Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Wir danken Balázsi lab für Kommentare und Anregungen, Dr. Karl P. Gerhardt und Dr. Jeffrey J. Tabor für die Unterstützung beim Aufbau des ersten LPA und Dr. Wilfried Weber für die gemeinsame Nutzung der LOV2-degron Plasmide. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [R35 GM122561 und T32 GM008444] unterstützt; Das Laufer Zentrum für Physikalische und Quantitative Biologie; und ein National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Finanzierung der Open-Access-Gebühr: NIH [R35 GM122561].
Autorenbeiträge: M.T.G. und G.B. konzipierten das Projekt. M.T.G., D.C., und L.G., führten die Experimente durch. M.T.G., D.C., L.G. und G.B. analysierten die Daten und bereiteten das Manuskript vor. G.B. und M.T.G. betreuten das Projekt.

1. Design von Genschaltkreisen
<ol><li>Wählen Sie genetische Komponenten aus, die zu einem einzigen Genschaltkreis/Plasmid kombiniert werden sollen (z. B. Sequenzmotive der DNA-Integration von Säugetieren32, lichtempfindliche Elemente33 oder funktionelle Gene34).</li>
	<li>Speichern Sie die DNA-Sequenzen zur späteren Verwendung und Referenz mit gentechnischer und/oder molekularer Klonierungssoftware, kommentieren Sie jede Sequenz und untersuchen...

Die Leser dieses Artikels können einen Einblick in die Schritte erhalten, die für die Charakterisierung optogenetischer Genschaltkreise (sowie anderer Genexpressionssysteme) von entscheidender Bedeutung sind, einschließlich 1) Design, Konstruktion und Validierung von Genschaltkreisen; 2) Zell-Engineering zur Einführung von Genschaltkreisen in stabile Zelllinien (z. B. Flp-FRT-Rekombination); 3) Induktion der technischen Zellen mit einer lichtbasierten Plattform wie der LPA; 4) Erstcharakterisierung von Lichtinduktion...

Ähnlich wie andere Ingenieurdisziplinen zielt die synthetische Biologie darauf ab, Protokolle zu standardisieren, so dass Werkzeuge mit hochgradig reproduzierbaren Funktionen zur Untersuchung von Fragen verwendet werden können, die für biologische Systeme relevant sind1,2. Ein Bereich in der synthetischen Biologie, in dem viele Kontrollsysteme aufgebaut wurden, ist der Bereich der Genexpressionsregulation3,4. Die Genexpressionskontrolle kann sowohl auf Proteinspiegel als auch auf Variabilität (Rauschen oder Variationskoeffizient, CV = σ/μ, gemessen als Standardabweichung vom Mittelwert) abzielen, die aufgrund ihrer Rolle in physiologischen und pathologischen Zellzuständen entscheidende zelluläre Merkmale sind5,6,7,8. Viele synthetische Systeme, die den Proteingehalt und das Rauschen4,9,10,11,12 kontrollieren können, wurden entwickelt, um Möglichkeiten zur Standardisierung von Protokollen über Werkzeuge hinweg zu schaffen.
Eine neuartige Reihe von Werkzeugen, die Gennetzwerke kontrollieren können, die kürzlich entstanden sind, ist die Optogenetik, die die Verwendung von Licht zur Kontrolle der Genexpression ermöglicht13,14,15,16,17. Ähnlich wie ihre chemischen Vorgänger können optogenetische Genschaltkreise in jeden Zelltyp eingeführt werden, von Bakterien bis hin zu Säugetieren, was die Expression jedes nachgeschalteten Gens von Interesse ermöglicht18,19. Aufgrund der schnellen Generierung neuartiger optogenetischer Werkzeuge sind jedoch viele Systeme entstanden, die sich in der genetischen Schaltungsarchitektur, dem Expressionsmechanismus (z. B. plasmidbasierte vs. virale Integration) und der lichtversorgenden Kontrollausrüstung unterscheiden11,16,20,21,22,23,24,25 . Daher bleibt Raum für die Standardisierung optogenetischer Merkmale wie Genschaltungsaufbau und -optimierung, Methode der Systemnutzung (z. B. Integration vs. transiente Expression), experimentelle Werkzeuge für die Induktion und Analyse der Ergebnisse.
Um Fortschritte bei der Standardisierung optogenetischer Protokolle in Säugetierzellen zu erzielen, beschreibt dieses Protokoll eine experimentelle Pipeline zur Entwicklung optogenetischer Systeme in Säugetierzellen am Beispiel eines in HEK293-Zellen integrierten Genschaltkreises mit negativem Feedback (NF), der in HEK293-Zellen (humane embryonale Nierenzelllinie) integriert ist. NF ist ein ideales System, um Standardisierung zu demonstrieren, da es in der Natur reichlich vorhanden ist26,27,28, so dass der Proteingehalt abgestimmt und eine Geräuschminimierung erfolgen kann. Kurz gesagt, NF ermöglicht eine präzise Genexprimationskontrolle durch einen Repressor, der seine eigene Expression ausreichend schnell reduziert, wodurch jede Veränderung weg von einem stationären Zustand begrenzt wird. Der stationäre Zustand kann durch einen Induktor verändert werden, der den Repressor inaktiviert oder eliminiert, um eine höhere Proteinproduktion zu ermöglichen, bis für jede Induktorkonzentration ein neuer stationärer Zustand erreicht wird. Vor kurzem wurde ein technisch entwickeltes optogenetisches NF-System entwickelt, das eine breitdynamische Reaktion der Genexpression erzeugen, ein geringes Rauschen aufrechterhalten und auf Lichtreize reagieren kann, was das Potenzial für eine räumliche Genexpressionskontrolle ermöglicht11. Diese Werkzeuge, die als lichtinduzierbare Tuner (LITer) bekannt sind, wurden von früheren Systemen inspiriert, die die Genexpressionskontrolle in lebenden Zellen ermöglichten4,10,29,30 und stabil in menschliche Zelllinien integriert wurden, um eine langfristige Genexpressionskontrolle zu gewährleisten.
Hier wird am Beispiel des LITers ein Protokoll zur Schaffung lichtreaktionsfähiger Genschaltkreise, zur Induktion der Genexpression mit einem Light Plate Apparatus (LPA, einer optogenetischen Induktionshardware)31 und zur Analyse der Reaktionen der manipulierten, optogenetisch kontrollierbaren Zelllinien auf kundenspezifische Lichtreize skizziert. Dieses Protokoll ermöglicht es Benutzern, die LITer-Tools für jedes funktionelle Gen zu verwenden, das sie erforschen möchten. Es kann auch für andere optogenetische Systeme mit unterschiedlichen Schaltungsarchitekturen (z. B. positives Feedback, negative Regulation usw.) angepasst werden, indem die unten beschriebenen Methoden und optogenetischen Geräte integriert werden. Ähnlich wie bei anderen Protokollen der synthetischen Biologie können die hier beschriebenen Videoaufzeichnungen und optogenetischen Protokolle in Einzelzellstudien in verschiedenen Bereichen angewendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Krebsbiologie, Embryonalentwicklung und Gewebedifferenzierung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

Eine zuverlässige Genexpressionskontrolle in Säugetierzellen erfordert Werkzeuge mit hoher Faltenänderung, geringem Rauschen und bestimmten Input-to-Output-Transferfunktionen, unabhängig von der verwendeten Methode. Um dieses Ziel zu erreichen, haben optogenetische Genexpressionssysteme in den letzten zehn Jahren viel Aufmerksamkeit für die raumzeitliche Kontrolle des Proteinspiegels in Säugetierzellen gewonnen. Die meisten bestehenden Schaltkreise, die die lichtinduzierte Genexpression steuern, variieren jedoch in der Architektur, werden von Plasmiden exprimiert und verwenden variable optogenetische Ausrüstung, was die Notwendigkeit schafft, die Charakterisierung und Standardisierung optogenetischer Komponenten in stabilen Zelllinien zu erforschen. Hier bietet die Studie eine experimentelle Pipeline zuverlässiger Genschaltungskonstruktion, -integration und -charakterisierung zur Kontrolle der lichtinduzierbaren Genexpression in Säugetierzellen, wobei ein optogenetischer Schaltkreis mit negativer Rückkopplung als Fallbeispiel verwendet wird. Die Protokolle veranschaulichen auch, wie die Standardisierung optogenetischer Geräte und Lichtregime Genschaltungsmerkmale wie Genexpressionsrauschen und Proteinexpressionsgröße zuverlässig aufdecken kann. Schließlich kann dieses Papier für Laboratorien von Nutzen sein, die mit Optogenetik nicht vertraut sind und eine solche Technologie anwenden möchten. Die hier beschriebene Pipeline sollte für andere optogenetische Schaltkreise in Säugetierzellen gelten, was eine zuverlässigere, detailliertere Charakterisierung und Kontrolle der Genexpression auf transkriptioneller, proteomischer und letztendlich phänotypischer Ebene in Säugetierzellen ermöglicht.

Der Aufbau von Genschaltkreisen und die stabile Zellliniengenerierung in diesem Artikel basierten auf kommerziellen, modifizierten HEK-293-Zellen, die eine transkriptionell aktive, einzelne stabile FRT-Stelle enthielten (Abbildung 1). Die Genschaltkreise wurden zu Vektoren konstruiert, die FRT-Stellen innerhalb des Plasmids hatten, was die Flp-FRT-Integration in das HEK-293-Zellgenom ermöglichte. Dieser Ansatz ist nicht auf Flp-In-Zellen beschränkt, da FRT-Stellen mit DNA-Editing-Technolog...

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Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Die zuverlässige Kontrolle lichtempfindlicher Säugetierzellen erfordert die Standardisierung optogenetischer Methoden. Um dieses Ziel zu erreichen, skizziert diese Studie eine Pipeline von Genschaltkreiskonstruktion, Zelltechnik, optogenetischem Gerätebetrieb und Verifikationsassays, um die Untersuchung der lichtinduzierten Genexpression unter Verwendung eines optogenetischen Genschaltkreises mit negativer Rückkopplung als Fallstudie zu standardisieren.

Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Das standardisierte optogenetische Protokoll wurde für Labore entwickelt, die daran interessiert sind, Licht als Stimulus zur Kontrolle der zellulären Eigenschaften in künstlich hergestellten Säugetierzellsystemen zu verwenden. Dieses Protokoll ist in Laboren, die sonst nicht mit Optogenetik vertraut sind, einfach zu implementieren und bietet Methoden zur präzisen räumlich-zeitlichen Kontrolle von technisch hergestellten biologischen Systemen. Diese Methode hat ein breites Anwendungsspektrum in bestimmten Forschungsbereichen, in denen raumzeitliche Informationen wichtig sein können, einschließlich Krebsbiologie, Systembiologie und Gewebedifferenzierung.Wählen Sie zunächst die genetischen Komponenten aus, die zu einem einzigen Genkreislauf oder Plasmid gebunden werden sollen. Zum Beispiel DNA-Integrationsstellen von Säugetieren, lichtempfindliche Elemente oder funktionelle Gene. Nachdem Sie alle notwendigen Merkmale wie Startcodons, regulatorische oder übersetzte Sequenzen zusammengestellt und untersucht haben, verwenden Sie eine gentechnische und molekulare Klonierungssoftware, kommentieren und speichern Sie die DNA-Sequenzen für die spätere Verwendung und als Referenz.Validieren Sie die Primer rechnerisch für den Plasmidaufbau durch die integrierten Funktionen der Molekularklonierungssoftware, z. B. die Sequenzausrichtung. Um eine stabile Zelllinie zu erzeugen, transfizieren Sie die Design-Genschaltkreise und die gewünschten Zellen unter Verwendung einer Liposomenmischung der Genkreis-DNA mit geeigneter Rekombinase. Nachdem die Zellen zu 80 bis 100% konfluent sind, frieren Sie die Zellen in einer Mischung aus 45% alten Medien, 45% frischen Medien und 10% DMSO ein.Übertragen Sie die verbleibenden Zellen in ein steriles Röhrchen und führen Sie eine Einzelzellsortierung durch, um monoklonale Zellen in eine 96-Well-Platte zu isolieren. Etwa zwei bis drei Wochen nach der monoklonalen Sortierung sollten die Vertiefungen innerhalb der 96-Well-Platte Herde haben. Wenn eine Konfluenz von 50 bis 60% erreicht ist, teilen Sie die Zellen in eine 12-Well-Platte auf.Fügen Sie die Firmware mithilfe eines Mikrocontroller-Programmiergeräts zur konfektionierten LPA-Schaltung hinzu. Als nächstes kombinieren Sie 3D-gedruckte Teile in der bestückten Leiterplatte mit der Montageplatte, der Leiterplatte, dem LED-Abstandshalter, dem Plattenadapter, einer 24-Well-Platte, einem Plattendeckel, Befestigungsschrauben, Flügelmuttern und Stapelkomponenten. Um ein optogenetisches Experiment zu beginnen, verwenden Sie die Iris-Software, die auf der Tabor Lab-Website verfügbar ist, um eine SD-Karte für die LPA zu programmieren und geeignete Lichtbedingungen zu untersuchen.Als nächstes geben Sie Intensitätswerte mit den technischen Replikaten für die gewünschte experimentelle Gliederung ein. Fügen Sie etwa 75.000 Zellen pro Vertiefung in eine 24-Well-Black-Platte in einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern hinzu und legen Sie die Zellen dann in einen befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid, damit sie sich zwei bis sechs Stunden absetzen können. Nachdem Sie die Zellen in der Gewebekulturhaube am Ende der Inkubation übertragen haben, entfernen Sie den Kunststoffdeckel und fügen Sie einen Klebefolienstreifen an der Oberseite der Platte hinzu, um den Lichttransfer zwischen den Vertiefungen zu minimieren, so dass das Licht nur durch die LED am Boden des Brunnens eindringen kann.Legen Sie die Platte in die montierten 3D-Teile des LPA und bedecken Sie die Platte dann mit dem 3D-gedruckten LPA-Deckel, der über die Geräteschrauben an jeder Ecke passt. Schließen Sie das Gerät an die Stromquelle an und drücken Sie die Reset-Taste am LPA-Gerät, um sicherzustellen, dass die aktualisierten LPA-Experimenteinstellungen angewendet werden und die Zellen inkubiert werden. Entfernen Sie nach der Inkubation in der Gewebekulturhaube den Folienstreifen von der Platte und lassen Sie die Platte ein bis zwei Minuten ruhen, um zu verhindern, dass sich Kondenswasser auf dem Kunststoffdeckel bildet.Als nächstes legen Sie den ursprünglichen Kunststoffdeckel wieder auf die Platte und stellen Sie die Zellen mit dem entsprechenden Phasenkontrast- oder Fluoreszenzmikroskop ab. Nach 24 bis 72 Stunden nach der Induktion, gefolgt von der Trypsinisierung, wird der gesamte Inhalt jedes Vertiefungs von etwa 500 Mikrolitern auf die markierten Röhrchen übertragen, die mit dem Zellsieb ausgestattet sind. Erstellen Sie dann mit der entsprechenden Durchflusszytometrie-Gerätesoftware ein Vorwärts- und Seitenstreutor, um die einzelnen Zellen der entsprechenden Größe und Granularität zu erfassen, um Trümmer und Zellklumpen auszuschließen.Sobald das Tor gesetzt ist, erfassen Sie ungefähr 10.000 Zellen mit dem entsprechenden Tor und passen Sie die Zellzahl in Abhängigkeit von der Menge der erforderlichen Zelldaten an und wiederholen Sie die Erfassung experimenteller Zellen in jeder Röhre. Nach Induktion und Trypsinisierung wird der gesamte Inhalt jeder Vertiefung von etwa 500 Mikrolitern auf die markierten Röhrchen übertragen. Zentrifen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400 mal G. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug.Resuspendieren Sie die Zellen in 750 bis 1.000 Mikrolitern 4% PFA, die in PBS verdünnt sind, und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Zellklumpen zu brechen. Nach 15 Minuten Inkubation 750 bis 1.000 Mikroliter PBS hinzufügen und mehrmals auf und ab pipettieren, dann die Zellen für fünf Minuten bei 400 mal G bei Raumtemperatur pelletieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug und suspendieren Sie die Zellen in 750 bis 1.000 Mikrolitern eiskaltem Methanol, wie gezeigt, und lassen Sie die Zellen 30 Minuten in einem Gefrierschrank von minus 20 Grad Celsius sitzen.Nach der Inkubation fügen Sie 750 bis 1.000 Mikroliter PBS hinzu, während Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400 mal G zentrifugiert haben, entsorgen Sie den Überstand und bewegen Sie die Proben in einen chemischen Abzug. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern oder einer anderen geeigneten Verdünnung des markierten primären Antikörpers und pipettieren Sie sechs bis acht Mal auf und ab und inkubieren Sie dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur.Als nächstes fügen Sie 750 bis 1.000 Mikroliter des Inkubationspuffers hinzu und pipettieren Sie die Lösung mehrmals auf und ab, dann zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei 400 mal G.Als nächstes suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS und brechen Sie die Klumpen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jedes Röhrchens auf markierte Röhrchen mit Zellsieben. Bringen Sie die Zellen zu geeigneten Durchflusszytometrie-Instrumenten mit Lasern der richtigen Wellenlängen.Die optische Kalibrierung wurde für die Geräte durchgeführt. Anhand des aufgenommenen Bildes wurden Kompensationswerte für LED berechnet, Hintergrundsignale subtrahiert und Pixelintensität abgeleitet. Der Variationskoeffizient war zwischen 96 Bohrungen minimal.Die Kalibrierungssoftware demonstrierte die LED-Variation nach Standort und erstellte eine Graustufenanpassung, so dass jede LED auf die gleiche Intensität normalisiert wird. Die Genexpression wurde in technisch hergestellten leichteren Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie bei unterschiedlichen Lichtpulsdauern auf dem LPA induziert und die Zellen wurden für die Hellfeld- und GFP-Expression abgebildet. Mittels Durchflusszytometrie wurden die Zellen bei unterschiedlichen Pulslängenwerten induziert und zeigten eine auf Populationsebene quantifizierte Dosis-Wirkungs-Beziehung der Genexpression von über vierfacher Veränderung aus uninduzierten Zuständen.Das negative Feedback erreichte eine über fünffache Genexpressionsrauschunterdrückung, wie durch den Vergleich verschiedener Lichtintensitätswerte für das leichtere System im Vergleich zu vivid oder light on gezeigt wurde. Die qPCR-Analyse zeigte, dass die technisch hergestellten leichteren Zellen RNA-Spiegel in einer dosisabhängigen Weise mit mehr als zehnfacher Induktion aus uninduzierten Zuständen exprimierten, was der Quantifizierung der Durchflusszytometrie entsprach. Der technisch hergestellte leichtere Genkreislauf zeigte zunehmende Mengen an blauem Licht, was zu erhöhten KRAS-Proteinspiegeln und phosphorylierten ERK-Spiegeln führte.Es können mehrere funktionelle Assays durchgeführt werden, einschließlich Wachstums-, Zellmotilitäts-, Wundheilungs-, Proliferations- oder Invasionsassays. Diese Methoden könnten spezifische Einblicke in die Mechanismen der Krebsbiologie, der Gewebedifferenzierung oder der Arzneimittelresistenz liefern.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Forschung

Biotechnik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hohlfaser-Bioreaktoren für<em&gt; In Vivo</em&gt; -ähnlichen Mammalian Gewebekultur

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Orbital schütteln Kultur von Säugerzellen in O-förmigen Schiffe, einheitliche Aggregate zu produzieren

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Spritze-injizierbaren Mesh Elektronik für stabile chronische Nagetier Elektrophysiologie

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...