Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il laboratorio Balázsi per commenti e suggerimenti, il Dr. Karl P. Gerhardt e il Dr. Jeffrey J. Tabor per averci aiutato a costruire il primo LPA e il Dr. Wilfried Weber per aver condiviso i plasmidi LOV2-degron. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [R35 GM122561 e T32 GM008444]; Il Centro Laufer per la Biologia Fisica e Quantitativa; e una National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Finanziamento per la tariffa di accesso aperto: NIH [R35 GM122561].
Contributi dell'autore: M.T.G. e G.B. hanno ideato il progetto. M.T.G., D.C. e L.G., eseguirono gli esperimenti. M.T.G., D.C., L.G. e G.B. analizzarono i dati e prepararono il manoscritto. G.B. e M.T.G. hanno supervisionato il progetto.

1. Progettazione del circuito genico
<ol><li>Selezionare componenti genetiche da combinare in un singolo circuito genico/plasmide (ad esempio, motivi di sequenza di integrazione del DNA dei mammiferi32, elementi sensibili alla luce33 o geni funzionali34).</li>
	<li>Utilizzando qualsiasi software di ingegneria genetica e/o clonazione molecolare, memorizzare le sequenze di DNA per un uso e un riferimento successivi, annotare ogni sequenza ed esaminar...

I lettori di questo articolo possono ottenere informazioni sui passaggi vitali per caratterizzare i circuiti genici optogenetici (così come altri sistemi di espressione genica), tra cui 1) progettazione, costruzione e convalida del circuito genico; 2) ingegneria cellulare per l'introduzione di circuiti genici in linee cellulari stabili (ad esempio, ricombinazione Flp-FRT); 3) induzione delle celle ingegnerizzate con una piattaforma light-based come l'LPA; 4) caratterizzazione iniziale di saggi di induzione della luce me...

Analogamente ad altre discipline ingegneristiche, la biologia sintetica mira a standardizzare i protocolli, consentendo di utilizzare strumenti con funzioni altamente riproducibili per esplorare questioni rilevanti per i sistemi biologici1,2. Un dominio in biologia sintetica in cui sono stati costruiti molti sistemi di controllo è l'area della regolazione dell'espressione genica3,4. Il controllo dell'espressione genica può colpire sia i livelli proteici che la variabilità (rumore o coefficiente di variazione, CV = σ/μ, misurata come deviazione standard rispetto alla media), che sono caratteristiche cellulari cruciali a causa del loro ruolo negli stati cellulari fisiologici e patologici5,6,7,8. Molti sistemi sintetici in grado di controllare i livelli di proteine e il rumore4,9,10,11,12 sono stati progettati, creando opportunità per standardizzare i protocolli tra gli strumenti.
Un nuovo set di strumenti in grado di controllare le reti geniche recentemente emerse è l'optogenetica, che consente l'uso della luce per controllare l'espressione genica13,14,15,16,17. Simili ai loro predecessori chimici, i circuiti genici optogenetici possono essere introdotti in qualsiasi tipo di cellula, dai batteri ai mammiferi, consentendo l'espressione di qualsiasi gene a valle di interesse18,19. Tuttavia, a causa della rapida generazione di nuovi strumenti optogenetici, sono emersi molti sistemi che variano nell'architettura del circuito genetico, nel meccanismo di espressione (ad esempio, integrazione basata su plasmidi vs virale) e nelle apparecchiature di controllo dell'alimentazione della luce11,16,20,21,22,23,24,25 . Pertanto, questo lascia spazio alla standardizzazione delle caratteristiche optogenetiche come la costruzione e l'ottimizzazione del circuito genico, il metodo di utilizzo del sistema (ad esempio, integrazione vs espressione transitoria), strumenti sperimentali utilizzati per l'induzione e analisi dei risultati.
Per fare progressi nella standardizzazione dei protocolli optogenetici nelle cellule di mammifero, questo protocollo descrive una pipeline sperimentale per ingegnerizzare sistemi optogenetici in cellule di mammifero utilizzando un circuito genico a feedback negativo (NF) integrato nelle cellule HEK293 (linea cellulare del rene embrionale umano) come esempio. NF è un sistema ideale per dimostrare la standardizzazione poiché è altamente abbondante26,27,28 in natura, consentendo di sintonizzare i livelli proteici e di ridurre al minimo il rumore. In breve, NF consente un controllo preciso dell'espressione genica da parte di un repressore riducendo la propria espressione sufficientemente velocemente, limitando così qualsiasi cambiamento lontano da uno stato stazionario. Lo stato stazionario può essere alterato da un induttore che inattiva o elimina il repressore per consentire una maggiore produzione di proteine fino a raggiungere un nuovo stato stazionario per ogni concentrazione di induttore. Recentemente, è stato creato un sistema optogenetico NF ingegnerizzato in grado di produrre una risposta dinamica ampia di espressione genica, mantenere un basso rumore e rispondere agli stimoli luminosi consentendo il potenziale per il controllo dell'espressione genica spaziale11. Questi strumenti, noti come sintonizzatori inducibili dalla luce (LITers), sono stati ispirati da sistemi precedenti che consentivano il controllo dell'espressione genica nelle cellule viventi4,10,29,30 e sono stati stabilmente integrati nelle linee cellulari umane per garantire il controllo dell'espressione genica a lungo termine.
Qui, usando il LITer come esempio, viene delineato un protocollo per creare circuiti genici sensibili alla luce, inducendo l'espressione genica con un light plate apparatus (LPA, un hardware di induzione optogenetica)31 e analizzare le risposte delle linee cellulari ingegnerizzate e optogeneticamente controllabili a stimoli luminosi personalizzati. Questo protocollo consente agli utenti di utilizzare gli strumenti LITer per qualsiasi gene funzionale che desiderano esplorare. Può anche essere adattato per altri sistemi optogenetici con diverse architetture circuitali (ad esempio, feedback positivo, regolazione negativa, ecc.) integrando i metodi e le apparecchiature optogenetiche descritte di seguito. Simile ad altri protocolli di biologia sintetica, le registrazioni video e i protocolli optogenetici qui delineati possono essere applicati in studi su singole cellule in diverse aree, tra cui, ma non solo, la biologia del cancro, lo sviluppo embrionale e la differenziazione dei tessuti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

Un controllo affidabile dell'espressione genica nelle cellule di mammifero richiede strumenti con elevato cambiamento di piega, basso rumore e determinate funzioni di trasferimento input-to-output, indipendentemente dal metodo utilizzato. Verso questo obiettivo, i sistemi di espressione genica optogenetica hanno guadagnato molta attenzione negli ultimi dieci anni per il controllo spaziotemporale dei livelli proteici nelle cellule di mammifero. Tuttavia, la maggior parte dei circuiti esistenti che controllano l'espressione genica indotta dalla luce variano in architettura, sono espressi da plasmidi e utilizzano apparecchiature optogenetiche variabili, creando la necessità di esplorare la caratterizzazione e la standardizzazione dei componenti optogenetici in linee cellulari stabili. Qui, lo studio fornisce una pipeline sperimentale di costruzione, integrazione e caratterizzazione di circuiti genici affidabili per il controllo dell'espressione genica inducibile dalla luce nelle cellule di mammifero, utilizzando un circuito optogenetico a feedback negativo come esempio di caso. I protocolli illustrano anche come la standardizzazione delle apparecchiature optogenetiche e dei regimi di luce possa rivelare in modo affidabile le caratteristiche del circuito genico come il rumore di espressione genica e l'entità dell'espressione proteica. Infine, questo documento può essere utile per i laboratori che non hanno familiarità con l'optogenetica che desiderano adottare tale tecnologia. La pipeline qui descritta dovrebbe applicarsi ad altri circuiti optogenetici nelle cellule di mammifero, consentendo una caratterizzazione e un controllo più affidabili e dettagliati dell'espressione genica a livello trascrizionale, proteomico e, infine, fenotipico nelle cellule di mammifero.

L'assemblaggio del circuito genico e la generazione di linee cellulari stabili all'interno di questo articolo erano basati su cellule HEK-293 modificate commerciali contenenti un sito FRT trascrizionalmente attivo e singolo stabile (Figura 1). I circuiti genici sono stati costruiti in vettori che avevano siti FRT all'interno del plasmide, consentendo l'integrazione Flp-FRT nel genoma cellulare HEK-293. Questo approccio non è limitato alle cellule Flp-In, poiché i siti FRT possono essere ag...

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Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Il controllo affidabile delle cellule di mammifero sensibili alla luce richiede la standardizzazione dei metodi optogenetici. Verso questo obiettivo, questo studio delinea una pipeline di costruzione di circuiti genici, ingegneria cellulare, funzionamento di apparecchiature optogenetiche e saggi di verifica per standardizzare lo studio dell'espressione genica indotta dalla luce utilizzando un circuito genico optogenetico a feedback negativo come caso di studio.

Ingegnerizzazione e controllo affidabili di circuiti genetici optogenetici stabili nelle cellule di mammifero

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Il protocollo optogenetico standardizzato è progettato per i laboratori interessati a utilizzare la luce come stimolo per controllare le proprietà cellulari nei sistemi cellulari di mammiferi ingegnerizzati. Questo protocollo è facile da implementare in laboratori altrimenti non familiari con l'optogenetica e fornisce metodi per un preciso controllo temporale spaziale dei sistemi biologici ingegnerizzati. Questo metodo ha una vasta gamma di applicazioni in specifiche aree di ricerca in cui le informazioni spazio-temporali possono essere importanti, tra cui la biologia del cancro, la biologia dei sistemi e la differenziazione dei tessuti.Per cominciare, selezionare i componenti genetici da combinare si legano in un singolo circuito genico o plasmide. Ad esempio, siti di integrazione del DNA dei mammiferi, elementi sensibili alla luce o geni funzionali. Dopo aver assemblato ed esaminato tutte le caratteristiche necessarie come codoni di avvio, sequenze regolatorie o tradotte, utilizzare qualsiasi software di ingegneria genetica e clonazione molecolare, annotare e memorizzare le sequenze di DNA per un uso successivo e come riferimento.Convalidare i primer computazionalmente per la costruzione di plasmidi attraverso le funzionalità del software di clonazione molecolare integrato, ad esempio l'allineamento delle sequenze. Per generare una linea cellulare stabile, trasfettare i circuiti genici di progettazione e le cellule desiderate utilizzando una miscela liposomica del DNA del circuito genico con appropriata ricombinasi. Dopo che le cellule sono confluenti dall'80 al 100%, congelare le cellule in un mix di 45% di vecchi media, 45% di media freschi e 10% di DMSO.Trasferire le cellule rimanenti in un tubo sterile ed eseguire lo smistamento a singola cellula per isolare le cellule monoclonali in una piastra a 96 pozzetti. Circa due o tre settimane dopo la selezione monoclonale, i pozzetti all'interno della piastra a 96 pozzetti dovrebbero avere focolai. Quando si raggiunge una confluenza dal 50 al 60%, dividere le cellule in una piastra a 12 pozzetti.Aggiungere il firmware al circuito LPA assemblato utilizzando un programmatore microcontroller. Successivamente, combinare parti stampate in 3D nel circuito assemblato utilizzando la piastra di montaggio, il circuito stampato, il distanziatore LED, l'adattatore per piastra, una piastra a 24 pozzetti, un coperchio della piastra, bulloni di montaggio, dadi alari e componenti impilabili. Per iniziare un esperimento optogenetico, utilizzare il software Iris disponibile sul sito Web Tabor Lab per programmare una scheda SD per l'LPA ed esplorare le condizioni di luce appropriate.Quindi, immettere i valori di intensità con le repliche tecniche per il contorno sperimentale desiderato. Aggiungere circa 75.000 cellule per pozzetto in una piastra nera a 24 pozzetti in un volume totale di 500 microlitri, quindi posizionare le cellule in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica per consentire loro di stabilirsi da due a sei ore. Dopo aver trasferito le cellule nella cappa di coltura del tessuto alla fine dell'incubazione, rimuovere il coperchio di plastica e aggiungere una striscia di lamina adesiva nella parte superiore della piastra per ridurre al minimo il trasferimento di luce tra i pozzetti in modo che la luce possa entrare solo attraverso il LED situato nella parte inferiore del pozzo.Posizionare la piastra nelle parti 3D montate dell'LPA, quindi coprire la piastra con il coperchio LPA stampato in 3D che si adatta alle viti del dispositivo su ogni angolo. Collegare il dispositivo alla fonte di alimentazione e premere il pulsante di ripristino sul dispositivo LPA per assicurarsi che vengano applicate le impostazioni aggiornate dell'esperimento LPA e incubare le celle. Dopo l'incubazione, all'interno del cappuccio di coltura del tessuto, rimuovere la striscia di alluminio dalla piastra e lasciare riposare la piastra per uno o due minuti per evitare che si formi condensa sul coperchio di plastica.Quindi, rimettere il coperchio di plastica originale sulla piastra e visualizzare le cellule con il microscopio a contrasto di fase o fluorescenza appropriato. Dopo 24-72 ore dopo l'induzione, seguita dalla tripsinizzazione, trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto di circa 500 microlitri ai tubi etichettati dotati del filtro cellulare. Quindi, utilizzando un appropriato software per strumenti di citometria a flusso, creare un cancello di dispersione anteriore e laterale per catturare le singole cellule delle dimensioni e della granularità appropriate per escludere detriti e grumi cellulari.Una volta impostato il gate, acquisire circa 10.000 celle con il gate appropriato e regolare il numero di celle in base alla quantità di dati cellulari richiesti e ripetere l'acquisizione di cellule sperimentali in ciascun tubo. Dopo l'induzione e la tripsinizzazione, trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto di circa 500 microlitri ai tubi etichettati. Centrifugare le cellule per cinque minuti a 400 volte G.Dopo aver scartato il surnatante, spostare i campioni in una cappa chimica.Risospesso le cellule in 750 a 1.000 microlitri di PFA al 4% diluiti in PBS e pipetta su e giù più volte per rompere i grumi cellulari. Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere da 750 a 1.000 microlitri di PBS e di nuovo pipettare su e giù più volte, quindi pellet giù le celle per cinque minuti a 400 volte G a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, spostare i campioni in una cappa chimica e risospesciare le celle in 750-1.000 microlitri di metanolo ghiacciato come dimostrato e consentire alle cellule di sedersi per 30 minuti in un congelatore a meno 20 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, aggiungere da 750 a 1.000 microlitri di PBS mentre si esegue il pipettaggio su e giù più volte. Quindi, dopo aver centrifugato le cellule per cinque minuti a 400 volte G, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa chimica. Risospese le cellule in 100 microlitri o altra diluizione adatta di anticorpi primari marcati e pipette su e giù da sei a otto volte, quindi incubare per un'ora a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere da 750 a 1.000 microlitri del tampone di incubazione e della soluzione di pipetta su e giù più volte, quindi centrifugare le celle per cinque minuti a 400 volte G.Successivamente, risospescere le cellule in 500 microlitri di PBS e rompere i grumi tubando su e giù più volte. Trasferire l'intero contenuto di ciascun tubo in tubi etichettati con filtri per cellule. Portare le cellule ad appositi strumenti di citometria a flusso con laser delle corrette lunghezze d'onda.La calibrazione ottica è stata eseguita per i dispositivi. Utilizzando l'immagine acquisita, sono stati calcolati i valori di compensazione per il LED, il segnale di sfondo è stato sottratto e l'intensità dei pixel è stata dedotta. Il coefficiente di variazione era minimo tra 96 pozzi.Il software di calibrazione ha dimostrato la variazione del LED in base alla posizione e ha creato una regolazione della scala di grigi in modo che ogni LED sia normalizzato alla stessa intensità. L'espressione genica è stata indotta in cellule più leggere ingegnerizzate tramite microscopia a fluorescenza a diverse durate di impulsi luminosi sull'LPA e le cellule sono state fotografate per l'espressione di Brightfield e GFP. Utilizzando la citometria a flusso, le cellule sono state indotte a diversi valori di lunghezza dell'impulso e hanno mostrato una risposta alla dose di espressione genica quantificata a livello di popolazione di oltre quattro volte il cambiamento da stati non indotti.Il feedback negativo ha ottenuto una riduzione del rumore di espressione genica di oltre cinque volte, come mostrato confrontando vari valori di intensità luminosa per il sistema più leggero rispetto a vivido o acceso. L'analisi qPCR ha mostrato che le cellule più leggere ingegnerizzate hanno espresso i livelli di RNA in modo dose-responsivo con un'induzione di oltre dieci volte da stati non indotti, corrispondente alla quantificazione della citometria a flusso. Il circuito genico più leggero ingegnerizzato ha mostrato quantità crescenti di luce blu che hanno portato ad un aumento dei livelli di proteina KRAS e dei livelli di ERK fosforilati.Possono essere eseguiti diversi saggi funzionali tra cui crescita, motilità cellulare, guarigione delle ferite, proliferazione o analisi di invasione. Questi metodi potrebbero fornire approfondimenti specifici sui meccanismi della biologia del cancro, della differenziazione dei tessuti o della resistenza ai farmaci.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Ricerca

Bioingegneria

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Bioreattori fibra cava per<em&gt; In Vivo</em&gt; -come Mammiferi Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Progettazione e Realizzazione di un Illuminating automatizzato, Coltura, e di campionamento per microbica optogenetic Applicazioni

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Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

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The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

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An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

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Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

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