Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Balázsi研究室のコメントと提案、最初のLPAの構築を支援してくれたKarl P. Gerhardt博士とJeffrey J. Tabor博士、LOV2-degronプラスミドを共有してくれたWilfried Weber博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所[R35 GM122561およびT32 GM008444]によって支援された。物理的および定量的生物学のためのローファーセンター;国防理工学大学院(NDSEG)フェローシップ。オープンアクセス料金の資金調達:NIH [R35 GM122561]。
著者の貢献:M.T.G.とG.B.がプロジェクトを考案しました。M.T.G.、D.、およびL.G.は、実験を行.Cた。M.T.G.、D.G.、L.G.、およびG..C.は、データを分析し、原稿を準備した.B。G..B.とM.T.G.がプロジェクトを監督した。

1. 遺伝子回路設計
<ol><li>単一の遺伝子回路/プラスミドに結合する遺伝的構成要素(例えば、哺乳動物DNA組み込み配列モチーフ32、光応答性エレメント33、または機能遺伝子34)を選択する。</li>
	<li>遺伝子工学および/または分子クローニングソフトウェアを使用して、後で使用するためにDNA配列を保存し、参照し、各配列に注釈を付け、必?...

この記事の読者は、1)遺伝子回路の設計、構築、および検証を含む、光遺伝学的遺伝子回路(および他の遺伝子発現システム)を特徴付けるために不可欠なステップについての洞察を得ることができます。2)遺伝子回路を安定な細胞株に導入するための細胞工学(例えば、Flp-FRT組換え);3)LPAなどの光ベースのプラットフォームによる操作された細胞の誘導;4)蛍光顕微鏡による光誘導アッセイの初期?...

他の工学分野と同様に、合成生物学はプロトコルを標準化し、再現性の高い機能を持つツールを生物学的システムに関連する質問の探求に利用できるようにすることを目指しています1,2。多くの制御システムが構築されてきた合成生物学の1つの領域は、遺伝子発現調節の領域です3,4。遺伝子発現制御は、生理学的および病理学的細胞状態におけるそれらの役割のために重要な細胞特性であるタンパク質レベルおよび変動性(ノイズまたは変動係数、CV = σ/μ、平均に対する標準偏差として測定)の両方を標的とすることができる5,6,7,8。タンパク質レベルとノイズを制御できる多くの合成システム4,9,10,11,12が設計されており、ツール間でプロトコルを標準化する機会を生み出しています。
最近出現した遺伝子ネットワークを制御できる新しいツールセットの1つは光遺伝学であり、光を使用して遺伝子発現を制御することを可能にします13,14,15,16,17。それらの化学的前任者と同様に、光遺伝学的遺伝子回路は、細菌から哺乳動物に至るまで、あらゆる細胞型に導入することができ、目的の任意の下流遺伝子の発現を可能にする18,19。しかしながら、新規な光遺伝学的ツールの急速な生成により、遺伝子回路アーキテクチャ、発現機構(例えば、プラスミドベース対ウイルス統合)、および光供給制御装置において変化する多くのシステムが出現している11、16、20、21、22、23、24、25.そのため、遺伝子回路の構築や最適化、システム利用方法(統合と一過性発現など)、誘導に用いる実験ツール、結果解析など、光遺伝学的特徴の標準化の余地が残されています。
哺乳動物細胞における光遺伝学的プロトコルの標準化を進めるために、このプロトコルは、HEK293細胞(ヒト胚性腎臓細胞株)に組み込まれた負帰還(NF)遺伝子回路を用いて哺乳動物細胞における光遺伝学的システムを工学的にエンジニアリングする実験パイプラインを例に記述している。NFは、本質的に非常に豊富であるため、標準化を実証するのに理想的なシステムです26,27,28、タンパク質レベルを調整し、ノイズを最小限に抑えることができます。要するに、NFは、リプレッサーがそれ自身の発現を十分に速く減少させることによって正確な遺伝子発現制御を可能にし、それによって定常状態から離れるあらゆる変化を制限する。定常状態は、リプレッサーを不活性化または排除するインデューサーによって変更され、各インデューサー濃度に対して新しい定常状態に達するまで、より多くのタンパク質生産を可能にすることができる。最近、遺伝子発現の広い動的応答を生成し、低ノイズを維持し、空間的遺伝子発現制御の可能性を可能にする光刺激に応答することができる、操作されたNF光遺伝学的システムが作成された11。光誘導チューナー(LITers)として知られるこれらのツールは、生細胞における遺伝子発現制御を可能にする以前のシステムに触発され4、10、29、30、およびヒト細胞株に安定して統合され、長期的な遺伝子発現制御を確実にした。
ここでは、LITerを例にとり、光応答性遺伝子回路を作成し、ライトプレート装置(LPA、光遺伝学的誘導ハードウェア)31を用いて遺伝子発現を誘導し、操作された光遺伝学的に制御可能な細胞株のカスタム光刺激に対する応答を分析するためのプロトコルを概説する。このプロトコルにより、ユーザーはLITerツールを利用して、探索したい機能遺伝子を使用することができます。また、以下に概説する方法および光遺伝学的装置を統合することによって、多様な回路アーキテクチャ(例えば、正帰還、負調節など)を有する他の光遺伝学的システムに適合させることもできる。他の合成生物学プロトコルと同様に、ここで概説するビデオ録画および光遺伝学的プロトコルは、癌生物学、胚発生、および組織分化を含むがこれらに限定されない、多様な分野の単一細胞研究に適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

哺乳動物細胞における信頼性の高い遺伝子発現制御には、使用される方法に関係なく、高いフォールド変化、低ノイズ、および決定された入力-出力伝達関数を備えたツールが必要です。この目標に向けて、哺乳類細胞におけるタンパク質レベルの時空間制御のために、光遺伝学的遺伝子発現系が過去10年間に多くの注目を集めてきた。しかし、光誘導遺伝子発現を制御する既存の回路のほとんどは、構造が異なり、プラスミドから発現され、可変光遺伝学的装置を利用するため、安定した細胞株における光遺伝学的構成要素の特性評価および標準化を検討する必要性が生じている。ここで、本研究は、事例例としてネガティブフィードバック光遺伝学回路を使用して、哺乳動物細胞における光誘導性遺伝子発現を制御するための信頼性の高い遺伝子回路構築、統合、および特性評価の実験パイプラインを提供する。また、これらのプロトコルは、光遺伝学的装置と光レジームを標準化することで、遺伝子発現ノイズやタンパク質発現の大きさなどの遺伝子回路の特徴を確実に明らかにする方法も示しています。最後に、この論文は、光遺伝学に不慣れな研究室で、そのような技術を採用したいと考えている人にとっては役に立つかもしれません。ここで説明するパイプラインは、哺乳動物細胞における他の光遺伝学的回路に適用され、哺乳動物細胞における転写、プロテオミクス、そして最終的には表現型レベルでの遺伝子発現のより信頼性が高く、詳細な特徴付けおよび制御を可能にするべきである。

この記事内の遺伝子回路アセンブリおよび安定な細胞株生成は、転写活性で単一の安定FRT部位を含む市販の改変HEK-293細胞に基づいていた(図1)。遺伝子回路は、プラスミド内にFRT部位を有するベクターに構築され、HEK−293細胞ゲノムへのFlp−FRTの統合を可能にした。このアプローチはFlp-In細胞に限定されず、FRT部位はCRISPR/Cas950などのDNA編集技術を使用?...

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Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

光応答性哺乳動物細胞を確実に制御するには、光遺伝学的方法の標準化が必要です。この目標に向けて、本研究では、ネガティブフィードバック光遺伝学遺伝子回路を用いた光誘導遺伝子発現の研究を標準化するための遺伝子回路構築、細胞工学、光遺伝学的装置操作、検証アッセイのパイプラインをケーススタディとして概説する。

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

標準化された光遺伝学的プロトコルは、操作された哺乳類細胞系における細胞特性を制御するための刺激として光を使用することに関心のあるラボ向けに設計されています。このプロトコルは、光遺伝学に精通していないラボで簡単に実装でき、操作された生物学的システムの正確な空間的時間制御のための方法を提供します。この方法は、がん生物学、システム生物学、組織分化など、時空間情報が重要な特定の研究分野で幅広く応用されています。まず、結合する遺伝子成分を選択して、単一の遺伝子回路またはプラスミドに結合する。例えば、哺乳動物DNA組み込み部位、光応答性エレメント、又は機能遺伝子が挙げられる。開始コドン、調節配列、翻訳配列などの必要なすべての特徴を組み立てて調べた後、遺伝子工学および分子クローニングソフトウェアを使用し、DNA配列に注釈を付けて保存し、後で使用するために、また参照として保存します。配列アライメントなどの組み込みの分子クローニングソフトウェア機能を使用して、プラスミド構築のためのプライマーを計算的に検証します。安定な細胞株を生成するために、遺伝子回路DNAと適切なリコンビナーゼとのリポソーム混合物を用いて、設計遺伝子回路および所望の細胞をトランスフェクトする。細胞が 80 ~ 100% コンフルエントになったら、45% 古い培地、45% の新鮮な培地、および 10% DMSO を組み合わせて細胞を凍結します。残りの細胞を滅菌チューブに移し、単一細胞選別を行い、モノクローナル細胞を96ウェルプレートに単離する。モノクローナル選別から約2~3週間後、96ウェルプレート内のウェルは病巣を有するはずである。50~60%のコンフルエンシーが達成されたら、細胞を12ウェルプレートに分割する。マイクロコントローラプログラマを使用して、組み立てられたLPA回路にファームウェアを追加します。次に、取り付けプレート、回路基板、LEDスペーサー、プレートアダプター、24ウェルプレート、プレート蓋、取り付けボルト、ウィングナット、および積層コンポーネントを使用して、組み立てられた回路基板に3Dプリント部品を結合します。光遺伝学的実験を開始するには、Tabor Lab の Web サイトで入手できる Iris ソフトウェアを使用して、LPA 用の SD カードをプログラムし、適切な光条件を調べます。次に、所望の実験アウトラインの技術反復とともに強度値を入力します。500マイクロリットルの総容量の24ウェルの黒いプレートに1ウェルあたり約75,000個の細胞を加え、次いで細胞を5%二酸化炭素で加湿されたインキュベーターに入れて、それらが2〜6時間沈降するようにする。インキュベーションの最後に組織培養フード内の細胞を移した後、プラスチック製の蓋を外し、プレートの上部に接着箔ストリップを追加して、ウェル間の光移動を最小限に抑え、ウェルの下部にあるLEDからのみ光が入るようにします。LPA の取り付けられた 3D パーツにプレートを置き、各コーナーのデバイス ネジに収まる 3D プリントされた LPA ふたでプレートを覆います。デバイスを電源に接続し、LPA デバイスのリセット ボタンを押して、更新された LPA 実験設定が適用され、細胞をインキュベートすることを確認します。インキュベーション後、組織培養フードの内部で、プレートからホイルストリップを取り出し、プレートを1〜2分間座らせて、プラスチック製の蓋に結露が形成されないようにします。次に、元のプラスチック製の蓋をプレートに戻し、適切な位相コントラストまたは蛍光顕微鏡で細胞を画像化する。誘導後24〜72時間後、続いてトリプシン処理を行い、約500マイクロリットルの各ウェルの内容物全体をセルストレーナーを備えた標識チューブに移す。次いで、適切なフローサイトメトリー装置ソフトウェアを使用して、破片および細胞凝集塊を排除するために適切なサイズおよび粒度の単一細胞を捕捉する順方向および側方散乱ゲートを作成する。ゲートがセットされたら、適切なゲートで約10,000個のセルを捕捉し、必要なセルデータの量に応じてセル数を調整し、各チューブ内の実験細胞のキャプチャを繰り返します。誘導およびトリプシン処理後、約500マイクロリットルの各ウェルの内容物全体を標識チューブに移す。細胞を400倍G.で5分間遠心分離し、上清を捨てた後、サンプルを化学ヒュームフードに移す。PBSで希釈した750〜1,000マイクロリットルの4%PFAで細胞を再懸濁し、数回ピペットを上下させて細胞凝集塊を切断する。15分間のインキュベーション後、750〜1,000マイクロリットルのPBSおよび再度ピペットを数回上下させ、次いで室温で400倍Gで5分間細胞をペレットダウンする。上清を捨てた後、サンプルを化学ヒュームフードに移動し、実証されたように750〜1,000マイクロリットルの氷冷メタノールに細胞を再懸濁し、細胞をマイナス20°Cの冷凍庫に30分間座らせる。インキュベーション後、750〜1,000マイクロリットルのPBSを数回上下にピペッティングしながら加える。次いで細胞を400倍Gで5分間遠心分離した後、上清を捨て、試料を化学ヒュームフードに移した。標識一次抗体およびピペットの100マイクロリットルまたは他の適切な希釈液で細胞を6〜8回上下に再懸濁し、次いで室温で1時間インキュベートする。次に、750〜1,000マイクロリットルのインキュベーションバッファーおよびピペット溶液を数回上下に添加し、次いで細胞を400倍G.Nextで5分間遠心分離し、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、数回上下にピペッティングすることによって凝集塊を壊す。各チューブの内容物全体を細胞ストレーナーで標識したチューブに移す。細胞を正しい波長のレーザーで適切なフローサイトメトリー機器に持って行きます。装置について光学較正を行った。取得した画像を用いて、LEDの補正値を計算し、背景信号を減算し、画素強度を推定した。変動係数は96ウェル間で最小であった。キャリブレーションソフトウェアは、場所ごとのLEDの変化を実証し、各LEDが同じ強度に正規化されるようにグレースケール調整を作成しました。遺伝子発現は、LPA上の異なる光パルス持続時間で蛍光顕微鏡を介して操作されたより軽い細胞において誘導され、細胞はブライトフィールドおよびGFP発現のために画像化された。フローサイトメトリーを用いて、細胞を異なるパルス長値で誘導し、非誘導状態からの4倍以上の変化の集団レベルで定量化された遺伝子発現の用量応答を示した。負のフィードバックは、より軽いシステムと鮮やかなまたは明るいシステムのさまざまな光強度値を比較することによって示されるように、5倍以上の遺伝子発現ノイズ低減を達成した。qPCR分析では、操作された軽量細胞が、誘導されていない状態から10倍以上の誘導を伴う用量応答性でRNAレベルを発現し、フローサイトメトリー定量と一致することが示されました。操作されたより軽い遺伝子回路は、KRASタンパク質レベルおよびリン酸化ERKレベルの増加をもたらした青色光の増加量を示した。増殖、細胞運動性、創傷治癒、増殖、または浸潤アッセイを含むいくつかの機能的アッセイが実施され得る。これらの方法は、がん生物学、組織分化、または薬剤耐性のメカニズムに関する特定の洞察を提供する可能性がある。

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Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

用中空糸バイオリアクター<em&gt;インビボ</em&gt;哺乳動物の組織培養様

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

哺乳類の細胞分裂量的共焦点反射顕微鏡を介して 3 D 行列

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

哺乳類細胞培養を均一な骨材を生産する O の形をした船で揺れ、軌道

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

注射器注射メッシュ電子安定した慢性の齧歯動物の生理

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...