Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Vi vil gerne takke Balázsi lab for kommentarer og forslag, Dr. Karl P. Gerhardt og Dr. Jeffrey J. Tabor for at hjælpe os med at konstruere den første LPA, og Dr. Wilfried Weber for at dele LOV2-degron plasmiderne. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [R35 GM122561 og T32 GM008444]; Laufer Center for Fysisk og Kvantitativ Biologi; og et National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Finansiering af open access-afgift: NIH [R35 GM122561].
Forfatterbidrag: M.T.G. og G.B. udtænkte projektet. M.T.G., D.C. og L.G. udførte eksperimenterne. M.T.G., D.C., L.G. og G.B. analyserede dataene og udarbejdede manuskriptet. G.B. og M.T.G. førte tilsyn med projektet.

1. Genkredsløb design
<ol><li>Vælg genetiske komponenter, der skal kombineres til et enkelt genkredsløb/plasmid (f.eks. pattedyrs DNA-integrationssekvensmotiver32, lysresponsive elementer33 eller funktionelle gener34).</li>
	<li>Ved hjælp af enhver form for genteknologi og/eller molekylær kloningssoftware skal DNA-sekvenserne opbevares til senere brug og reference, kommentere hver sekvens og undersøge alle de nødvendige funktioner (f.eks. ST...

Læsere af denne artikel kan få indsigt i de trin, der er afgørende for at karakterisere optogenetiske genkredsløb (såvel som andre genekspressionssystemer), herunder 1) genkredsløbsdesign, konstruktion og validering; 2) celleteknik til introduktion af genkredsløb i stabile cellelinjer (f.eks. Flp-FRT-rekombination); 3) induktion af de konstruerede celler med en lysbaseret platform såsom LPA; 4) indledende karakterisering af lysinduktionsassays via fluorescensmikroskopi; og 5) endelig genekspressionskarakteriserin...

I lighed med andre ingeniørdiscipliner sigter syntetisk biologi mod at standardisere protokoller, hvilket gør det muligt at bruge værktøjer med meget reproducerbare funktioner til at udforske spørgsmål, der er relevante for biologiske systemer1,2. Et domæne inden for syntetisk biologi, hvor mange kontrolsystemer er blevet bygget, er området for genekspressionsregulering3,4. Genekspressionskontrol kan målrette mod både proteinniveauer og variabilitet (støj eller variationskoefficient, CV = σ / μ, målt som standardafvigelsen over gennemsnittet), som er afgørende cellulære egenskaber på grund af deres roller i fysiologiske og patologiske cellulære tilstande5,6,7,8. Mange syntetiske systemer, der kan styre proteinniveauer og støj4,9,10,11,12, er blevet konstrueret, hvilket skaber muligheder for at standardisere protokoller på tværs af værktøjer.
Et nyt sæt værktøjer, der kan kontrollere gennetværk, der for nylig er opstået, er optogenetik, der muliggør brug af lys til at kontrollere genekspression13,14,15,16,17. I lighed med deres kemiske forgængere kan optogenetiske genkredsløb indføres i enhver celletype, lige fra bakterier til pattedyr, hvilket muliggør ekspression af ethvert nedstrøms gen af interesse18,19. På grund af den hurtige generering af nye optogenetiske værktøjer er der imidlertid opstået mange systemer, der varierer i genetisk kredsløbsarkitektur, ekspressionsmekanisme (f.eks. plasmidbaseret vs. viral integration) og lysforsyningskontroludstyr11,16,20,21,22,23,24,25 . Derfor giver dette plads til standardisering af optogenetiske træk såsom genkredsløbskonstruktion og optimering, metode til systemudnyttelse (f.eks. Integration vs. forbigående ekspression), eksperimentelle værktøjer, der anvendes til induktion, og analyse af resultater.
For at gøre fremskridt med at standardisere optogenetiske protokoller i pattedyrceller beskriver denne protokol en eksperimentel pipeline til at konstruere optogenetiske systemer i pattedyrceller ved hjælp af et negativt feedback (NF) genkredsløb integreret i HEK293-celler (human embryonal nyrecellelinje) som et eksempel. NF er et ideelt system til at demonstrere standardisering, da det er meget rigeligt26,27,28 i naturen, hvilket gør det muligt at indstille proteinniveauer og støjminimering at forekomme. Kort fortalt giver NF mulighed for præcis genekspressionskontrol af en repressor, der reducerer sit eget udtryk tilstrækkeligt hurtigt og derved begrænser enhver ændring væk fra en stabil tilstand. Steady state kan ændres af en inducer, der inaktiverer eller eliminerer repressoren for at muliggøre mere proteinproduktion, indtil en ny stabil tilstand er nået for hver inducerkoncentration. For nylig blev der oprettet et konstrueret NF-optogenetisk system, der kan producere et bredt dynamisk respons af genekspression, opretholde lav støj og reagere på lysstimuli, der muliggør potentialet for rumlig genekspressionskontrol11. Disse værktøjer, kendt som lysinducerbare tunere (LITere), blev inspireret af tidligere systemer, der tillod genekspressionskontrol i levende celler4,10,29,30 og blev stabilt integreret i humane cellelinjer for at sikre langsigtet genekspressionskontrol.
Her er der ved hjælp af LITer som et eksempel skitseret en protokol til oprettelse af lysresponsive genkredsløb, inducering af genekspression med et lyspladeapparat (LPA, en optogenetisk induktionshardware)31 og analysere reaktioner fra de konstruerede, optogenetisk kontrollerbare cellelinjer til brugerdefinerede lysstimuli. Denne protokol giver brugerne mulighed for at bruge LITer-værktøjerne til ethvert funktionelt gen, de ønsker at udforske. Det kan også tilpasses til andre optogenetiske systemer med forskellige kredsløbsarkitekturer (f.eks. Positiv feedback, negativ regulering osv.) ved at integrere de metoder og optogenetisk udstyr, der er beskrevet nedenfor. I lighed med andre syntetiske biologiske protokoller kan de videooptagelser og optogenetiske protokoller, der er skitseret her, anvendes i enkeltcellestudier på forskellige områder, herunder, men ikke begrænset til, kræftbiologi, embryonal udvikling og vævsdifferentiering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

Pålidelig genekspressionskontrol i pattedyrceller kræver værktøjer med høj foldændring, lav støj og bestemte input-to-output-overførselsfunktioner, uanset hvilken metode der anvendes. Mod dette mål har optogenetiske genekspressionssystemer fået stor opmærksomhed i løbet af det sidste årti for spatiotemporal kontrol af proteinniveauer i pattedyrceller. Imidlertid varierer de fleste eksisterende kredsløb, der styrer lysinduceret genekspression, i arkitektur, udtrykkes fra plasmider og bruger variabelt optogenetisk udstyr, hvilket skaber et behov for at udforske karakterisering og standardisering af optogenetiske komponenter i stabile cellelinjer. Her giver undersøgelsen en eksperimentel pipeline af pålidelig genkredsløbskonstruktion, integration og karakterisering til styring af lysinducerbar genekspression i pattedyrceller ved hjælp af et negativt feedback optogenetisk kredsløb som et case-eksempel. Protokollerne illustrerer også, hvordan standardisering af optogenetisk udstyr og lysregimer pålideligt kan afsløre genkredsløbsfunktioner såsom genekspressionsstøj og proteinekspressionsstørrelse. Endelig kan dette papir være til nytte for laboratorier, der ikke er bekendt med optogenetik, der ønsker at vedtage en sådan teknologi. Den her beskrevne rørledning bør gælde for andre optogenetiske kredsløb i pattedyrceller, hvilket giver mulighed for mere pålidelig, detaljeret karakterisering og kontrol af genekspression på transkriptionelt, proteomisk og i sidste ende fænotypisk niveau i pattedyrceller.

Genkredsløbssamling og stabil cellelinjegenerering i denne artikel var baseret på kommercielle, modificerede HEK-293-celler indeholdende et transkriptionelt aktivt, enkelt stabilt FRT-sted (figur 1). Genkredsløbene blev konstrueret i vektorer, der havde FRT-steder i plasmidet, hvilket muliggør Flp-FRT-integration i HEK-293-cellegenomet. Denne tilgang er ikke begrænset til Flp-In-celler, da FRT-steder kan føjes til enhver cellelinje af interesse overalt i genomet ved hjælp af DNA-redig...

Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Pålidelig styring af lysresponsive pattedyrceller kræver standardisering af optogenetiske metoder. Mod dette mål skitserer denne undersøgelse en pipeline af genkredsløbskonstruktion, celleteknik, optogenetisk udstyrsoperation og verifikationsassays for at standardisere undersøgelsen af lysinduceret genekspression ved hjælp af et optogenetisk genkredsløb med negativ feedback som et casestudie.

Pålideligt at konstruere og kontrollere stabile optogenetiske genkredsløb i pattedyrceller

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Den standardiserede optogenetiske protokol er designet til laboratorier, der er interesseret i at bruge lys som stimulans til at kontrollere cellulære egenskaber i konstruerede pattedyrcellesystemer. Denne protokol er let at implementere i laboratorier, der ellers ikke er bekendt med optogenetik og giver metoder til præcis rumlig tidsmæssig kontrol af konstruerede biologiske systemer. Denne metode har en bred vifte af anvendelse inden for specifikke forskningsområder, hvor spatiotemporal information kan være vigtig, herunder kræftbiologi, systembiologi og vævsdifferentiering.Til at begynde med skal du vælge de genetiske komponenter, der skal kombineres binde i et enkelt genkredsløb eller plasmid. For eksempel pattedyrs DNA-integrationssteder, lette responsive elementer eller funktionelle gener. Efter at have samlet og undersøgt alle de nødvendige funktioner såsom startkodoner, regulatoriske eller oversatte sekvenser, skal du bruge enhver genteknologi og molekylær kloningssoftware, kommentere og gemme DNA-sekvenserne til senere brug og som reference.Valider primerne beregningsmæssigt til plasmidkonstruktion gennem de indbyggede molekylære kloningssoftwarefunktioner, for eksempel sekvensjustering. For at generere en stabil cellelinje skal du transfektere designgenkredsløbene og de ønskede celler ved hjælp af en liposomblanding af genkredsløbets DNA med passende rekombinase. Når cellerne er 80 til 100% sammenflydende, fryses cellerne i en blanding af 45% gamle medier, 45% friske medier og 10% DMSO.Overfør de resterende celler til et sterilt rør og udfør enkeltcellesortering for at isolere monoklonale celler i en 96-brønds plade. Omkring to til tre uger efter monoklonal sortering skal brøndene inden for 96-brøndspladen have foci. Når 50 til 60% sammenflydning er opnået, opdeles cellerne i en 12-brønds plade.Føj firmwaren til det samlede LPA-kredsløb ved hjælp af en mikrocontroller-programmør. Derefter kombineres 3D-trykte dele i det samlede printkort ved hjælp af monteringspladen, printkortet, LED-afstandsrummet, pladeadapteren, en 24-brønds plade, et pladelåg, monteringsbolte, vingemøtrikker og stablingskomponenter. For at starte et optogenetisk eksperiment skal du bruge Iris-softwaren, der er tilgængelig på Tabor Lab-webstedet, til at programmere et SD-kort til LPA og udforske passende lysforhold.Indtast derefter intensitetsværdier med de tekniske replikater for den ønskede eksperimentelle oversigt. Tilsæt ca. 75.000 celler pr. Brønd i en 24-brønds sort plade i et samlet volumen på 500 mikroliter, og placer derefter cellerne i en befugtet inkubator med 5% kuldioxid for at give dem mulighed for at slå sig ned i to til seks timer. Efter overførsel af cellerne i vævskulturhætten i slutningen af inkubationen skal du fjerne plastlåget og tilføje en klæbende foliestrimmel til toppen af pladen for at minimere lysoverførslen mellem brøndene, så lyset kun kan komme ind gennem LED'en placeret i bunden af brønden.Anbring pladen i de monterede 3D-dele af LPA'en, og dæk derefter pladen med det 3D-printede LPA-låg, der passer over enhedens skruer i hvert hjørne. Sæt enheden i strømkilden, og tryk på nulstillingsknappen på LPA-enheden for at sikre, at de opdaterede LPA-eksperimentindstillinger anvendes og inkuberer cellerne. Efter inkubation, inde i vævskulturhætten, skal du fjerne foliestrimlen fra pladen og lade pladen sidde i et til to minutter for at forhindre, at der dannes kondens på plastlåget.Sæt derefter det originale plastlåg tilbage på pladen og forestil dig cellerne med det passende fasekontrast- eller fluorescensmikroskop. Efter 24 til 72 timer efter induktion, efterfulgt af trypsinisering, overføres hele indholdet af hver brønd på ca. 500 mikroliter til de mærkede rør udstyret med cellesilen. Derefter skal du ved hjælp af passende flowcytometriinstrumentsoftware oprette en fremadgående og sidespredningsport for at fange enkeltcellerne i passende størrelse og granularitet for at udelukke snavs og cellulære klumper.Når porten er indstillet, skal du fange ca. 10.000 celler med den relevante port og justere cellenummeret afhængigt af mængden af cellulære data, der kræves, og gentag gentag indfangning af eksperimentelle celler i hvert rør. Efter induktion og trypsinisering overføres hele indholdet af hver brønd på ca. 500 mikroliter til de mærkede rør. Centrifuger cellerne i fem minutter ved 400 gange G.Efter kassering af supernatanten skal prøverne flyttes til en kemisk røghætte.Resuspend cellerne i 750 til 1.000 mikroliter 4% PFA fortyndet i PBS og pipette op og ned flere gange for at bryde celleklumperne. Efter 15 minutters inkubation tilsættes 750 til 1.000 mikroliter PBS og igen pipette op og ned flere gange, hvorefter cellerne pilles ned i fem minutter ved 400 gange G ved stuetemperatur. Efter kassering af supernatanten skal du flytte prøverne til en kemisk røghætte og resuspend cellerne i 750 til 1.000 mikroliter iskold methanol som påvist og lade cellerne sidde i 30 minutter i en fryser på minus 20 grader Celsius.Efter inkubationen tilsættes 750 til 1.000 mikroliter PBS, mens du pipetterer op og ned flere gange. Derefter kasseres supernatanten efter centrifugering af cellerne i fem minutter ved 400 gange G og flyttes prøverne til en kemisk røghætte. Resuspend cellerne i 100 mikroliter eller anden egnet fortynding af mærket primært antistof og pipette op og ned seks til otte gange, og inkuber derefter i en time ved stuetemperatur.Derefter tilsættes 750 til 1.000 mikroliter inkubationsbufferen og pipetteopløsningen op og ned flere gange, og centrifuger derefter cellerne i fem minutter ved 400 gange G.Derefter suspenderes cellerne i 500 mikroliter PBS og bryder klumperne ved at pipettere op og ned flere gange. Overfør hele indholdet af hvert rør til mærkede rør med cellesiler. Bring cellerne til passende flowcytometriinstrumenter med lasere med de korrekte bølgelængder.Den optiske kalibrering blev udført for enhederne. Ved hjælp af det erhvervede billede blev kompensationsværdier for LED beregnet, baggrundssignal blev trukket fra, og pixelintensitet blev udledt. Variationskoefficienten var minimal mellem 96 brønde.Kalibreringssoftwaren demonstrerede LED-variationen efter placering og oprettede en gråskalajustering, så hver LED normaliseres til samme intensitet. Genekspression blev induceret i konstruerede lettere celler via fluorescensmikroskopi ved forskellige lyspulsvarigheder på LPA, og cellerne blev afbildet til Brightfield- og GFP-ekspression. Ved hjælp af flowcytometri blev cellerne induceret ved forskellige pulslængdeværdier og viste et dosisrespons af genekspression kvantificeret på populationsniveau på over fire gange ændring fra uinducerede tilstande.Den negative feedback opnåede over fem gange genekspressionsstøjreduktion som vist ved at sammenligne forskellige lysintensitetsværdier for det lettere system versus levende eller lys tændt. qPCR-analysen viste, at de konstruerede lettere celler udtrykte RNA-niveauer på en dosisresponsiv måde med over ti gange induktion fra uinducerede tilstande, der matchede flowcytometrikvantificeringen. Det konstruerede lettere genkredsløb viste stigende mængder blåt lys, hvilket resulterede i øgede KRAS-proteinniveauer og fosforylerede ERK-niveauer.Flere funktionelle assays kan udføres, herunder vækst, cellemotilitet, sårheling, proliferation eller invasionsassays. Disse metoder kan give specifik indsigt i mekanismerne for kræftbiologi, vævsdifferentiering eller lægemiddelresistens.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Ekstraktion for målrettet stabile isotoper Fortynding Liquid Chromatography-massespektrometri Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D Cellularized kollagengeler for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hul fiber Bioreaktorer for<em&gt; In vivo</em&gt; -lignende Pattedyr Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering af en automatiseret lysende, Dyrkning, og Sampling System for Mikrobiel optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrofluid Bioprinting for Engineering vaskulariserede væv og Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Pattedyr celledeling i 3D matricer via kvantitative Konfokal refleksion mikroskopi

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrkning pattedyrsceller i tre-dimensionelle peptid stilladser

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital ryster kultur i pattedyrsceller i O-formede fartøjer til at producere Uniform aggregeringer

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Sprøjte-injicerbar Mesh elektronik til stabil kronisk gnaver Elektrofysiologi

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...