،10،29،30 وتم دمجها بشكل ثابت في خطوط الخلايا البشرية لضمان التحكم في التعبير الجيني على المدى الطويل.
هنا، باستخدام LITer كمثال، يتم تحديد بروتوكول لإنشاء دوائر جينية مستجيبة للضوء، وتحفيز التعبير الجيني باستخدام جهاز لوحة الضوء (LPA، وهو جهاز تحريض بصري وراثي)31، وتحليل استجابات خطوط الخلايا المهندسة التي يمكن التحكم فيها بصريا لمحفزات الضوء المخصصة. يسمح هذا البروتوكول للمستخدمين باستخدام أدوات LITer لأي جين وظيفي يرغبون في استكشافه. ويمكن أيضا تكييفها مع الأنظمة البصرية الجينية الأخرى ذات معماريات الدوائر المتنوعة (على سبيل المثال، ردود الفعل الإيجابية، والتنظيم السلبي، وما إلى ذلك) من خلال دمج الأساليب والمعدات البصرية الوراثية الموضحة أدناه. على غرار بروتوكولات البيولوجيا التركيبية الأخرى ، يمكن تطبيق تسجيلات الفيديو والبروتوكولات البصرية الجينية الموضحة هنا في دراسات الخلية الواحدة في مجالات متنوعة ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر بيولوجيا السرطان والتطور الجنيني وتمايز الأنسجة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

يتطلب التحكم الموثوق في التعبير الجيني في خلايا الثدييات أدوات ذات تغيير عالي في الطية ، وضوضاء منخفضة ، ووظائف نقل محددة من المدخلات إلى المخرجات ، بغض النظر عن الطريقة المستخدمة. ولتحقيق هذا الهدف، اكتسبت أنظمة التعبير الجيني البصري الوراثي الكثير من الاهتمام على مدى العقد الماضي للتحكم الزماني المكاني في مستويات البروتين في خلايا الثدييات. ومع ذلك، فإن معظم الدوائر الحالية التي تتحكم في التعبير الجيني الناجم عن الضوء تختلف في العمارة، ويتم التعبير عنها من البلازميدات، وتستخدم معدات بصرية وراثية متغيرة، مما يخلق حاجة لاستكشاف توصيف وتوحيد المكونات البصرية الجينية في خطوط الخلايا المستقرة. هنا ، توفر الدراسة خط أنابيب تجريبي لبناء دائرة جينية موثوقة ، والتكامل ، والتوصيف للتحكم في التعبير الجيني المستحث للضوء في خلايا الثدييات ، باستخدام دائرة بصرية وراثية سلبية كمثال على ذلك. توضح البروتوكولات أيضا كيف يمكن لتوحيد المعدات البصرية الوراثية وأنظمة الضوء أن يكشف بشكل موثوق عن ميزات الدائرة الجينية مثل ضوضاء التعبير الجيني وحجم التعبير البروتيني. وأخيرا، قد تكون هذه الورقة مفيدة للمختبرات غير المألوفة في علم البصريات الوراثي الذين يرغبون في اعتماد مثل هذه التكنولوجيا. يجب أن ينطبق خط الأنابيب الموصوف هنا على الدوائر البصرية الجينية الأخرى في خلايا الثدييات ، مما يسمح بتوصيف أكثر موثوقية وتفصيلا والتحكم في التعبير الجيني على مستوى النسخ والبروتيوم والنمط الظاهري في نهاية المطاف في خلايا الثدييات.

استند تجميع الدوائر الجينية وتوليد خط الخلية المستقرة في هذه المقالة إلى خلايا HEK-293 التجارية المعدلة التي تحتوي على موقع FRT واحد مستقر نشط نسخيا (الشكل 1). تم بناء الدوائر الجينية في ناقلات تحتوي على مواقع FRT داخل البلازميد ، مما يسمح بدمج Flp-FRT في جينوم خلية HEK-293. لا يقتصر هذا ?...

Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

يتطلب التحكم الموثوق في خلايا الثدييات المستجيبة للضوء توحيد الطرق البصرية الوراثية. ولتحقيق هذا الهدف، تحدد هذه الدراسة خط أنابيب لبناء الدوائر الجينية، وهندسة الخلايا، وتشغيل المعدات البصرية الوراثية، واختبارات التحقق لتوحيد دراسة التعبير الجيني الناجم عن الضوء باستخدام دائرة جينية بصرية وراثية سلبية كدراسة حالة.

هندسة ومراقبة الدوائر الجينية البصرية المستقرة في خلايا الثدييات بشكل موثوق

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

تم تصميم البروتوكول البصري الوراثي الموحد للمختبرات المهتمة باستخدام الضوء كحافز للتحكم في الخصائص الخلوية في أنظمة خلايا الثدييات الهندسية. من السهل تنفيذ هذا البروتوكول في المختبرات التي لا تعرف علم البصريات الوراثي ويوفر طرقا للتحكم الزماني المكاني الدقيق في الأنظمة البيولوجية الهندسية. هذه الطريقة لديها مجموعة واسعة من التطبيقات في مجالات بحثية محددة حيث قد تكون المعلومات المكانية الزمانية مهمة بما في ذلك بيولوجيا السرطان وبيولوجيا النظم وتمايز الأنسجة.بادئ ذي بدء ، حدد المكونات الوراثية لدمجها في دائرة جينية واحدة أو بلازميد. على سبيل المثال ، مواقع تكامل الحمض النووي للثدييات ، أو العناصر المستجيبة للضوء ، أو الجينات الوظيفية. بعد تجميع وفحص جميع الميزات الضرورية مثل كودونات البدء ، والتسلسلات التنظيمية أو المترجمة ، استخدم أي هندسة وراثية وبرامج استنساخ جزيئية ، وقم بالتعليق على تسلسلات الحمض النووي وتخزينها لاستخدامها لاحقا وكمرجع.التحقق من صحة الاشعال حسابيا لبناء البلازميد من خلال ميزات برنامج الاستنساخ الجزيئي المدمج، على سبيل المثال، محاذاة التسلسل. لتوليد خط خلية مستقر ، قم بنقل الدوائر الجينية المصممة والخلايا المطلوبة باستخدام خليط دهني من الحمض النووي لدائرة الجينات مع المؤتلف المناسب. بعد أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80 إلى 100٪ ، قم بتجميد الخلايا في مزيج من 45٪ من الوسائط القديمة ، و 45٪ من الوسائط الجديدة ، و 10٪ DMSO.انقل الخلايا المتبقية إلى أنبوب معقم وقم بإجراء فرز أحادي الخلية لعزل الخلايا وحيدة النسيلة في صفيحة من 96 بئرا. بعد حوالي أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من الفرز أحادي النسيلة ، يجب أن تحتوي الآبار داخل لوحة البئر المكونة من 96 بئرا على بؤر. عندما يتم تحقيق التقاء 50 إلى 60 ٪ ، قم بتقسيم الخلايا إلى لوحة من 12 بئرا.أضف البرنامج الثابت إلى دائرة LPA المجمعة باستخدام مبرمج متحكم دقيق. بعد ذلك ، قم بدمج الأجزاء المطبوعة 3D في لوحة الدوائر المجمعة باستخدام لوحة التركيب ، ولوحة الدوائر ، وفاصل LED ، ومحول اللوحة ، ولوحة 24 بئرا ، وغطاء اللوحة ، ومسامير التركيب ، وصواميل الجناح ومكونات التراص. لبدء تجربة بصرية وراثية، استخدم برنامج Iris المتوفر على موقع Tabor Lab على الويب لبرمجة بطاقة SD ل LPA واستكشاف ظروف الإضاءة المناسبة.بعد ذلك ، أدخل قيم الكثافة مع النسخ المتماثلة التقنية للمخطط التفصيلي التجريبي المطلوب. أضف حوالي 75000 خلية لكل بئر في صفيحة سوداء مكونة من 24 بئرا بحجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر ، ثم ضع الخلايا في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون للسماح لها بالاستقرار لمدة ساعتين إلى ست ساعات. بعد نقل الخلايا الموجودة في غطاء زراعة الأنسجة في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الغطاء البلاستيكي وإضافة شريط رقائق لاصق إلى أعلى اللوحة لتقليل نقل الضوء بين الآبار بحيث لا يمكن للضوء الدخول إلا من خلال LED الموجود في أسفل البئر.ضع اللوحة في الأجزاء ثلاثية الأبعاد المجهزة من LPA ، ثم قم بتغطية اللوحة بغطاء LPA المطبوع ثلاثي الأبعاد والذي يتناسب مع مسامير الجهاز في كل زاوية. قم بتوصيل الجهاز بمصدر الطاقة واضغط على زر إعادة الضبط على جهاز LPA لضمان تطبيق إعدادات تجربة LPA المحدثة واحتضان الخلايا. بعد الحضانة ، داخل غطاء زراعة الأنسجة ، قم بإزالة شريط الرقائق من اللوحة واترك اللوحة لمدة دقيقة إلى دقيقتين لمنع التكثيف من التشكل على الغطاء البلاستيكي.بعد ذلك ، ضع الغطاء البلاستيكي الأصلي مرة أخرى على اللوحة وصور الخلايا باستخدام تباين الطور المناسب أو المجهر الفلوري. بعد 24 إلى 72 ساعة بعد الحث ، تليها التربسينات ، قم بنقل محتويات كل بئر بالكامل من حوالي 500 ميكرولتر إلى الأنابيب الموسومة المجهزة بمصفاة الخلايا. ثم باستخدام برنامج أداة قياس التدفق الخلوي المناسب ، قم بإنشاء بوابة تشتت أمامية وجانبية لالتقاط الخلايا المفردة ذات الحجم والدقة المناسبين لاستبعاد الحطام والكتل الخلوية.بمجرد تعيين البوابة ، التقط ما يقرب من 10،000 خلية باستخدام البوابة المناسبة واضبط رقم الخلية اعتمادا على كمية البيانات الخلوية المطلوبة وكرر التقاط الخلايا التجريبية في كل أنبوب. بعد الحث والتريبسين ، انقل محتويات كل بئر بالكامل تبلغ حوالي 500 ميكرولتر إلى الأنابيب الموسومة. الطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق في 400 مرة G.بعد التخلص من supernatant ، انقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي.أعد تعليق الخلايا في 750 إلى 1،000 ميكرولتر من 4٪ PFA المخفف في PBS وماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لكسر كتل الخلايا. بعد 15 دقيقة من الحضانة ، أضف 750 إلى 1000 ميكرولتر من PBS ومرة أخرى ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ثم قم بتكسير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 400 مرة G في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من السوبرناتانت ، انقل العينات إلى غطاء دخان كيميائي وأعد تعليق الخلايا في 750 إلى 1،000 ميكرولتر من الميثانول البارد المثلج كما هو موضح واسمح للخلايا بالجلوس لمدة 30 دقيقة في ثلاجة 20 درجة مئوية تحت الصفر.بعد الحضانة ، أضف 750 إلى 1،000 ميكرولتر من PBS أثناء السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. ثم بعد الطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق عند 400 مرة G ، تخلص من المادة الفائقة وانقل العينات إلى غطاء الدخان الكيميائي. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر أو أي تخفيف مناسب آخر للأجسام المضادة الأولية المصنفة وماصة لأعلى ولأسفل من ست إلى ثماني مرات ، ثم احتضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك ، أضف 750 إلى 1،000 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحضانة ومحلول الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق بسرعة 400 مرة G.Next ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS وكسر الكتل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. انقل محتويات كل أنبوب بالكامل إلى أنابيب تحمل علامات مع مصافي الخلايا. أحضر الخلايا إلى أدوات قياس التدفق الخلوي المناسبة باستخدام أشعة الليزر ذات الأطوال الموجية الصحيحة.تم إجراء المعايرة البصرية للأجهزة. باستخدام الصورة المكتسبة ، تم حساب قيم التعويض عن LED ، وتم طرح إشارة الخلفية ، وتم استنتاج كثافة البكسل. وكان معامل التباين ضئيلا بين 96 بئرا.أظهر برنامج المعايرة تباين LED حسب الموقع وأنشأ تعديلا للمقياس الرمادي بحيث يتم تطبيع كل مؤشر LED بنفس الكثافة. تم تحفيز التعبير الجيني في الخلايا الأخف وزنا المهندسة عبر المجهر الفلوري في فترات نبض الضوء المختلفة على LPA وتم تصوير الخلايا لتعبير Brightfield و GFP. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تم تحفيز الخلايا بقيم مختلفة لطول النبض وأظهرت استجابة جرعة من التعبير الجيني كميا على مستوى السكان بأكثر من أربعة أضعاف التغيير من الحالات غير المستحثة.حققت ردود الفعل السلبية أكثر من خمسة أضعاف الحد من ضوضاء التعبير الجيني كما هو موضح من خلال مقارنة قيم شدة الضوء المختلفة للنظام الأخف وزنا مقابل الضوء النابض بالحياة أو الضوء. أظهر تحليل qPCR أن الخلايا الأخف وزنا هندسيا عبرت عن مستويات الحمض النووي الريبي بطريقة تستجيب للجرعة مع تحريض يزيد عن عشرة أضعاف من الحالات غير المستحثة ، مما يطابق كمية التدفق الخلوي. أظهرت الدائرة الجينية الأخف وزنا هندسيا كميات متزايدة من الضوء الأزرق الذي أدى إلى زيادة مستويات بروتين KRAS ومستويات ERK المفسفرة.يمكن إجراء العديد من الفحوصات الوظيفية بما في ذلك النمو أو حركة الخلايا أو التئام الجروح أو الانتشار أو فحوصات الغزو. يمكن أن توفر هذه الطرق رؤى محددة حول آليات بيولوجيا السرطان أو تمايز الأنسجة أو مقاومة الأدوية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

المفاعلات الحيوية الألياف المجوفة ل<em&gt; في فيفو</em&gt; تشبه الثدييات زراعة الأنسجة

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

تصميم وتنفيذ لإلقاء الضوء الآلي، التثقيف، ونظام أخذ العينات للتطبيقات الميكروبية علم البصريات الوراثي

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

انقسام الخلية الثديية في مصفوفات ثلاثية الأبعاد عن طريق الفحص المجهري انعكاس [كنفوكل] الكمية

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

استزراع خلايا الثدييات في السقالات ببتيد ثلاثي الأبعاد

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

المداري تهز ثقافة خلايا الثدييات في السفن على شكل س لإنتاج المجاميع الموحدة

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

إلكترونيات مش حقن حقنه للكهربية القوارض المزمنة المستقرة

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...