Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

我们要感谢Balázsi实验室的意见和建议，Karl P. Gerhardt博士和Jeffrey J. Tabor博士帮助我们构建了第一个LPA，以及Wilfried Weber博士分享了LOV2-degron质粒。这项工作得到了美国国立卫生研究院[R35 GM122561和T32 GM008444]的支持;劳弗物理与定量生物学中心;以及国防科学与工程研究生（NDSEG）奖学金。开放获取费用的资金：NIH [R35 GM122561]。
作者贡献：M.T.G.和G.B.构思了这个项目。M.T.G.，D.C.和L.G.进行了实验。M.T.G.、D.C.、L.G.和G.B分析了数据并准备了手稿。G.B.和M.T.G.监督了这个项目。

1. 基因电路设计
<ol><li>选择遗传成分以组合成单个基因回路/质粒（例如，哺乳动物DNA整合序列基序32，光响应元件33或功能基因34）。</li>
	<li>使用任何基因工程和/或分子克隆软件，存储DNA序列以供以后使用和参考，注释每个序列，并检查所有必要的特征（例如，START密码子，调控或翻译序列）35。</li>
	<li>根据整体基因电路?...

本文的读者可以深入了解表征光遗传学基因回路（以及其他基因表达系统）至关重要的步骤，包括1）基因回路的设计，构建和验证;2）用于将基因电路引入稳定细胞系的细胞工程（例如，Flp-FRT重组）;3）使用基于光的平台（如LPA）诱导工程电池;4）通过荧光显微镜对光诱导测定进行初始表征;5）通过各种测定进行最终的基因表达表征，包括流式细胞术，定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）或免疫荧光测?...

与其他工程学科类似，合成生物学旨在标准化实验方案，允许使用具有高度可重复功能的工具来探索与生物系统相关的问题1，2。合成生物学中已经建立了许多控制系统的一个领域是基因表达调控领域3，4。基因表达控制可以靶向蛋白质水平和变异性（噪声或变异系数，CV = σ/μ，作为平均值的标准偏差测量），这是关键的细胞特征，因为它们在生理和病理细胞状态中的作用5，6，7，8。许多可以控制蛋白质水平和噪声的合成系统4，9，10，11，12 已经过设计，为跨工具标准化协议创造了机会。
最近出现的一套可以控制基因网络的新工具是光遗传学，能够使用光来控制基因表达13，14，15，16，17。与它们的化学前身类似，光遗传学基因回路可以引入任何细胞类型，从细菌到哺乳动物，允许表达任何感兴趣的下游基因18，19。然而，由于新型光遗传学工具的快速产生，许多系统在遗传电路结构、表达机制（例如，基于质粒与病毒整合）和供光控制设备方面存在差异11，16，20，21，22，23，24，25.因此，这为光遗传学特征的标准化留下了空间，例如基因电路构建和优化，系统利用方法（例如，积分与瞬态表达），用于诱导的实验工具以及结果分析。
为了在哺乳动物细胞中标准化光遗传学方案方面取得进展，该协议描述了一种实验管道，以使用集成到HEK293细胞（人类胚胎肾细胞系）中的负反馈（NF）基因电路来设计哺乳动物细胞中的光遗传学系统为例。NF是证明标准化的理想系统，因为它在本质上非常丰富26，27，28 ，允许调整蛋白质水平并实现噪声最小化。简而言之，NF允许通过抑制器精确控制基因表达，从而足够快地减少其自身表达，从而限制远离稳定状态的任何变化。稳态可以通过诱导剂来改变，该诱导剂使抑制剂失活或消除抑制剂，以允许更多的蛋白质产生，直到每个诱导剂浓度达到新的稳态。最近，一种工程NF光遗传学系统被创建出来，该系统可以产生基因表达的宽动态响应，保持低噪声，并对光刺激做出反应，从而具有空间基因表达控制的潜力11。这些工具被称为光诱导调节器（LITers），其灵感来自早期的系统，该系统允许在活细胞中进行基因表达控制4，10，29，30 ，并稳定地整合到人类细胞系中以确保长期的基因表达控制。
在这里，以LITer为例，概述了一种方案，用于创建光响应基因电路，使用光板装置（LPA，一种光遗传学诱导硬件）诱导基因表达31，并分析工程化的光遗传学可控细胞系对定制光刺激的反应。该协议允许用户将LITer工具用于他们希望探索的任何功能基因。它还可以通过集成下面概述的方法和光遗传学设备，适用于具有不同电路架构（例如，正反馈、负调节等）的其他光遗传学系统。与其他合成生物学方案类似，此处概述的视频记录和光遗传学方案可以应用于不同领域的单细胞研究，包括但不限于癌症生物学，胚胎发育和组织分化。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

无论使用何种方法，哺乳动物细胞中可靠的基因表达控制都需要具有高折叠变化、低噪声和确定的输入到输出传递函数的工具。为了实现这一目标，光遗传学基因表达系统在过去十年中因哺乳动物细胞中蛋白质水平的时空控制而受到广泛关注。然而，大多数控制光诱导基因表达的现有电路在结构上各不相同，由质粒表达，并利用可变光遗传学设备，因此需要探索稳定细胞系中光遗传学成分的表征和标准化。在这里，该研究提供了可靠的基因电路构建，整合和表征的实验管道，用于控制哺乳动物细胞中的光诱导基因表达，以负反馈光遗传学电路为例。这些方案还说明了标准化光遗传学设备和光照制度如何可靠地揭示基因电路特征，如基因表达噪声和蛋白质表达幅度。最后，本文可能适用于希望采用这种技术的光遗传学不熟悉的实验室。这里描述的管道应该适用于哺乳动物细胞中的其他光遗传学回路，从而可以在哺乳动物细胞的转录，蛋白质组学和最终表型水平上更可靠，更详细地表征和控制基因表达。

本文中的基因电路组装和稳定细胞系生成基于含有转录活性，单个稳定FRT位点的商业改良HEK-293细胞（图1）。基因回路被构建到质粒内具有FRT位点的载体中，允许Flp-FRT整合到HEK-293细胞基因组中。这种方法不仅限于Flp-In细胞，因为FRT位点可以使用DNA编辑技术（如CRISPR / Cas950）添加到基因组中任何感兴趣的细胞系中。
一旦构建并验证了正?...

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Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

可靠地控制光响应性哺乳动物细胞需要光遗传学方法的标准化。为了实现这一目标，本研究概述了基因电路构建，细胞工程，光遗传学设备操作和验证分析的管道，以标准化使用负反馈光遗传学基因电路作为案例研究的光诱导基因表达研究。

可靠地工程和控制哺乳动物细胞中稳定的光遗传学基因回路

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

标准化的光遗传学方案专为有兴趣使用光作为刺激来控制工程哺乳动物细胞系统中的细胞特性的实验室而设计。该协议易于在不熟悉光遗传学的实验室中实施，并为工程生物系统的精确时空控制提供了方法。该方法在特定研究领域具有广泛的应用，其中时空信息可能很重要，包括癌症生物学，系统生物学和组织分化。首先，选择遗传成分以结合成单个基因回路或质粒。例如，哺乳动物DNA整合位点、光响应元件或功能基因。在组装和检查所有必要的特征（如起始密码子，调控或翻译序列）后，使用任何基因工程和分子克隆软件，注释和存储DNA序列以供以后使用并作为参考。通过内置的分子克隆软件功能（例如，序列比对）以计算方式验证质粒构建的引物。为了产生稳定的细胞系，请使用基因电路DNA的脂质体混合物和适当的重组酶转染设计基因电路和所需细胞。细胞汇合80%至100%后，将细胞冷冻在45%旧培养基，45%新鲜培养基和10%DMSO的混合物中。将剩余细胞转移到无菌管中并进行单细胞分选，以将单克隆细胞分离到96孔板中。单克隆分选后约两到三周，96孔板内的孔应具有病灶。当达到50%至60%的汇合度时，将细胞分裂成12孔板。使用微控制器编程器将固件添加到组装的LPA电路中。接下来，使用安装板，电路板，LED垫片，板适配器，24孔板，板盖，安装螺栓，翼形螺母和堆叠组件将3D打印部件组合在组装的电路板中。要开始光遗传学实验，请使用Tabor Lab网站上提供的Iris软件为LPA编程SD卡并探索适当的光照条件。接下来，输入强度值以及所需实验大纲的技术仿制品。在总体积为500微升的24孔黑板中每孔添加约75， 000个细胞，然后将细胞置于具有5%二氧化碳的加湿培养箱中，使它们沉降两到六个小时。在孵育结束时将细胞转移到组织培养罩中后，取下塑料盖并将粘合箔条添加到板的顶部，以最大限度地减少孔之间的光转移，以便光只能通过位于孔底部的LED进入。将板放在LPA的安装3D部件中，然后用3D打印的LPA盖子覆盖板，该盖子适合每个角落上的设备螺钉。将器件插入电源，然后按下LPA器件上的复位按钮，以确保应用更新的LPA实验设置并孵育细胞。孵育后，在组织培养罩内，从板上取下铝箔条，让板静置一到两分钟，以防止在塑料盖上形成冷凝。接下来，将原始塑料盖放回板上，并用适当的相差或荧光显微镜对细胞进行成像。诱导后24至72小时后，然后胰蛋白酶消化，将每个孔中约500微升的全部内容物转移到装有细胞过滤器的标记管中。然后使用适当的流式细胞术仪器软件，创建一个正向和侧面散射门，以捕获适当大小和粒度的单个细胞，以排除碎片和细胞团块。设置门后，使用适当的门捕获大约10， 000个细胞，并根据所需的细胞数据量调整细胞数量，并在每个管中重复捕获实验细胞。诱导和胰蛋白酶消化后，将每个孔中约500微升的全部内容物转移到标记的管中。在丢弃上清液后，将细胞以400倍G离心五分钟，将样品移至化学通风橱中。将细胞重悬于750至1， 000微升4%PFA稀释在PBS中，并上下移液几次以破坏细胞团块。孵育15分钟后，加入750至1， 000微升PBS，并再次上下移液几次，然后在室温下以400倍G下沉淀细胞5分钟。丢弃上清液后，将样品移至化学通风橱，并将细胞重悬于750至1， 000微升冰冷甲醇中，如图所示，并允许细胞在零下20摄氏度的冰箱中静置30分钟。孵育后，加入750至1， 000微升PBS，同时通过上下移液几次。然后在以400倍G离心细胞五分钟后，丢弃上清液并将样品移动到化学通风橱中。将细胞重悬于100微升或其他合适的标记一抗稀释液中，上下移液6至8次，然后在室温下孵育一小时。接下来，上下加入750至1， 000微升的孵育缓冲液和移液器溶液，然后以400次G.Next离心细胞五分钟，将细胞重悬于500微升PBS中，并通过上下移液几次来破坏团块。将每个管的全部内容物转移到带有细胞过滤器的标记管中。将细胞带到具有正确波长激光的适当流式细胞术仪器。对设备进行了光学校准。利用采集到的图像，计算LED的补偿值，减去背景信号，推导像素强度。96口井之间的变异系数最小。校准软件按位置演示了 LED 的变化，并创建了灰度调整，以便每个 LED 都归一化为相同的强度。通过荧光显微镜在LPA上以不同的光脉冲持续时间在工程化的较轻细胞中诱导基因表达，并对细胞进行明场和GFP表达成像。使用流式细胞术，在不同的脉冲长度值下诱导细胞，并显示出在群体水平上定量的基因表达的剂量反应，与未诱导状态相比变化超过四倍。负反馈实现了超过五倍的基因表达降噪，通过比较较轻系统与生动或亮起的各种光强度值来显示。qPCR分析表明，工程化的较轻细胞以剂量响应的方式表达RNA水平，从未诱导状态诱导超过十倍，与流式细胞术定量相匹配。工程化的较轻基因电路显示蓝光量增加，导致KRAS蛋白水平升高和磷酸化ERK水平升高。可以进行多种功能测定，包括生长，细胞活力，伤口愈合，增殖或侵袭测定。这些方法可以为癌症生物学，组织分化或耐药性的机制提供具体的见解。

Research

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