Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Vi vil takke Balázsi lab for kommentarer og forslag, Dr. Karl P. Gerhardt og Dr. Jeffrey J. Tabor for å hjelpe oss med å konstruere den første LPA, og Dr. Wilfried Weber for å dele LOV2-degron plasmider. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R35 GM122561 og T32 GM008444]; Laufersenteret for fysisk og kvantitativ biologi; og et NDSEG-stipend (National Defense Science and Engineering Graduate). Støtte til åpen tilgang: NIH [R35 GM122561].
Forfatterbidrag: M.T.G. og G.B. unnfanget prosjektet. M.T.G., D.C. og L.G., utførte eksperimentene. M.T.G., D.C., L.G., og G.B. analyserte dataene og utarbeidet manuskriptet. G.B. og M.T.G. ledet prosjektet.

1. Design av genkrets
<ol><li>Velg genetiske komponenter som skal kombineres i en enkelt genkrets/plasmid (f.eks. motiver for pattedyr DNA-integrasjonssekvens, lysresponsive elementer33 eller funksjonelle gener34).</li>
	<li>Bruk programvare for genteknologi og/eller molekylær kloning, lagre DNA-sekvensene for senere bruk og referanse, kommenter hver sekvens og undersøk alle nødvendige funksjoner (f.eks.</li>
	<li>Utvikle...

Lesere av denne artikkelen kan få innsikt i trinnene som er avgjørende for å karakterisere optogenetiske genkretser (så vel som andre genuttrykkssystemer), inkludert 1) genkretsdesign, konstruksjon og validering; 2) celleteknikk for innføring av genkretser i stabile cellelinjer (f.eks. Flp-FRT-rekombinasjon); 3) induksjon av de konstruerte cellene med en lysbasert plattform som LPA; 4) innledende karakterisering av lysinduksjonsanalyser via fluorescensmikroskopi; og 5) endelig genuttrykkskarakterisering med en rekke...

I likhet med andre ingeniørdisipliner har syntetisk biologi som mål å standardisere protokoller, slik at verktøy med svært reproduserbare funksjoner kan brukes til å utforske spørsmål som er relevante for biologiske systemer1,2. Et domene i syntetisk biologi der mange kontrollsystemer er bygget er området genuttrykksregulering3,4. Genuttrykkskontroll kan målrette både proteinnivåer og variasjonsevne (støy eller variasjonskoeffisient, CV = σ/μ, målt som standardavviket over gjennomsnittet), som er avgjørende cellulære egenskaper på grunn av deres roller i fysiologiske og patologiske cellulære tilstander5,6,7,8. Mange syntetiske systemer som kan kontrollere proteinnivåer og støy4,9,10,11,12 er utviklet, noe som skaper muligheter til å standardisere protokoller på tvers av verktøy.
Et nytt sett med verktøy som kan kontrollere gennettverk som nylig har dukket opp er optogenetikk, slik at bruk av lys for å kontrollere genuttrykk13,14,15,16,17. I likhet med deres kjemiske forgjengere kan optogenetiske genkretser innføres i enhver celletype, alt fra bakterier til pattedyr, noe som tillater uttrykk for ethvert nedstrøms gen av interesse18,19. På grunn av den raske generasjonen av nye optogenetiske verktøy har det imidlertid oppstått mange systemer som varierer i genetisk kretsarkitektur, uttrykksmekanisme (f.eks. plasmidbasert kontra viral integrasjon) og lysforsyningskontrollutstyr11,16,20,21,22,23,24,25 . Derfor gir dette rom for standardisering av optogenetiske funksjoner som genkretskonstruksjon og optimalisering, metode for systemutnyttelse (f.eks. integrasjon vs. forbigående uttrykk), eksperimentelle verktøy som brukes til induksjon og analyse av resultater.
For å gjøre fremskritt med å standardisere optogenetiske protokoller i pattedyrceller, beskriver denne protokollen en eksperimentell rørledning for å konstruere optogenetiske systemer i pattedyrceller ved hjelp av en negativ feedback (NF) genkrets integrert i HEK293-celler (human embryonal nyrecellelinje) som eksempel. NF er et ideelt system for å demonstrere standardisering siden det er svært rikelig26,27,28 i naturen, slik at proteinnivåer kan justeres og støyminimering kan forekomme. Kort fortalt åpner NF for presis genuttrykkskontroll av en undertrykker som reduserer sitt eget uttrykk tilstrekkelig raskt, og begrenser dermed enhver endring bort fra en jevn tilstand. Steady state kan endres av en induser som inaktiverer eller eliminerer undertrykkeren for å muliggjøre mer proteinproduksjon til en ny steady state er nådd for hver induserkonsentrasjon. Nylig ble det opprettet et konstruert NF optogenetisk system som kan produsere en bred dynamisk respons av genuttrykk, opprettholde lav støy og reagere på lysstimuli som tillater potensialet for romlig genuttrykkskontroll11. Disse verktøyene, kjent som lys-inducible tunere (LITers), ble inspirert av tidligere systemer som tillot genuttrykkskontroll i levende celler4,10,29,30 og ble stabilt integrert i menneskelige cellelinjer for å sikre langsiktig genuttrykkskontroll.
Her, ved hjelp av LITer som eksempel, er en protokoll skissert for å skape lysresponsive genkretser, indusere genuttrykk med et lysplateapparat (LPA, en optogenetisk induksjonsmaskinvare)31, og analysere responsen til de konstruerte, optogenetisk kontrollerbare cellelinjene til tilpassede lysstimuli. Denne protokollen lar brukerne bruke LITer-verktøyene for ethvert funksjonelt gen de ønsker å utforske. Det kan også tilpasses andre optogenetiske systemer med ulike kretsarkitekturer (f.eks. positiv tilbakemelding, negativ regulering, etc.) ved å integrere metodene og optogenetisk utstyr som er skissert nedenfor. I likhet med andre syntetiske biologiprotokoller kan videoopptakene og optogenetiske protokoller som er skissert her, brukes i encellede studier på forskjellige områder, inkludert, men ikke begrenset til, kreftbiologi, embryonal utvikling og vevsdifferensiering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

Pålitelig genuttrykkskontroll i pattedyrceller krever verktøy med høy foldeendring, lav støy og bestemte input-to-output overføringsfunksjoner, uavhengig av metoden som brukes. Mot dette målet har optogenetiske genuttrykkssystemer fått mye oppmerksomhet det siste tiåret for romlig kontroll av proteinnivåer i pattedyrceller. Imidlertid varierer de fleste eksisterende kretser som kontrollerer lysindusert genuttrykk i arkitektur, uttrykkes fra plasmider, og bruker variabelt optogenetisk utstyr, noe som skaper et behov for å utforske karakterisering og standardisering av optogenetiske komponenter i stabile cellelinjer. Her gir studien en eksperimentell rørledning av pålitelig genkretskonstruksjon, integrasjon og karakterisering for å kontrollere lys-inducible genuttrykk i pattedyrceller, ved hjelp av en negativ feedback optogenetisk krets som eksempel. Protokollene illustrerer også hvordan standardisering av optogenetisk utstyr og lysregimer på en pålitelig måte kan avdekke genkretsfunksjoner som genuttrykksstøy og proteinuttrykksstørrelse. Til slutt kan dette papiret være til nytte for laboratorier som ikke er kjent med optogenetikk som ønsker å ta i bruk slik teknologi. Rørledningen som er beskrevet her, bør søke om andre optogenetiske kretser i pattedyrceller, noe som gir mer pålitelig, detaljert karakterisering og kontroll av genuttrykk ved transkripsjons-, proteomisk og til slutt fenotypisk nivå i pattedyrceller.

Genkretsmontering og stabil cellelinjegenerering i denne artikkelen var basert på kommersielle, modifiserte HEK-293-celler som inneholder et transkripsjonelt aktivt, enkeltstabilt FRT-sted (figur 1). Genkretsene ble konstruert i vektorer som hadde FRT-anlegg i plasmidet, noe som muliggjør Flp-FRT-integrasjon i HEK-293-cellegenomet. Denne tilnærmingen er ikke begrenset til Flp-In-celler, da FRT-nettsteder kan legges til hvilken som helst cellelinje av interesse hvor som helst i genomet ved...

Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Pålitelig kontroll av lysresponsive pattedyrceller krever standardisering av optogenetiske metoder. Mot dette målet skisserer denne studien en rørledning av genkretskonstruksjon, celleteknikk, optogenetisk utstyrsoperasjon og verifikasjonsanalyser for å standardisere studiet av lysindusert genuttrykk ved hjelp av en negativ-feedback optogenetisk genkrets som en casestudie.

Pålitelig prosjektering og kontroll av stabile optogenetiske genkretser i pattedyrceller

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Den standardiserte optogenetiske protokollen er designet for laboratorier som er interessert i å bruke lys som stimulans for å kontrollere cellulære egenskaper i konstruerte pattedyrcellesystemer. Denne protokollen er enkel å implementere i laboratorier ellers ukjent med optogenetikk og gir metoder for presis romlig temporal kontroll av konstruerte biologiske systemer. Denne metoden har et bredt spekter av anvendelser innen spesifikke forskningsområder der romlig informasjon kan være viktig, inkludert kreftbiologi, systembiologi og vevsdifferensiering.Til å begynne med velger du de genetiske komponentene som skal kombineres, binder seg til en enkelt genkrets eller plasmid. For eksempel pattedyr DNA-integrasjonssteder, lysresponsive elementer eller funksjonelle gener. Etter å ha samlet og undersøkt alle nødvendige funksjoner som start codons, regulatoriske eller oversatte sekvenser, bruk noen genetisk engineering og molekylær kloning programvare, kommentere og lagre DNA-sekvenser for senere bruk og som referanse.Valider primerne beregningsmessig for plasmidkonstruksjon gjennom de innebygde molekylære kloningsprogramvarefunksjonene, for eksempel sekvensjustering. For å generere en stabil cellelinje, transfekt designgenkretsene og de ønskede cellene ved hjelp av en liposomblanding av genkretsens DNA med passende rekombininase. Når cellene er 80 til 100 %sammenflettende, fryser du cellene i en blanding av 45 %gamle medier, 45 % ferske medier og 10 %DMSO.Overfør de resterende cellene til et sterilt rør og utfør encellet sortering for å isolere monoklonale celler til en 96-brønns plate. Omtrent to til tre uker etter monoklonal sortering skal brønnene innenfor 96-brønnsplaten ha foci. Når 50 til 60% samløp oppnås, del cellene i en 12-brønns plate.Legg til fastvaren i den monterte LPA-kretsen ved hjelp av en mikrokontrollerprogrammerer. Deretter kombinerer du 3D-trykte deler i det monterte kretskortet ved hjelp av monteringsplaten, kretskortet, LED-avstandsenheten, plateadapteren, en 24-brønnsplate, et platelokk, monteringsbolter, vingemuttere og stablingskomponenter. For å starte et optogenetisk eksperiment, bruk Iris-programvaren som er tilgjengelig på Tabor Lab-nettstedet for å programmere et SD-kort for LPA og utforske passende lysforhold.Deretter angir du intensitetsverdier med de tekniske replikeringene for ønsket eksperimentell disposisjon. Tilsett ca 75 000 celler per brønn i en 24-brønns svart plate i et totalt volum på 500 mikroliter, og plasser deretter cellene i en fuktet inkubator med 5% karbondioksid for å tillate dem å bosette seg i to til seks timer. Etter overføring av cellene i vevskulturhetten på slutten av inkubasjonen, fjern plastlokket og legg til en klebende foliestripe til toppen av platen for å minimere lysoverføringen mellom brønnene slik at lyset bare kan komme inn gjennom LED-en som ligger på bunnen av brønnen.Plasser platen i de monterte 3D-delene av LPA, og dekk deretter platen med det 3D-trykte LPA-lokket som passer over enhetsskruene på hvert hjørne. Koble enheten til strømkilden og trykk på tilbakestillingsknappen på LPA-enheten for å sikre at de oppdaterte LPA-eksperimentinnstillingene brukes og inkuberer cellene. Etter inkubasjon, inne i vevskulturhetten, fjern foliestripen fra platen og la platen sitte i ett til to minutter for å forhindre kondens fra å danne seg på plastlokket.Legg deretter det originale plastlokket tilbake på platen og bilde cellene med riktig fasekontrast eller fluorescensmikroskop. Etter 24 til 72 timer etter induksjon, etterfulgt av trypsinisering, overfør hele innholdet i hver brønn på ca 500 mikroliter til de merkede rørene utstyrt med cellesilen. Deretter bruker du passende programvare for strømningscytometriinstrumenter, oppretter du en fremover- og sidespredningsport for å fange enkeltcellene av riktig størrelse og granularitet for å utelukke rusk og cellulære klumper.Når porten er satt, kan du fange omtrent 10 000 celler med riktig port og justere cellenummeret avhengig av mengden cellulære data som kreves og gjenta å fange eksperimentelle celler i hvert rør. Etter induksjon og trypsinisering, overfør hele innholdet i hver brønn på ca 500 mikroliter til de merkede rørene. Sentrifuger cellene i fem minutter ved 400 ganger G.Etter å ha kastet supernatanten, flytt prøvene til en kjemisk avtrekkshette.Resuspend cellene i 750 til 1000 mikroliter av 4% PFA fortynnet i PBS og pipette opp og ned flere ganger for å bryte celleklumper. Etter 15 minutter med inkubasjon, tilsett 750 til 1000 mikroliter PBS og rør igjen opp og ned flere ganger, og pellet deretter ned cellene i fem minutter ved 400 ganger G ved romtemperatur. Etter å ha kastet supernatanten, flytt prøvene til en kjemisk avtrekkshette og resuspend cellene i 750 til 1000 mikroliter iskald metanol som demonstrert og la cellene sitte i 30 minutter i en minus 20 grader Celsius fryser.Etter inkubasjonen legger du til 750 til 1000 mikroliter PBS mens du pipetter opp og ned flere ganger. Deretter etter sentrifugering av cellene i fem minutter ved 400 ganger G, kast supernatanten og flytt prøvene til en kjemisk avtrekkshette. Resuspend cellene i 100 mikroliter eller annen egnet fortynning av merket primær antistoff og pipette opp og ned seks til åtte ganger, deretter inkubere i en time ved romtemperatur.Deretter legger du til 750 til 1000 mikroliter av inkubasjonsbufferen og pipetteløsningen opp og ned flere ganger, deretter sentrifugerer cellene i fem minutter ved 400 ganger G.Next, resuspend cellene i 500 mikroliter PBS og bryte klumpene ved å pipettere opp og ned flere ganger. Overfør hele innholdet i hvert rør til merkede rør med cellesiler. Ta cellene til passende strømningscytometriinstrumenter med lasere av de riktige bølgelengdene.Den optiske kalibreringen ble utført for enhetene. Ved hjelp av det oppkjøpte bildet ble kompensasjonsverdier for LED beregnet, bakgrunnssignal ble trukket fra og pikselintensitet ble utledet. Variasjonskoeffisienten var minimal mellom 96 brønner.Kalibreringsprogramvaren demonstrerte LED-variasjonen etter sted og opprettet en gråskalajustering slik at hver LED normaliseres til samme intensitet. Genuttrykk ble indusert i konstruerte lettere celler via fluorescensmikroskopi ved forskjellige lyspulsvarigheter på LPA og cellene ble avbildet for Brightfield og GFP-uttrykk. Ved hjelp av strømningscytometri ble cellene indusert ved forskjellige pulslengdeverdier og viste en doserespons av genuttrykk kvantifisert på populasjonsnivå på over firedoblet endring fra uinduserte tilstander.Den negative tilbakemeldingen oppnådde over femdoblet støyreduksjon av genuttrykk som vist ved å sammenligne ulike lysintensitetsverdier for det lettere systemet kontra levende eller lys på. QPCR-analysen viste at de konstruerte lettere cellene uttrykte RNA-nivåer på en doseresponsiv måte med over ti ganger induksjon fra uinduserte tilstander, som matchet strømningscytometri-kvantifiseringen. Den konstruerte lettere genkretsen viste økende mengder blått lys som resulterte i økte KRAS-proteinnivåer og fosforierte ERK-nivåer.Flere funksjonelle analyser kan utføres, inkludert vekst, cellemotilitet, sårheling, spredning eller invasjonsanalyser. Disse metodene kan gi spesifikk innsikt i mekanismene for kreftbiologi, vevsdifferensiering eller legemiddelresistens.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Uttak for Målrettet Stabil isotopfortynning Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingeniør 3D Cellularized Kollagen Geleer til Vaskulær Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreaktorer for<em&gt; I Vivo</em&gt; -lignende Pattedyr Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering av en automatisert Illuminating, dyrking, og Sampling System for Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting for utvikling Stangeriaceae vev og Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Pattedyr celledeling i 3D matriser via kvantitative AC Confocal refleksjon mikroskopi

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrking pattedyrceller i tredimensjonale peptid stillaser

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital risting kultur pattedyrceller i O-formet fartøy å produsere Uniform aggregater

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Sprøyte-injectable Mesh elektronikk for stabil kronisk gnager elektrofysiologi

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...