Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

ברצוננו להודות למעבדת Balázsi על הערות והצעות, ד"ר קרל פ גרהרדט וד"ר ג'פרי ג 'תבור על שעזרו לנו לבנות את LPA הראשון, וד"ר וילפריד וובר על שיתוף LOV2-degron plasmids. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R35 GM122561 ו- T32 GM0084444]; מרכז לאופר לביולוגיה פיזית וכמותית; ומלגת מדע והנדסה של הביטחון הלאומי (NDSEG). מימון לדמי גישה פתוחה: NIH [R35 GM122561].
תרומות מחבר: M.T.G. ו- G.B. הגה את הפרויקט. M.T.G., D.C., ו L.G., ביצע את הניסויים. M.T.G., D.C., L.G., ו- G.B ניתחו את הנתונים והכינו את כתב היד. ג.B ו-אם.טי.ג'י פיקחו על הפרויקט.

1. תכנון מעגלי גנים
<ol><li>בחר רכיבים גנטיים לשילוב במעגל גנים/פלסמיד יחיד (לדוגמה, מוטיבים של רצף שילוב DNA של יונקים32, אלמנטים מגיבים לאור33 או גנים פונקציונליים34).</li>
	<li>באמצעות כל הנדסה גנטית ו/או תוכנה לשיבוט מולקולרי, אחסן את רצפי הדנ"א לשימוש והפניה ?...

קוראי מאמר זה יכולים לקבל תובנה על השלבים החיוניים לאפיון מעגלי גנים אופטוגנטיים (כמו גם מערכות ביטוי גנים אחרות), כולל 1) תכנון מעגלי גנים, בנייה ואימות; 2) הנדסת תאים להכנסת מעגלי גנים לקווי תאים יציבים (למשל, רקומבינציה Flp-FRT); 3) אינדוקציה של התאים המהונדסים עם פלטפורמה מבוססת אור כגון LPA; 4) א...

בדומה לדיסציפלינות הנדסיות אחרות, ביולוגיה סינתטית שואפת לתקנן פרוטוקולים, ומאפשרת להשתמש בכלים עם פונקציות רב-תכליתיות לשחזור לחקר שאלות הרלוונטיות למערכות ביולוגיות1,2. תחום אחד בביולוגיה סינתטית שבו נבנו מערכות בקרה רבות הוא תחום ויסות ביטוי הגנים3,4. בקרת ביטוי גנים יכולה למקד הן את רמות החלבון והן את השונות (רעש או מקדם וריאציה, CV = σ/μ, הנמדדים כסטיית התקן על הממוצע), שהם מאפיינים תאיים קריטיים בשל תפקידם במצבים תאיים פיזיולוגיים ופתולוגיים5,6,7,8. מערכות סינתטיות רבות שיכולות לשלוט ברמות החלבון וברעש4,9,10,11,12 תוכננו, מה שיוצר הזדמנויות לתקנן פרוטוקולים בכלים שונים.
קבוצה חדשה אחת של כלים שיכולים לשלוט ברשתות גנים שהתפתחה לאחרונה היא אופטוגנטיקה, המאפשרת שימוש באור כדי לשלוט בביטוי הגנים13,14,15,16,17. בדומה לקודמיהם הכימיים, ניתן להכניס מעגלי גנים אופטוגנטיים לכל סוג תא, החל מחיידקים ועד יונקים, המאפשרים ביטוי של כל גן עניין במורד הזרם18,19. עם זאת, בשל הדור המהיר של כלים אופטוגנטיים חדשניים, התפתחו מערכות רבות המשתנות בארכיטקטורת מעגלים גנטיים, מנגנון הביטוי (למשל, מבוסס פלסמיד לעומת שילוב ויראלי), וציוד בקרת אספקת אור11,16,20,21,22,23,24,25 . לכן, זה משאיר מקום לתקנון של תכונות אופטוגנטיות כגון בניית מעגל גנים ואופטימיזציה, שיטת ניצול המערכת (למשל, אינטגרציה לעומת ביטוי חולף), כלים ניסיוניים המשמשים אינדוקציה וניתוח תוצאות.
כדי להתקדם בתקינון פרוטוקולים אופטוגנטיים בתאי יונקים, פרוטוקול זה מתאר צינור ניסיוני להנדס מערכות אופטוגנטיות בתאי יונקים באמצעות מעגל גנים משוב שלילי (NF) המשולב בתאי HEK293 (קו תאי כליה עובריים אנושיים) כדוגמה. NF היא מערכת אידיאלית להדגמת תקינה מכיוון שהיא שופעת מאוד בטבעה 26,27,28, ומאפשרת כוונון רמות חלבון ומזעור רעש להתרחש. בקצרה, NF מאפשר שליטה מדויקת בביטוי גנים על ידי מדכא המפחית את הביטוי שלו מספיק מהר, ובכך מגביל כל שינוי הרחק ממצב יציב. המצב היציב יכול להשתנות על ידי ממריץ כי מנטרל או מבטל את הדיכוי כדי לאפשר ייצור חלבון יותר עד מצב יציב חדש הוא הגיע עבור כל ריכוז ממריץ. לאחרונה, נוצרה מערכת אופטוגנטית מהונדסת של NF שיכולה לייצר תגובה דינמית רחבה של ביטוי גנים, לשמור על רעש נמוך ולהגיב לגירויים קלים המאפשרים את הפוטנציאל לשליטה בביטוי גנים מרחביים11. כלים אלה, המכונים מקלטים בלתי ניתנים למניעה לאור (LITers), נוצרו בהשראת מערכות קודמות שאפשרו שליטה בביטוי גנים בתאים חיים4,10,29,30 ושולבו ביציבות בקווי תאים אנושיים כדי להבטיח שליטה ארוכת טווח בביטוי הגנים.
כאן, באמצעות LITer כדוגמה, פרוטוקול מתואר ליצירת מעגלי גנים מגיבים לאור, גרימת ביטוי גנים עם מנגנון צלחת אור (LPA, חומרת אינדוקציה אופטוגנטית)31, ולנתח את התגובות של קווי התא המהונדסים, האופטוגנטיים לשליטה לגירויים אור מותאמים אישית. פרוטוקול זה מאפשר למשתמשים להשתמש בכלי LITer עבור כל גן פונקציונלי שהם רוצים לחקור. זה יכול להיות מותאם גם עבור מערכות אופטוגנטיות אחרות עם ארכיטקטורות מעגלים מגוונות (למשל, משוב חיובי, רגולציה שלילית, וכו ') באמצעות שילוב השיטות וציוד אופטוגנטי המתואר להלן. בדומה לפרוטוקולים אחרים של ביולוגיה סינתטית, ניתן ליישם את הקלטות הווידאו והפרוטוקולים האופטוגנטיים המתוארים כאן במחקרים חד-תאיים בתחומים מגוונים, כולל אך לא מוגבל לביולוגיה של סרטן, התפתחות עוברית ובידול רקמות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

שליטה אמינה בביטוי גנים בתאי יונקים דורשת כלים עם שינוי קיפול גבוה, רעש נמוך ופונקציות העברה נחושות של קלט לפלט, ללא קשר לשיטה שבה נעשה שימוש. לקראת מטרה זו, מערכות ביטוי גנים אופטוגנטיות זכו לתשומת לב רבה בעשור האחרון לשליטה מרחבית ברמות החלבון בתאי היונקים. עם זאת, רוב המעגלים הקיימים השולטים בביטוי גנים הנגרמים על ידי אור משתנים בארכיטקטורה, באים לידי ביטוי מפלסמידים, ומשתמשים בציוד אופטוגנטי משתנה, ויוצרים צורך לחקור אפיון ותקינה של רכיבים אופטוגנטיים בשורות תאים יציבים. כאן, המחקר מספק צינור ניסיוני של בניית מעגלי גנים אמינים, אינטגרציה ואפיון לשליטה בביטוי גנים בלתי חדירים לאור בתאי יונקים, תוך שימוש במעגל אופטוגנטי משוב שלילי כדוגמה למקרה. הפרוטוקולים גם ממחישים כיצד סטנדרטיזציה של ציוד אופטוגנטי ומשטרי אור יכולה לחשוף באופן מהימן תכונות מעגל גנים כגון רעש ביטוי גנים וגודל ביטוי חלבון. לבסוף, מאמר זה עשוי להיות שימושי עבור מעבדות שאינן מוכרות עם אופטוגנטיקה המעוניינים לאמץ טכנולוגיה כזו. הצינור המתואר כאן צריך לחול על מעגלים אופטוגנטיים אחרים בתאי יונקים, המאפשרים אפיון אמין ומפורט יותר ושליטה על ביטוי גנים ברמה התמלולית, הפרוטאומית, ובסופו של דבר פנוטיפית בתאי יונקים.

הרכבת מעגלי גנים ויצירת קו תאים יציב במאמר זה התבססו על תאי HEK-293 מסחריים שעברו שינוי המכילים אתר FRT פעיל בתמלול ויציב יחיד (איור 1). מעגלי הגנים נבנו לתוך וקטורים שהיו להם אתרי FRT בתוך הפלסמיד, המאפשרים את שילוב Flp-FRT בגנום התא HEK-293. גישה זו אינה מוגבלת לתאי Flp-In, שכן ניתן להוסיף א...

Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

שליטה אמינה בתאי יונקים מגיבים לאור דורשת סטנדרטיזציה של שיטות אופטוגנטיות. לקראת מטרה זו, מחקר זה מתאר צינור של בניית מעגלי גנים, הנדסת תאים, פעולת ציוד אופטוגנטי, ובדיקות אימות כדי לתקנן את המחקר של ביטוי גנים המושרה באור באמצעות מעגל גנים אופטוגנטי משוב שלילי כמקרה מבחן.

הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

הפרוטוקול האופטוגנטי המתוקנן מיועד למעבדות המעוניינות להשתמש באור כתמריץ לשליטה בתכונות התאים במערכות תאיות מהונדסות של יונקים. פרוטוקול זה קל ליישום במעבדות אחרת לא מוכר עם optogenetics ומספק שיטות לשליטה זמנית מרחבית מדויקת של מערכות ביולוגיות מהונדסות. שיטה זו כוללת מגוון רחב של יישום בתחומי מחקר ספציפיים שבהם מידע מרחבי עשוי להיות חשוב כולל ביולוגיה של סרטן, ביולוגיה של מערכות ובידול רקמות.ראשית, בחר את הרכיבים הגנטיים כדי לשלב לאגד לתוך מעגל גן יחיד או plasmid. לדוגמה, אתרי שילוב DNA של יונקים, אלמנטים מגיבים לאור או גנים פונקציונליים. לאחר הרכבה ובדיקה של כל התכונות הדרושות כגון קודונים התחלה, רצפים רגולטוריים או מתורגמים, השתמש בכל הנדסה גנטית ותוכנת שיבוט מולקולרית, ביאורים ואחסון רצפי ה- DNA לשימוש מאוחר יותר וכהפניה.אמת את הפריימרים באופן חישובי לבניית פלסמיד באמצעות תכונות תוכנת השיבוט המולקולרי המובנות, לדוגמה, יישור רצף. כדי ליצור קו תאים יציב, להעביר את מעגלי הגנים העיצוביים ואת התאים הרצויים באמצעות תערובת ליפוזום של DNA מעגל הגן עם רקומבינאז מתאים. לאחר שהתאים הם 80 עד 100% רציפים, להקפיא את התאים בתערובת של 45% מדיה ישנה, 45% מדיה טרייה, ו 10% DMSO.העבר את התאים הנותרים לצינור סטרילי ובצע מיון של תאים חד-תאיים כדי לבודד תאים חד שבטיים לצלחת של 96 בארות. כשבועיים עד שלושה שבועות לאחר מיון חד שבטי, הבארות בתוך צלחת 96-well צריך להיות foci. כאשר 50 עד 60% מפגש מושגת, לפצל את התאים לצלחת 12-well.הוסף את הקושחה למעגל LPA המורכב באמצעות מתכנת מיקרו-בקר. לאחר מכן, שלבו חלקים מודפסים בתלת-ממד בלוח המעגלים המורכב באמצעות לוח ההרכבה, לוח המעגלים, מרווח ה- LED, מתאם הצלחת, צלחת בעלת 24 בארות, מכסה צלחת, ברגי הרכבה, אגוזי כנף ורכיבי ערימה. כדי להתחיל בניסוי אופטוגנטי, השתמש בתוכנת הקשתית הזמינה באתר מעבדת תבור כדי לתכנת כרטיס SD עבור ה- LPA ולחקור את תנאי האור המתאימים.לאחר מכן, הזן ערכי עוצמה עם השכפולים הטכניים עבור החלוקה לרמות הניסיונית הרצויה. הוסף כ -75, 000 תאים לבאר בלוח שחור של 24 באר בנפח כולל של 500 מיקרוליטרים, ולאחר מכן למקם את התאים באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר להם להסתפק במשך שעתיים עד שש שעות. לאחר העברת התאים במכסה המנוע תרבית הרקמות בסוף הדגירה, להסיר את מכסה הפלסטיק ולהוסיף רצועת רדיד דבק לחלק העליון של הצלחת למזעור העברת האור בין הבארות, כך האור יכול להיכנס רק דרך LED הממוקם בתחתית הבאר.הניחו את הצלחת בחלקים התלת-ממדיים המותאמים של ה-LPA, ולאחר מכן כסו את הצלחת במכסה LPA המודפס בתלת-ממד שמתאים לברגי ההתקן בכל פינה. חבר את ההתקן למקור החשמל ולחץ על לחצן האיפוס בהתקן LPA כדי להבטיח שהגדרות הניסוי המעודכנות של LPA יוחלו וידגרו את התאים. לאחר הדגירה, בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמות, הסר את רצועת נייר הכסף מהצלחת ותן לצלחת לשבת במשך דקה עד שתי דקות כדי למנוע עיבוי מלהיווצר על מכסה הפלסטיק.לאחר מכן, החזירו את מכסה הפלסטיק המקורי לצלחת ודמיינו את התאים עם ניגודיות הפאזה המתאימה או מיקרוסקופ פלואורסצנטיות. לאחר 24 עד 72 שעות לאחר אינדוקציה, ואחריו טריפסיניזציה, להעביר את כל התוכן של כל באר של כ 500 microliters לצינורות המסומנים מצויד מסננת התא. לאחר מכן, באמצעות תוכנת מכשיר ציטומטריית זרימה מתאימה, צור שער פיזור קדמי וצדדי כדי ללכוד את התאים הבודדים בגודל ובגרגריות המתאימים כדי לא לכלול פסולת וגושים תאיים.ברגע שהשער מוגדר, ללכוד כ 10, 000 תאים עם השער המתאים ולהתאים את מספר התא בהתאם לכמות הנתונים הסלולריים הנדרשים ולכידת תאים ניסיוניים חוזרים בכל צינור. לאחר אינדוקציה ו טריפסיניזציה, להעביר את כל התוכן של כל באר של כ 500 microliters לצינורות המסומנים. צנטריפוגות התאים במשך חמש דקות ב 400 פעמים G.לאחר השלכת supernatant, להעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים.סנכרן מחדש את התאים ב 750 ל 1, 000 microliters של 4%PFA מדולל PBS ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבור את גושי התא. לאחר 15 דקות של דגירה, להוסיף 750 ל 1, 000 microliters של PBS ושוב פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים, ולאחר מכן גלולה את התאים במשך חמש דקות ב 400 פעמים G בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת supernatant, להעביר את הדגימות למכסה המנוע אדים כימיים resuspend התאים ב 750 ל 1, 000 microliters של מתנול קר כקרח כפי שהודגם ולאפשר לתאים לשבת במשך 30 דקות במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, להוסיף 750 ל 1, 000 מיקרוליטרים של PBS תוך על ידי צנרת למעלה ולמטה כמה פעמים. ואז לאחר צנטריפוגת התאים במשך חמש דקות ב 400 פעמים G, להשליך את supernatant ולהעביר את הדגימות למכסה מנוע אדים כימי. לפנק מחדש את התאים ב 100 microliters או דילול מתאים אחר של נוגדן ראשוני שכותרתו פיפטה למעלה ולמטה שש עד שמונה פעמים, ולאחר מכן לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להוסיף 750 ל 1, 000 מיקרוליטרים של מאגר הדגירה ופתרון פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים, ולאחר מכן צנטריפוגה התאים במשך חמש דקות ב 400 פעמים G.Next, resuspend התאים ב 500 מיקרוליטרים של PBS ולשבור את הגושים על ידי צנרת למעלה ולמטה כמה פעמים. העבר את כל התוכן של כל צינור לצינורות מסומנים עם מסננות תאים. הביאו את התאים למכשירי ציטומטריית זרימה מתאימים עם לייזרים של אורכי הגל הנכונים.הכיול האופטי בוצע עבור ההתקנים. באמצעות התמונה שנרכשה חושבו ערכי פיצוי עבור נורית LED, אות הרקע הופחת ועוצמת הפיקסלים הוסקה. מקדם הווריאציה היה מינימלי בין 96 בארות.תוכנת הכיול הדגימה את וריאציית ה-LED לפי מיקום ויצרה כוונון בקנה מידה אפור כך שכל נורת LED מנורמלת לאותה עוצמה. ביטוי גנים הושרה בתאים קלים מהונדסים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית במשכי דופק אור שונים על LPA והתאים צולמו עבור ביטוי ברייטפילד ו- GFP. באמצעות ציטומטריית זרימה, התאים הושרו בערכי אורך דופק שונים והראו תגובת מינון של ביטוי גנים המכומתת ברמת האוכלוסייה של יותר מפי ארבעה שינוי ממצבים לא מושרים.המשוב השלילי הושג על פני הפחתת רעש של ביטוי גנים פי חמישה כפי שמוצג על ידי השוואת ערכי עוצמת אור שונים למערכת הקלה יותר לעומת חי או אור דולק. ניתוח qPCR הראה כי התאים הקלים המהונדסים הביעו את רמות ה-RNA באופן תגובתי במינון עם יותר מפי עשרה אינדוקציה ממצבים לא מושרים, התואמים לכימות ציטומטריית הזרימה. מעגל הגנים המהונדס הראה כמויות הולכות וגדלות של אור כחול שהביאו לעלייה ברמות חלבון KRAS ורמות ERK זרחתיות.מספר בדיקות פונקציונליות עשויות להתבצע כולל צמיחה, תנועתיות תאים, ריפוי פצעים, התפשטות, או בדיקות פלישה. שיטות אלה יכולות לספק תובנות ספציפיות על המנגנונים של ביולוגיה של סרטן, בידול רקמות או עמידות לתרופות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

ריאקטורים סיבים חלולים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; תרבות הרקמות היונקת-כמו

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

בתרבית של חלוקת התא במטריצות תלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונאפוקלית כמותיים

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

אורביטל טלטול התרבות של תאים בתרבית של צורת O כלי לייצר אגרגטים אחיד

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

מזרק-להזרקה רשת אלקטרוניקה עבור יציב אלקטרופיזיולוגיה מכרסמים כרונית

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...