Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

हम टिप्पणियों और सुझावों के लिए Balázsi प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहते हैं, डॉ कार्ल पी Gerhardt और डॉ Jeffrey जे Tabor हमें पहले LPA का निर्माण करने में मदद करने के लिए, और LOV2-degron plasmids साझा करने के लिए डॉ Wilfried वेबर. इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों [R35 GM122561 और T32 GM008444] द्वारा समर्थित किया गया था; भौतिक और मात्रात्मक जीव विज्ञान के लिए लॉफर केंद्र; और एक राष्ट्रीय रक्षा विज्ञान और इंजीनियरिंग स्नातक (एनडीएसईजी) फैलोशिप। ओपन एक्सेस चार्ज के लिए फंडिंग: एनआईएच [R35 GM122561]।
लेखक योगदान: M.T.G. और G.B. ने परियोजना की कल्पना की। M.T.G., D.C., और L.G., ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया। M.T.G., D.C., L.G., और G.B. ने डेटा का विश्लेषण किया और पांडुलिपि तैयार की। G.B. और M.T.G. ने परियोजना की देखरेख की।

1. जीन सर्किट डिजाइन
<ol><li>एक एकल जीन सर्किट / प्लास्मिड में गठबंधन करने के लिए आनुवंशिक घटकों का चयन करें (उदाहरण के लिए, स्तनधारी डीएनए एकीकरण अनुक्रम रूपांकनों 32, प्रकाश-उत्तरदायी तत्व33</su...

इस लेख के पाठकों को ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट (साथ ही साथ अन्य जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों) की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण चरणों में अंतर्दृष्टि प्राप्त हो सकती है, जिसमें 1) जीन सर्किट डिजाइन, निर्माण और सत्...

अन्य इंजीनियरिंग विषयों के समान, सिंथेटिक जीव विज्ञान का उद्देश्य प्रोटोकॉल को मानकीकृत करना है, जिससे जैविक प्रणालियों से संबंधित प्रश्नों की खोज के लिए अत्यधिक पुनरुत्पादक कार्यों वाले उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है1,2। सिंथेटिक जीव विज्ञान में एक डोमेन जहां कई नियंत्रण प्रणालियों का निर्माण किया गया है, जीन अभिव्यक्ति विनियमन 3,4 का क्षेत्र है। जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण प्रोटीन के स्तर और परिवर्तनशीलता दोनों को लक्षित कर सकता है (शोर या भिन्नता का गुणांक, सीवी = σ / μ, माध्य पर मानक विचलन के रूप में मापा जाता है), जो शारीरिक और पैथोलॉजिकल सेलुलर राज्यों में उनकी भूमिकाओं के कारण महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषताएं हैं5,6,7,8। कई सिंथेटिक सिस्टम जो प्रोटीन के स्तर और शोर को नियंत्रित कर सकते हैं4,9,10,11,12 को इंजीनियर किया गया है, जिससे उपकरणों में प्रोटोकॉल को मानकीकृत करने के अवसर पैदा होते हैं।
उपकरणों का एक उपन्यास सेट जो जीन नेटवर्क को नियंत्रित कर सकता है जो हाल ही में उभरा है वह ऑप्टोजेनेटिक्स है, जो जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश के उपयोग को सक्षम करता है13,14,15,16,17। उनके रासायनिक पूर्ववर्तियों के समान, ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट को किसी भी सेल प्रकार में पेश किया जा सकता है, जिसमें बैक्टीरिया से लेकर स्तनधारियों तक शामिल हैं, जिससे ब्याज के किसी भी डाउनस्ट्रीम जीन की अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती है18,19। हालांकि, उपन्यास ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों की तेजी से पीढ़ी के कारण, कई प्रणालियां उभरी हैं जो आनुवंशिक सर्किट आर्किटेक्चर, अभिव्यक्ति के तंत्र (जैसे, प्लास्मिड-आधारित बनाम वायरल एकीकरण) और प्रकाश आपूर्ति नियंत्रण उपकरण11,16,20,21,22,23,24,25 में भिन्न होती हैं . इसलिए, यह जीन सर्किट निर्माण और अनुकूलन, सिस्टम उपयोग की विधि (जैसे, एकीकरण बनाम क्षणिक अभिव्यक्ति), प्रेरण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक उपकरण, और परिणामों के विश्लेषण जैसी ऑप्टोजेनेटिक विशेषताओं के मानकीकरण के लिए जगह छोड़ देता है।
स्तनधारी कोशिकाओं में ऑप्टोजेनेटिक प्रोटोकॉल के मानकीकरण पर प्रगति करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में एचईके 293 कोशिकाओं (मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिका रेखा) में एकीकृत नकारात्मक प्रतिक्रिया (एनएफ) जीन सर्किट का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं में ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को इंजीनियर करने के लिए एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन का वर्णन करता है। NF मानकीकरण का प्रदर्शन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है क्योंकि यह प्रकृति में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में 26,27,28 है, जिससे प्रोटीन के स्तर को ट्यून किया जा सकता है और शोर न्यूनीकरण होने की अनुमति मिलती है। संक्षेप में, एनएफ एक दमनकारी द्वारा सटीक जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए अपनी अभिव्यक्ति को पर्याप्त रूप से तेजी से कम करने की अनुमति देता है, जिससे किसी भी परिवर्तन को स्थिर स्थिति से दूर सीमित किया जा सकता है। स्थिर स्थिति को एक प्रेरक द्वारा बदला जा सकता है जो दमनकारी को निष्क्रिय या समाप्त कर देता है ताकि अधिक प्रोटीन उत्पादन की अनुमति दी जा सके जब तक कि प्रत्येक प्रेरक एकाग्रता के लिए एक नई स्थिर स्थिति तक नहीं पहुंच जाती है। हाल ही में, एक इंजीनियर एनएफ ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम बनाया गया था जो जीन अभिव्यक्ति की एक व्यापक गतिशील प्रतिक्रिया का उत्पादन कर सकता है, कम शोर बनाए रख सकता है, और स्थानिक जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण 11 की क्षमता की अनुमति देने वाले प्रकाश उत्तेजनाओं का जवाब दे सकता है। ये उपकरण, जिन्हें लाइट-इनड्यूसिबल ट्यूनर्स (LITers) के रूप में जाना जाता है, पहले की प्रणालियों से प्रेरित थे, जिन्होंने जीवित कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण की अनुमति दी 4,10,29,30 और दीर्घकालिक जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए मानव सेल लाइनों में स्थिर रूप से एकीकृत किया गया था।
यहां, एक उदाहरण के रूप में LITer का उपयोग करते हुए, प्रकाश-उत्तरदायी जीन सर्किट बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है, एक लाइट प्लेट उपकरण (एलपीए, एक ऑप्टोजेनेटिक इंडक्शन हार्डवेयर) 31 के साथ जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, और कस्टम प्रकाश उत्तेजनाओं के लिए इंजीनियर, ऑप्टोजेनेटिक रूप से-नियंत्रणीय सेल लाइनों की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करता है। यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को किसी भी कार्यात्मक जीन के लिए LITer उपकरणका उपयोग करने की अनुमति देता है जो वे खोजना चाहते हैं। इसे विभिन्न सर्किट आर्किटेक्चर (जैसे, सकारात्मक प्रतिक्रिया, नकारात्मक विनियमन, आदि) के साथ अन्य ऑप्टोजेनेटिक प्रणालियों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जो नीचे उल्लिखित तरीकों और ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को एकीकृत करके किया जाता है। अन्य सिंथेटिक जीव विज्ञान प्रोटोकॉल के समान, यहां उल्लिखित वीडियो रिकॉर्डिंग और ऑप्टोजेनेटिक प्रोटोकॉल को विभिन्न क्षेत्रों में एकल-सेल अध्ययनों में लागू किया जा सकता है, जिसमें कैंसर जीव विज्ञान, भ्रूण विकास और ऊतक भेदभाव तक सीमित नहीं है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

स्तनधारी कोशिकाओं में विश्वसनीय जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए उच्च गुना परिवर्तन, कम शोर और निर्धारित इनपुट-टू-आउटपुट ट्रांसफर फ़ंक्शंस वाले उपकरणों की आवश्यकता होती है, भले ही उपयोग की गई विधि की परवाह किए बिना। इस लक्ष्य की ओर, ऑप्टोजेनेटिक जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों ने स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन के स्तर के स्पैटिओटेम्पोरल नियंत्रण के लिए पिछले दशक में बहुत ध्यान आकर्षित किया है। हालांकि, प्रकाश-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले अधिकांश मौजूदा सर्किट वास्तुकला में भिन्न होते हैं, प्लास्मिड से व्यक्त किए जाते हैं, और चर ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का उपयोग करते हैं, जिससे स्थिर सेल लाइनों में ऑप्टोजेनेटिक घटकों के लक्षण वर्णन और मानकीकरण का पता लगाने की आवश्यकता होती है। यहां, अध्ययन स्तनधारी कोशिकाओं में प्रकाश-अपरिवर्तनीय जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए विश्वसनीय जीन सर्किट निर्माण, एकीकरण और लक्षण वर्णन की एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन प्रदान करता है, एक मामले के उदाहरण के रूप में एक नकारात्मक प्रतिक्रिया ऑप्टोजेनेटिक सर्किट का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल यह भी बताते हैं कि ऑप्टोजेनेटिक उपकरण और प्रकाश शासनों को मानकीकृत करने से जीन अभिव्यक्ति शोर और प्रोटीन अभिव्यक्ति परिमाण जैसी जीन सर्किट विशेषताओं को मज़बूती से प्रकट किया जा सकता है। अंत में, यह पेपर ऑप्टोजेनेटिक्स से अपरिचित प्रयोगशालाओं के लिए उपयोग का हो सकता है जो इस तरह की तकनीक को अपनाना चाहते हैं। यहां वर्णित पाइपलाइन को स्तनधारी कोशिकाओं में अन्य ऑप्टोजेनेटिक सर्किट के लिए लागू होना चाहिए, जिससे स्तनधारी कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्शनल, प्रोटिओमिक और अंततः फेनोटाइपिक स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के अधिक विश्वसनीय, विस्तृत लक्षण वर्णन और नियंत्रण की अनुमति मिलती है।

इस लेख के भीतर जीन सर्किट असेंबली और स्थिर सेल लाइन पीढ़ी वाणिज्यिक, संशोधित एचईके -293 कोशिकाओं पर आधारित थी, जिसमें एक ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय, एकल स्थिर एफआरटी साइट (चित्रा 1) शामिल थी।...

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Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

मज़बूती से प्रकाश-उत्तरदायी स्तनधारी कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक तरीकों के मानकीकरण की आवश्यकता होती है। इस लक्ष्य की ओर, यह अध्ययन जीन सर्किट निर्माण, सेल इंजीनियरिंग, ऑप्टोजेनेटिक उपकरण संचालन, और सत्यापन assays की एक पाइपलाइन को रेखांकित करता है ताकि एक मामले के अध्ययन के रूप में नकारात्मक-प्रतिक्रिया ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट का उपयोग करके प्रकाश-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन को मानकीकृत किया जा सके।

मज़बूती से इंजीनियरिंग और स्तनधारी कोशिकाओं में स्थिर ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट को नियंत्रित करना

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

मानकीकृत ऑप्टोजेनेटिक प्रोटोकॉल को इंजीनियर स्तनधारी सेल सिस्टम में सेलुलर गुणों को नियंत्रित करने के लिए उत्तेजना के रूप में प्रकाश का उपयोग करने में रुचि रखने वाली प्रयोगशालाओं के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस प्रोटोकॉल को प्रयोगशालाओं में लागू करना आसान है अन्यथा ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ अपरिचित है और इंजीनियर जैविक प्रणालियों के सटीक स्थानिक अस्थायी नियंत्रण के लिए विधियां प्रदान करता है। इस विधि में विशिष्ट अनुसंधान क्षेत्रों में आवेदन की एक विस्तृत श्रृंखला है जहां कैंसर जीव विज्ञान, सिस्टम जीव विज्ञान और ऊतक भेदभाव सहित स्पैटिओटेम्पोरल जानकारी महत्वपूर्ण हो सकती है।शुरू करने के लिए, एक एकल जीन सर्किट या प्लास्मिड में बांधने के लिए आनुवंशिक घटकों का चयन करें। उदाहरण के लिए, स्तनधारी डीएनए एकीकरण साइटें, प्रकाश उत्तरदायी तत्व, या कार्यात्मक जीन। सभी आवश्यक विशेषताओं को इकट्ठा करने और जांचने के बाद जैसे कि स्टार्ट कोडोन, नियामक या अनुवादित अनुक्रम, किसी भी आनुवंशिक इंजीनियरिंग और आणविक क्लोनिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें, बाद में उपयोग के लिए और संदर्भ के रूप में डीएनए अनुक्रमों को एनोटेट और स्टोर करें।अंतर्निहित आणविक क्लोनिंग सॉफ़्टवेयर सुविधाओं के माध्यम से प्लास्मिड निर्माण के लिए प्राइमरों को कम्प्यूटेशनल रूप से मान्य करें, उदाहरण के लिए, अनुक्रम संरेखण। एक स्थिर सेल लाइन उत्पन्न करने के लिए, डिजाइन जीन सर्किट और वांछित कोशिकाओं को उचित पुनर्संयोजन के साथ जीन सर्किट डीएनए के लिपोसोम मिश्रण का उपयोग करके ट्रांसफेक्ट करें। कोशिकाओं के 80 से 100% confluent होने के बाद, 45% पुराने मीडिया, 45% ताजा मीडिया और 10% DMSO के मिश्रण में कोशिकाओं को फ्रीज करें।शेष कोशिकाओं को एक बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें और मोनोक्लोनल कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेट में अलग करने के लिए एकल-सेल सॉर्टिंग करें। मोनोक्लोनल सॉर्टिंग के लगभग दो से तीन सप्ताह बाद, 96-अच्छी तरह से प्लेट के भीतर कुओं में फोकी होना चाहिए। जब 50 से 60% confluency प्राप्त की जाती है, तो कोशिकाओं को 12-अच्छी तरह से प्लेट में विभाजित करें।एक माइक्रोकंट्रोलर प्रोग्रामर का उपयोग करके इकट्ठे एलपीए सर्किट में फर्मवेयर जोड़ें। इसके बाद, बढ़ते प्लेट, सर्किट बोर्ड, एलईडी स्पेसर, प्लेट एडाप्टर, एक 24-अच्छी तरह से प्लेट, एक प्लेट ढक्कन, बढ़ते बोल्ट, विंग नट और स्टैकिंग घटकों का उपयोग करके इकट्ठे सर्किट बोर्ड में 3 डी मुद्रित भागों को संयोजित करें। एक ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग शुरू करने के लिए, एलपीए के लिए एक एसडी कार्ड प्रोग्राम करने और उचित प्रकाश स्थितियों का पता लगाने के लिए टैबर लैब वेबसाइट पर उपलब्ध आईरिस सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।अगला, वांछित प्रयोगात्मक रूपरेखा के लिए तकनीकी प्रतिकृति के साथ तीव्रता मान दर्ज करें। 500 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में 24-अच्छी तरह से काली प्लेट में लगभग 75, 000 कोशिकाओं को अच्छी तरह से जोड़ें, फिर कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रखें ताकि उन्हें दो से छह घंटे तक बसने की अनुमति मिल सके। इनक्यूबेशन के अंत में ऊतक संस्कृति हुड में कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के बाद, प्लास्टिक के ढक्कन को हटा दें और कुओं के बीच प्रकाश हस्तांतरण को कम करने के लिए प्लेट के शीर्ष पर एक चिपकने वाली पन्नी पट्टी जोड़ें ताकि प्रकाश केवल कुएं के नीचे स्थित एलईडी के माध्यम से प्रवेश कर सके।प्लेट को एलपीए के फिट किए गए 3 डी भागों में रखें, फिर प्लेट को 3 डी मुद्रित एलपीए ढक्कन के साथ कवर करें जो प्रत्येक कोने पर डिवाइस शिकंजा पर फिट बैठता है। डिवाइस को पावर स्रोत में प्लग करें और यह सुनिश्चित करने के लिए एलपीए डिवाइस पर रीसेट बटन को पुश करें कि अपडेट किए गए एलपीए प्रयोग सेटिंग्स लागू की गई हैं और कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, ऊतक संस्कृति हुड के अंदर, प्लेट से पन्नी पट्टी को हटा दें और प्लेट को प्लास्टिक के ढक्कन पर संघनन को रोकने के लिए एक से दो मिनट तक बैठने दें।इसके बाद, मूल प्लास्टिक ढक्कन को प्लेट पर वापस रखें और उचित चरण कंट्रास्ट या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की छवि बनाएं। प्रेरण के बाद 24 से 72 घंटे के बाद, ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद, लगभग 500 माइक्रोलीटर के प्रत्येक कुएं की पूरी सामग्री को सेल छलनी से सुसज्जित लेबल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। फिर उपयुक्त प्रवाह साइटोमेट्री इंस्ट्रूमेंट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, मलबे और सेलुलर clumps को बाहर करने के लिए उचित आकार और ग्रैन्युलैरिटी की एकल कोशिकाओं को कैप्चर करने के लिए एक आगे और साइड स्कैटर गेट बनाएं।एक बार गेट सेट होने के बाद, उपयुक्त गेट के साथ लगभग 10, 000 कोशिकाओं को कैप्चर करें और आवश्यक सेलुलर डेटा की मात्रा के आधार पर सेल नंबर को समायोजित करें और प्रत्येक ट्यूब में प्रयोगात्मक कोशिकाओं को कैप्चर करें। प्रेरण और ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद, लगभग 500 माइक्रोलीटर के प्रत्येक कुएं की पूरी सामग्री को लेबल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 400 बार G. supernatant त्यागने के बाद, नमूनों को एक रासायनिक धुएं हुड करने के लिए ले जाने के बाद पांच मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।750 से 1, 4% पीएफए के 000 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया और सेल क्लंप को तोड़ने के लिए कई बार पिपेट को ऊपर और नीचे किया गया। इनक्यूबेशन के 15 मिनट के बाद, पीबीएस के 750 से 1, 000 माइक्रोलीटर जोड़ें और फिर से कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें, फिर कमरे के तापमान पर 400 बार जी पर पांच मिनट के लिए कोशिकाओं को गोली मार दें। supernatant को त्यागने के बाद, नमूनों को एक रासायनिक धुएं हुड में ले जाएं और 750 से 1, 000 माइक्रोलीटर बर्फ के ठंडे मेथनॉल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें जैसा कि प्रदर्शित किया गया है और कोशिकाओं को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 30 मिनट तक बैठने की अनुमति देता है।इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस के 750 से 1, 000 माइक्रोलीटर जोड़ें, जबकि कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करके। फिर 400 बार जी पर पांच मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करने के बाद, supernatant को छोड़ दें और नमूनों को एक रासायनिक धुएं के हुड में ले जाएं। 100 माइक्रोलीटर या लेबल किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी के अन्य उपयुक्त कमजोर पड़ने या पिपेट को छह से आठ बार ऊपर और नीचे की ओर छोड़ दें, फिर कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।इसके बाद, इनक्यूबेशन बफर और पिपेट समाधान के 750 से 1, 000 माइक्रोलीटर को कई बार ऊपर और नीचे जोड़ें, फिर कोशिकाओं को 400 बार G.Next पर पांच मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और कई बार ऊपर और नीचे पाइप करके clumps को तोड़ दें। प्रत्येक ट्यूब की पूरी सामग्री को कोशिकाओं के साथ लेबल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। सही तरंग दैर्ध्य के लेजर के साथ उपयुक्त प्रवाह cytometry उपकरणों के लिए कोशिकाओं को लाने.ऑप्टिकल अंशांकन उपकरणों के लिए किया गया था। अधिग्रहीत छवि का उपयोग करते हुए, एलईडी के लिए मुआवजे के मूल्यों की गणना की गई थी, पृष्ठभूमि संकेत को घटाया गया था, और पिक्सेल तीव्रता का अनुमान लगाया गया था। भिन्नता का गुणांक 96 कुओं के बीच न्यूनतम था।अंशांकन सॉफ़्टवेयर ने स्थान द्वारा एलईडी भिन्नता का प्रदर्शन किया और एक ग्रे स्केल समायोजन बनाया ताकि प्रत्येक एलईडी को एक ही तीव्रता के लिए सामान्यीकृत किया जा सके। जीन अभिव्यक्ति को एलपीए पर विभिन्न प्रकाश नाड़ी अवधियों पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इंजीनियर लाइटर कोशिकाओं में प्रेरित किया गया था और कोशिकाओं को ब्राइटफील्ड और जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए चित्रित किया गया था। प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं को विभिन्न नाड़ी लंबाई मूल्यों पर प्रेरित किया गया था और जीन अभिव्यक्ति की एक खुराक प्रतिक्रिया दिखाई गई थी जो कि अप्रेरित राज्यों से चार गुना से अधिक परिवर्तन के जनसंख्या स्तर पर परिमाणित थी।नकारात्मक प्रतिक्रिया पांच गुना जीन अभिव्यक्ति शोर में कमी से अधिक प्राप्त के रूप में लाइटर प्रणाली बनाम ज्वलंत या प्रकाश पर के लिए विभिन्न प्रकाश तीव्रता मूल्यों की तुलना करके दिखाया गया है. क्यूपीसीआर विश्लेषण से पता चला है कि इंजीनियर लाइटर कोशिकाओं ने आरएनए स्तरों को एक खुराक-उत्तरदायी तरीके से व्यक्त किया, जिसमें अप्रेरित राज्यों से दस गुना से अधिक प्रेरण था, जो प्रवाह साइटोमेट्री परिमाणीकरण से मेल खाता था। इंजीनियर लाइटर जीन सर्किट ने नीली रोशनी की बढ़ती मात्रा को दिखाया जिसके परिणामस्वरूप केआरएस प्रोटीन के स्तर में वृद्धि हुई और फॉस्फोराइलेटेड ईआरके स्तर में वृद्धि हुई।कई कार्यात्मक assays विकास, सेल गतिशीलता, घाव भरने, प्रसार, या आक्रमण assays सहित प्रदर्शन किया जा सकता है. ये विधियां कैंसर जीव विज्ञान, ऊतक भेदभाव, या दवा प्रतिरोध के तंत्र में विशिष्ट अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती हैं।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

लक्षित स्थिर आइसोटोप कमजोर पड़ने तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए सेलुलर लिपिड निकालना

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

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मांसपेशियों के उत्थान के माउस मॉडल में प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न मेसोंगियोब्लास्ट की तरह मायोजेनिक प्रोजेनिटर का प्रत्यारोपण

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

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Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

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Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

ऊतकों और Organoids इंजीनियरिंग के लिए Microfluidic Bioprinting Vascularized

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

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The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

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An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

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Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

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Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...