Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

We willen balázsi lab bedanken voor opmerkingen en suggesties, Dr. Karl P. Gerhardt en Dr. Jeffrey J. Tabor voor het helpen bouwen van de eerste LPA, en Dr. Wilfried Weber voor het delen van de LOV2-degron plasmiden. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R35 GM122561 en T32 GM008444]; Het Laufer Center for Physical and Quantitative Biology; en een National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Financiering voor open access-kosten: NIH [R35 GM122561].
Bijdragen van de auteur: M.T.G. en G.B. bedachten het project. M.T.G., D.C., en L.G., voerden de experimenten uit. M.T.G., D.C., L.G., en G.B. analyseerden de gegevens en bereidden het manuscript voor. G.B. en M.T.G. begeleidden het project.

1. Ontwerp van gencircuits
<ol><li>Selecteer genetische componenten om te combineren tot een enkel gencircuit/plasmide (bijv. DNA-integratiesequentiemotieven van zoogdieren32, lichtgevoelige elementen33 of functionele genen34).</li>
	<li>Gebruik genetische manipulatie en/of moleculaire kloonsoftware, sla de DNA-sequenties op voor later gebruik en referentie, annoteer elke sequentie en onderzoek alle noodzakelijke kenmerken (bijv. START-codons, regu...

Lezers van dit artikel kunnen inzicht krijgen in de stappen die van vitaal belang zijn voor het karakteriseren van optogenetische gencircuits (evenals andere genexpressiesystemen), waaronder 1) ontwerp, constructie en validatie van gencircuits; 2) celtechnologie voor het introduceren van gencircuits in stabiele cellijnen (bijv. Flp-FRT-recombinatie); 3) inductie van de gemanipuleerde cellen met een op licht gebaseerd platform zoals de LPA; 4) initiële karakterisering van lichtinductietests via fluorescentiemicroscopie; ...

Net als andere technische disciplines heeft synthetische biologie tot doel protocollen te standaardiseren, waardoor hulpmiddelen met zeer reproduceerbare functies kunnen worden gebruikt voor het verkennen van vragen die relevant zijn voor biologische systemen1,2. Een domein in de synthetische biologie waar veel controlesystemen zijn gebouwd, is het gebied van genexpressieregulatie3,4. Genexpressiecontrole kan zich richten op zowel eiwitniveaus als variabiliteit (ruis of variatiecoëfficiënt, CV = σ/μ, gemeten als de standaarddeviatie over het gemiddelde), die cruciale cellulaire kenmerken zijn vanwege hun rol in fysiologische en pathologische cellulaire toestanden5,6,7,8. Veel synthetische systemen die eiwitniveaus en ruis4,9,10,11,12 kunnen regelen, zijn ontworpen, waardoor mogelijkheden ontstaan om protocollen voor alle tools te standaardiseren.
Een nieuwe set hulpmiddelen die gennetwerken kunnen besturen die onlangs zijn ontstaan, is optogenetica, waardoor het gebruik van licht mogelijk is om genexpressie te regelen13,14,15,16,17. Net als hun chemische voorgangers kunnen optogenetische gencircuits in elk celtype worden geïntroduceerd, variërend van bacteriën tot zoogdieren, waardoor elk stroomafwaarts gen van belang kan worden uitgedrukt18,19. Vanwege de snelle generatie van nieuwe optogenetische hulpmiddelen zijn er echter veel systemen ontstaan die variëren in genetische circuitarchitectuur, expressiemechanisme (bijv. Plasmide-gebaseerde versus virale integratie) en lichtleverende controleapparatuur11,16,20,21,22,23,24,25 . Daarom laat dit ruimte voor standaardisatie van optogenetische kenmerken zoals gencircuitconstructie en -optimalisatie, methode van systeemgebruik (bijv. Integratie versus voorbijgaande expressie), experimentele hulpmiddelen die worden gebruikt voor inductie en analyse van resultaten.
Om vooruitgang te boeken bij het standaardiseren van optogenetische protocollen in zoogdiercellen, beschrijft dit protocol een experimentele pijplijn om optogenetische systemen in zoogdiercellen te engineeren met behulp van een negatief feedback (NF) gencircuit geïntegreerd in HEK293-cellen (menselijke embryonale niercellijn) als voorbeeld. NF is een ideaal systeem om standaardisatie aan te tonen, omdat het zeer overvloedig aanwezig is26,27,28 in de natuur, waardoor eiwitniveaus kunnen worden afgestemd en ruisminimalisatie kan optreden. Kortom, NF maakt nauwkeurige genexpressiecontrole mogelijk door een repressor die zijn eigen expressie voldoende snel vermindert, waardoor elke verandering weg van een steady state wordt beperkt. De steady state kan worden veranderd door een inductor die de repressor inactiveert of elimineert om meer eiwitproductie mogelijk te maken totdat een nieuwe steady state is bereikt voor elke inductorconcentratie. Onlangs is een ontwikkeld NF-optogenetisch systeem gecreëerd dat een breed-dynamische respons van genexpressie kan produceren, lage ruis kan behouden en kan reageren op lichtstimuli, waardoor het potentieel voor ruimtelijke genexpressiecontrole11. Deze hulpmiddelen, bekend als licht-induceerbare tuners (LITers), werden geïnspireerd door eerdere systemen die genexpressiecontrole in levende cellen mogelijk maakten4,10,29,30 en werden stabiel geïntegreerd in menselijke cellijnen om langdurige genexpressiecontrole te garanderen.
Hier, met behulp van de LITer als voorbeeld, wordt een protocol geschetst voor het creëren van lichtresponsieve gencircuits, het induceren van genexpressie met een Light Plate Apparatus (LPA, een optogenetische inductiehardware)31, en het analyseren van reacties van de gemanipuleerde, optogenetisch bestuurbare cellijnen op aangepaste lichtstimuli. Met dit protocol kunnen gebruikers de LITer-tools gebruiken voor elk functioneel gen dat ze willen verkennen. Het kan ook worden aangepast voor andere optogenetische systemen met verschillende circuitarchitecturen (bijv. Positieve feedback, negatieve regulatie, enz.) door de hieronder beschreven methoden en optogenetische apparatuur te integreren. Vergelijkbaar met andere synthetische biologieprotocollen, kunnen de video-opnames en optogenetische protocollen die hier worden beschreven, worden toegepast in eencellige studies op verschillende gebieden, waaronder maar niet beperkt tot kankerbiologie, embryonale ontwikkeling en weefseldifferentiatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

Betrouwbare genexpressiecontrole in zoogdiercellen vereist hulpmiddelen met een hoge vouwverandering, weinig ruis en bepaalde input-to-output overdrachtsfuncties, ongeacht de gebruikte methode. In de richting van dit doel hebben optogenetische genexpressiesystemen het afgelopen decennium veel aandacht gekregen voor spatiotemporale controle van eiwitniveaus in zoogdiercellen. De meeste bestaande circuits die lichtgeïnduceerde genexpressie regelen, variëren echter in architectuur, worden uitgedrukt uit plasmiden en maken gebruik van variabele optogenetische apparatuur, waardoor de noodzaak ontstaat om karakterisering en standaardisatie van optogenetische componenten in stabiele cellijnen te onderzoeken. Hier biedt de studie een experimentele pijplijn van betrouwbare gencircuitconstructie, integratie en karakterisering voor het beheersen van licht-induceerbare genexpressie in zoogdiercellen, met behulp van een negatieve feedback optogenetisch circuit als voorbeeld. De protocollen illustreren ook hoe het standaardiseren van optogenetische apparatuur en lichtregimes op betrouwbare wijze gencircuitkenmerken kan onthullen, zoals genexpressieruis en eiwitexpressiegrootheid. Ten slotte kan dit artikel van nut zijn voor laboratoria die niet bekend zijn met optogenetica en die dergelijke technologie willen toepassen. De hier beschreven pijplijn zou van toepassing moeten zijn op andere optogenetische circuits in zoogdiercellen, waardoor een betrouwbaardere, gedetailleerdere karakterisering en controle van genexpressie op transcriptioneel, proteomisch en uiteindelijk fenotypisch niveau in zoogdiercellen mogelijk is.

Gencircuitassemblage en stabiele cellijngeneratie in dit artikel waren gebaseerd op commerciële, gemodificeerde HEK-293-cellen die een transcriptioneel actieve, enkele stabiele FRT-site bevatten (figuur 1). De gencircuits werden geconstrueerd in vectoren met FRT-locaties in het plasmide, waardoor de Flp-FRT-integratie in het HEK-293-celgenoom mogelijk was. Deze aanpak is niet beperkt tot Flp-In-cellen, omdat FRT-sites overal in het genoom aan elke gewenste cellijn kunnen worden toegevoegd m...

Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Het betrouwbaar controleren van lichtgevoelige zoogdiercellen vereist de standaardisatie van optogenetische methoden. In de richting van dit doel schetst deze studie een pijplijn van gencircuitconstructie, celtechnologie, optogenetische apparatuur en verificatietests om de studie van door licht geïnduceerde genexpressie te standaardiseren met behulp van een negatief feedback optogenetisch gencircuit als casestudy.

Betrouwbare engineering en controle van stabiele optogenetische gencircuits in zoogdiercellen

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Het gestandaardiseerde optogenetische protocol is ontworpen voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in het gebruik van licht als de stimulus om cellulaire eigenschappen in gemanipuleerde zoogdiercelsystemen te regelen. Dit protocol is eenvoudig te implementeren in laboratoria die anders niet bekend zijn met optogenetica en biedt methoden voor nauwkeurige ruimtelijke temporele controle van gemanipuleerde biologische systemen. Deze methode heeft een breed scala aan toepassingen in specifieke onderzoeksgebieden waar spatiotemporale informatie belangrijk kan zijn, waaronder kankerbiologie, systeembiologie en weefseldifferentiatie.Selecteer om te beginnen de genetische componenten om bind te combineren in een enkel gencircuit of plasmide. Bijvoorbeeld DNA-integratieplaatsen voor zoogdieren, lichtgevoelige elementen of functionele genen. Na het assembleren en onderzoeken van alle noodzakelijke functies zoals startcodons, regulerende of vertaalde sequenties, gebruikt u genetische manipulatie en moleculaire kloonsoftware, annoteert en slaat u de DNA-sequenties op voor later gebruik en als referentie.Valideer de primers computationeel voor plasmideconstructie via de ingebouwde moleculaire kloonsoftwarefuncties, bijvoorbeeld sequentie-uitlijning. Om een stabiele cellijn te genereren, transfecteer de ontwerpgencircuits en de gewenste cellen met behulp van een liposoommengsel van het gencircuit-DNA met de juiste recombinase. Nadat cellen 80 tot 100% confluent zijn, vriest u de cellen in een mix van 45% oude media, 45% verse media en 10% DMSO.Breng de resterende cellen over naar een steriele buis en voer eencellige sortering uit om monoklonale cellen te isoleren in een 96-well plaat. Ongeveer twee tot drie weken na monoklonale sortering moeten de putten in de 96-putplaat foci hebben. Wanneer 50 tot 60% confluentie is bereikt, splitst u de cellen in een 12-well plaat.Voeg de firmware toe aan het geassembleerde LPA-circuit met behulp van een microcontrollerprogrammeur. Combineer vervolgens 3D-geprinte onderdelen in de geassembleerde printplaat met behulp van de montageplaat, de printplaat, de LED-afstandhouder, de plaatadapter, een 24-well plaat, een plaatdeksel, montagebouten, vleugelmoeren en stapelcomponenten. Om een optogenetisch experiment te beginnen, gebruikt u de Iris-software die beschikbaar is op de Tabor Lab-website om een SD-kaart voor de LPA te programmeren en de juiste lichtomstandigheden te verkennen.Voer vervolgens intensiteitswaarden in met de technische replicaties voor het gewenste experimentele overzicht. Voeg ongeveer 75.000 cellen per put toe in een zwarte plaat met 24 putten in een totaal volume van 500 microliter en plaats de cellen vervolgens in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide om ze twee tot zes uur te laten bezinken. Na het overbrengen van de cellen in de weefselkweekkap aan het einde van de incubatie, verwijdert u het plastic deksel en voegt u een kleeffoliestrip toe aan de bovenkant van de plaat om de lichtoverdracht tussen de putten te minimaliseren, zodat het licht alleen via de LED aan de onderkant van de put kan binnenkomen.Plaats de plaat in de gemonteerde 3D-delen van de LPA en bedek de plaat vervolgens met het 3D-geprinte LPA-deksel dat over de apparaatschroeven op elke hoek past. Sluit het apparaat aan op de voedingsbron en druk op de resetknop op het LPA-apparaat om ervoor te zorgen dat de bijgewerkte LPA-experimentinstellingen worden toegepast en de cellen te incuberen. Verwijder na de incubatie in de weefselkweekkap de foliestrip van de plaat en laat de plaat één tot twee minuten zitten om condensvorming op het plastic deksel te voorkomen.Plaats vervolgens het originele plastic deksel terug op de plaat en stel de cellen in beeld met de juiste fasecontrast- of fluorescentiemicroscoop. Na 24 tot 72 uur na inductie, gevolgd door trypsinisatie, brengt u de volledige inhoud van elke put van ongeveer 500 microliter over naar de gelabelde buizen die zijn uitgerust met de celzeef. Maak vervolgens met behulp van geschikte flowcytometrie-instrumentsoftware een voorwaartse en zijwaartse scatterpoort om de afzonderlijke cellen van de juiste grootte en granulariteit vast te leggen om puin en cellulaire klonten uit te sluiten.Zodra de poort is ingesteld, vangt u ongeveer 10.000 cellen met de juiste poort en past u het celnummer aan, afhankelijk van de hoeveelheid vereiste mobiele gegevens en herhaalt u het vastleggen van experimentele cellen in elke buis. Breng na inductie en trypsinisatie de volledige inhoud van elke put van ongeveer 500 microliter over naar de gelabelde buizen. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op 400 maal G.Na het weggooien van het supernatant, verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.Resuspend de cellen in 750 tot 1.000 microliter van 4% PFA verdund in PBS en pipetteer meerdere keren op en neer om de celklonten te breken. Voeg na 15 minuten incubatie 750 tot 1.000 microliter PBS toe en pipetteer opnieuw meerdere keren op en neer en pellet vervolgens de cellen gedurende vijf minuten met 400 keer G bij kamertemperatuur. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast en resuspendeert u de cellen in 750 tot 1.000 microliter ijskoude methanol zoals gedemonstreerd en laat u de cellen 30 minuten in een vriezer van min 20 graden Celsius zitten.Voeg na de incubatie 750 toe aan 1.000 microliter PBS door meerdere keren op en neer te pipetteren. Na het centrifugeren van de cellen gedurende vijf minuten op 400 maal G, gooit u het supernatant weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast. Resuspend de cellen in 100 microliter of een andere geschikte verdunning van gelabeld primair antilichaam en pipetteer zes tot acht keer op en neer en incubeer vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 750 tot 1.000 microliter van de incubatiebuffer en pipetoplossing meerdere keren op en neer toe, centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten op 400 keer G.Next, resuspend de cellen in 500 microliter PBS en breek de klonten door meerdere keren op en neer te pipetteren. Breng de volledige inhoud van elke buis over naar gelabelde buizen met celzeefjes. Breng de cellen naar geschikte flowcytometrie-instrumenten met lasers van de juiste golflengten.De optische kalibratie werd uitgevoerd voor de apparaten. Met behulp van het verkregen beeld werden compensatiewaarden voor LED berekend, achtergrondsignaal afgetrokken en pixelintensiteit afgeleid. De variatiecoëfficiënt was minimaal tussen 96 putten.De kalibratiesoftware demonstreerde de LED-variatie per locatie en creëerde een grijsschaalaanpassing zodat elke LED wordt genormaliseerd tot dezelfde intensiteit. Genexpressie werd geïnduceerd in gemanipuleerde lichtere cellen via fluorescentiemicroscopie bij verschillende lichtpulsduur op de LPA en de cellen werden in beeld gebracht voor Brightfield- en GFP-expressie. Met behulp van flowcytometrie werden de cellen geïnduceerd bij verschillende pulslengtewaarden en vertoonden ze een dosisrespons van genexpressie gekwantificeerd op populatieniveau van meer dan viervoudige verandering van niet-geïnduceerde toestanden.De negatieve feedback die werd bereikt over een vijfvoudige genexpressieruisreductie, zoals blijkt uit het vergelijken van verschillende lichtintensiteitswaarden voor het lichtere systeem versus levendig of licht aan. De qPCR-analyse toonde aan dat de gemanipuleerde lichtere cellen RNA-niveaus tot expressie brachten op een dosisresponsieve manier met meer dan tienvoudige inductie uit niet-geïnduceerde toestanden, overeenkomend met de kwantificering van de flowcytometrie. Het gemanipuleerde lichtere gencircuit vertoonde toenemende hoeveelheden blauw licht die resulteerden in verhoogde KRAS-eiwitniveaus en gefosforyleerde ERK-niveaus.Verschillende functionele assays kunnen worden uitgevoerd, waaronder groei, celmotiliteit, wondgenezing, proliferatie of invasie assays. Deze methoden kunnen specifieke inzichten bieden in de mechanismen van kankerbiologie, weefseldifferentiatie of medicijnresistentie.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Holle vezel voor Bioreactoren<em&gt; In Vivo</em&gt; -achtige Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Zoogdieren celdeling in 3D-Matrices via reflectie van kwantitatieve confocale microscopie

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Een cultuur van zoogdiercellen schudden in O-vormige schepen tot uniforme aggregaten orbitaal

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Spuit-injectable Mesh elektronica voor stabiele chronische knaagdier electrofysiologie

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...