Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer ao laboratório balázsi por comentários e sugestões, Dr. Karl P. Gerhardt e Dr. Jeffrey J. Tabor por nos ajudar a construir o primeiro LPA, e Dr. Wilfried Weber por compartilhar os plasmídeos lov2-degron. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [R35 GM122561 e T32 GM00844]; O Centro Laufer de Biologia Física e Quantitativa; e uma Bolsa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Defesa Nacional (NDSEG). Financiamento para cobrança de acesso aberto: NIH [R35 GM122561].
Contribuições autorais: M.T.G. e G.B. concebeu o projeto. M.T.G., D.C., e L.G., realizaram os experimentos. M.T.G., D.C., L.G., e G.B. analisaram os dados e prepararam o manuscrito. G.B. e M.T.G. supervisionaram o projeto.

1. Design do circuito genético
<ol><li>Selecione componentes genéticos para combinar em um único circuito genético/plasmídeo (por exemplo, motivos de sequência de integração de DNA de mamíferos32, elementos responsivos à luz33 ou genes funcionais34).</li>
	<li>Usando qualquer software de engenharia genética e/ou clonagem molecular, armazene as sequências de DNA para uso e referência posteriores, anote cada sequência e examine todas as...

Os leitores deste artigo podem obter insights sobre os passos vitais para caracterizar circuitos genéticos optogenéticos (bem como outros sistemas de expressão genética), incluindo 1) projeto de circuito genético, construção e validação; 2) engenharia celular para a introdução de circuitos genéticos em linhas celulares estáveis (por exemplo, recombinação Flp-FRT); 3) indução das células projetadas com uma plataforma baseada em luz, como a LPA; 4) caracterização inicial de ensaios de indução de luz v...

Semelhante a outras disciplinas de engenharia, a biologia sintética visa padronizar protocolos, permitindo que ferramentas com funções altamente reprodutíveis sejam utilizadas para explorar questões relevantes para sistemas biológicos1,2. Um domínio em biologia sintética onde muitos sistemas de controle foram construídos é a área de regulação da expressão genética3,4. O controle da expressão genética pode atingir tanto os níveis de proteína quanto a variabilidade (ruído ou coeficiente de variação, CV = σ/μ, medido como o desvio padrão sobre a média), que são características celulares cruciais devido aos seus papéis em estados celulares fisiológicos e patológicos5,6,7,8. Muitos sistemas sintéticos que podem controlar níveis de proteína e ruídos4,9,10,11,12 foram projetados, criando oportunidades para padronizar protocolos entre ferramentas.
Um novo conjunto de ferramentas que podem controlar redes genéticas que surgiram recentemente é a optogenética, permitindo o uso da luz para controlar a expressão genética13,14,15,16,17. Semelhante aos seus antecessores químicos, circuitos genéticos optogenéticos podem ser introduzidos em qualquer tipo de célula, desde bactérias até mamíferos, permitindo a expressão de qualquer gene a jusante de interesse18,19. No entanto, devido à rápida geração de novas ferramentas optogenéticas, muitos sistemas surgiram que variam na arquitetura do circuito genético, mecanismo de expressão (por exemplo, integração plasmida versus viral) e equipamentos de controle de fornecimento de luz11,16,20,21,22,23,24,25 . Portanto, isso abre espaço para a padronização de características optogenéticas, como construção e otimização de circuitos genéticos, método de utilização do sistema (por exemplo, integração versus expressão transitória), ferramentas experimentais utilizadas para indução e análise de resultados.
Para progredir na padronização dos protocolos optogenéticos em células de mamíferos, este protocolo descreve um pipeline experimental para projetar sistemas optogenéticos em células mamíferas usando um circuito genético de feedback negativo (NF) integrado às células HEK293 (linha de células renais embrionárias humanas) como exemplo. A NF é um sistema ideal para demonstrar padronização, uma vez que é altamente abundante 26,27,28 na natureza, permitindo que os níveis de proteína sejam ajustados e a minimização do ruído ocorra. Resumindo, a NF permite um controle preciso da expressão genética por um repressor reduzindo sua própria expressão suficientemente rápida, limitando assim qualquer mudança longe de um estado estável. O estado estável pode ser alterado por um indutor que inativa ou elimina o repressor para permitir mais produção de proteínas até que um novo estado estável seja alcançado para cada concentração indutora. Recentemente, foi criado um sistema optogenético NF projetado que pode produzir uma resposta dinâmica ampla da expressão genética, manter o baixo ruído e responder a estímulos de luz permitindo o potencial de controle de expressão genética espacial11. Essas ferramentas, conhecidas como sintonizadores indutíveis por luz (LITers), foram inspiradas por sistemas anteriores que permitiram o controle da expressão genética em células vivas4,10,29,30 e foram firmemente integradas em linhas celulares humanas para garantir o controle da expressão genética a longo prazo.
Aqui, usando o LITer como exemplo, um protocolo é delineado para a criação de circuitos genéticos responsivos à luz, induzindo a expressão genética com um aparelho de placa de luz (LPA, um hardware de indução optogenética)31, e analisar respostas das linhas celulares projetadas e optogeneticamente controláveis para estímulos de luz personalizados. Este protocolo permite que os usuários utilizem as ferramentas LITer para qualquer gene funcional que desejam explorar. Também pode ser adaptado para outros sistemas optogenéticos com diversas arquiteturas de circuito (por exemplo, feedback positivo, regulação negativa, etc.) através da integração dos métodos e equipamentos optogenéticos descritos abaixo. Semelhante a outros protocolos de biologia sintética, as gravações de vídeo e protocolos optogenéticos aqui descritos podem ser aplicados em estudos unicelulares em diversas áreas, incluindo, mas não se limitando à biologia do câncer, desenvolvimento embrionário e diferenciação de tecidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

O controle confiável da expressão genética em células de mamíferos requer ferramentas com variação de dobra alta, baixo ruído e funções determinadas de transferência de entrada para saída, independentemente do método utilizado. Nesse sentido, os sistemas de expressão genética optogenética ganharam muita atenção na última década para o controle espacial dos níveis de proteínas em células de mamíferos. No entanto, a maioria dos circuitos existentes que controlam a expressão genética induzida pela luz variam na arquitetura, são expressos a partir de plasmídeos e utilizam equipamentos optogenéticos variáveis, criando a necessidade de explorar a caracterização e a padronização de componentes optogenéticos em linhas de células estáveis. Aqui, o estudo fornece um pipeline experimental de construção, integração e caracterização de circuitos genéticos confiáveis para controlar a expressão genética indutível de luz em células de mamíferos, usando um circuito optogenético de feedback negativo como exemplo de caso. Os protocolos também ilustram como a padronização de equipamentos optogenéticos e regimes de luz podem revelar de forma confiável características do circuito genético, como ruído de expressão genética e magnitude da expressão proteica. Por fim, este artigo pode ser útil para laboratórios não familiarizados com optogenéticas que desejam adotar tal tecnologia. O oleoduto descrito aqui deve se aplicar a outros circuitos optogenéticos em células de mamíferos, permitindo uma caracterização mais confiável e detalhada da expressão genética no nível transcricional, proteômico e, finalmente, fenotípico em células mamíferas.

O conjunto do circuito genético e a geração de linhas de células estáveis neste artigo foram baseados em células HEK-293 comerciais e modificadas contendo um local FRT ativo transcricionalmente e único estável (Figura 1). Os circuitos genéticos foram construídos em vetores que tinham locais FRT dentro do plasmídeo, permitindo a integração Flp-FRT no genoma celular HEK-293. Essa abordagem não se limita às células Flp-In, pois os sites FRT podem ser adicionados a qualquer linha...

Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

O controle confiável das células mamíferas responsivas à luz requer a padronização dos métodos optogenéticos. Em direção a esse objetivo, este estudo descreve um pipeline de construção de circuitos genéticos, engenharia celular, operação de equipamentos optogenéticos e ensaios de verificação para padronizar o estudo da expressão genética induzida pela luz usando um circuito genético optogenético de feedback negativo como estudo de caso.

Engenharia confiável e controle de circuitos genéticos estáveis em células mamíferas

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

O protocolo optogenético padronizado é projetado para laboratórios interessados em usar a luz como estímulo para controlar propriedades celulares em sistemas de células de mamíferos projetados. Este protocolo é fácil de implementar em laboratórios de outra forma não familiarizados com a optogenética e fornece métodos para controle temporal espacial preciso de sistemas biológicos projetados. Este método tem uma ampla gama de aplicação em áreas específicas de pesquisa onde informações espáteis podem ser importantes, incluindo biologia do câncer, biologia de sistemas e diferenciação de tecidos.Para começar, selecione os componentes genéticos para combinar a ligação em um único circuito genético ou plasmídeo. Por exemplo, locais de integração de DNA de mamíferos, elementos responsivos à luz ou genes funcionais. Depois de montar e examinar todas as características necessárias, como códons inicisos, sequências regulatórias ou traduzidas, use qualquer software de engenharia genética e clonagem molecular, anote e armazene as sequências de DNA para uso posterior e como referência.Valide os primers computacionalmente para construção plasmid através dos recursos de software de clonagem molecular incorporado, por exemplo, alinhamento de sequência. Para gerar uma linha celular estável, transfem os circuitos genéticos de design e as células desejadas usando uma mistura lipossa do DNA do circuito genético com recombinase apropriada. Depois que as células forem 80 a 100% confluentes, congele as células em uma mistura de mídia 45% antiga, mídia 45% fresca e 10% DMSO.Transfira as células restantes para um tubo estéril e realize uma triagem unicelular para isolar células monoclonais em uma placa de 96 poços. Cerca de duas a três semanas após a classificação monoclonal, os poços dentro da placa de 96 poços devem ter focos. Quando 50 a 60% de confluência for alcançada, divida as células em uma placa de 12 poços.Adicione o firmware ao circuito LPA montado usando um programador de microcontrolador. Em seguida, misture peças impressas em 3D na placa de circuito montada usando a placa de montagem, a placa de circuito, o espaçador led, o adaptador de placa, uma placa de 24 poços, uma tampa de placa, parafusos de montagem, porcas de asa e componentes de empilhamento. Para iniciar um experimento optogenético, use o software Iris disponível no site do Tabor Lab para programar um cartão SD para o LPA e explorar condições de luz apropriadas.Em seguida, insira valores de intensidade com as réplicas técnicas para o contorno experimental desejado. Adicione cerca de 75.000 células por poço em uma placa preta de 24 poços em um volume total de 500 microliters, em seguida, coloque as células em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono para permitir que elas se contentem por duas a seis horas. Depois de transferir as células da capa de cultura tecidual no final da incubação, remova a tampa plástica e adicione uma tira de papel alumínio adesiva ao topo da placa para minimizar a transferência de luz entre os poços para que a luz só possa entrar através do LED localizado na parte inferior do poço.Coloque a placa nas partes 3D instaladas do LPA e cubra a placa com a tampa LPA impressa em 3D que se encaixa sobre os parafusos do dispositivo em cada canto. Conecte o dispositivo à fonte de alimentação e pressione o botão de reset no dispositivo LPA para garantir que as configurações atualizadas do experimento LPA sejam aplicadas e incubar as células. Após a incubação, dentro da capa de cultura tecidual, retire a tira de papel alumínio da placa e deixe a placa sentar por um a dois minutos para evitar que a condensação se forme na tampa plástica.Em seguida, coloque a tampa de plástico original de volta na placa e imagem das células com o contraste de fase apropriado ou microscópio de fluorescência. Após 24 a 72 horas após a indução, seguido de experimentação, transfira todo o conteúdo de cada poço de cerca de 500 microliters para os tubos rotulados equipados com o coador de células. Em seguida, usando o software de instrumento de citometria de fluxo apropriado, crie um portão de dispersão para frente e lateral para capturar as células únicas do tamanho e granularidade apropriadas para excluir detritos e aglomerados celulares.Uma vez que o portão esteja definido, capture aproximadamente 10.000 células com o portão apropriado e ajuste o número da célula dependendo da quantidade de dados celulares necessários e repita a captura de células experimentais em cada tubo. Após a indução e a trippsinização, transfira todo o conteúdo de cada poço de cerca de 500 microliters para os tubos rotulados. Centrifugar as células por cinco minutos a 400 vezes G.Depois de descartar o supernante, mova as amostras para um capô de fumaça química.Resuspense as células em 750 a 1.000 microlitres de 4%PFA diluídos em PBS e pipeta para cima e para baixo várias vezes para quebrar os aglomerados celulares. Após 15 minutos de incubação, adicione 750 a 1.000 microliters de PBS e novamente pipeta para cima e para baixo várias vezes, em seguida, pelota para baixo as células por cinco minutos a 400 vezes G à temperatura ambiente. Depois de descartar o supernante, mova as amostras para um capô de fumaça química e resuspenque as células em 750 a 1.000 microliters de metanol gelado como demonstrado e permita que as células se sentem por 30 minutos em um congelador de menos 20 graus Celsius.Após a incubação, adicione 750 a 1.000 microliters de PBS enquanto estiver subindo e descendo várias vezes. Em seguida, depois de centrifugar as células por cinco minutos a 400 vezes G, descarte o supernante e mova as amostras para um capô de fumaça química. Resuspenja as células em 100 microliters ou outra diluição adequada de anticorpo primário rotulado e pipeta para cima e para baixo seis a oito vezes, em seguida, incubar por uma hora em temperatura ambiente.Em seguida, adicione 750 a 1.000 microliters da solução de tampão de incubação e pipeta para cima e para baixo várias vezes, em seguida, centrifugar as células por cinco minutos a 400 vezes G.Next, resuspend as células em 500 microliters de PBS e quebrar os aglomerados por tubos para cima e para baixo várias vezes. Transfira todo o conteúdo de cada tubo para tubos rotulados com filtros de células. Leve as células para instrumentos de citometria de fluxo apropriados com lasers dos comprimentos de onda corretos.A calibração óptica foi realizada para os dispositivos. Utilizando a imagem adquirida, foram calculados valores de compensação para LED, o sinal de fundo foi subtraído e a intensidade dos pixels foi deduzida. O coeficiente de variação foi mínimo entre 96 poços.O software de calibração demonstrou a variação do LED por localização e criou um ajuste de escala cinza para que cada LED seja normalizado com a mesma intensidade. A expressão genética foi induzida em células mais leves projetadas através de microscopia de fluorescência em diferentes durações de pulso de luz no LPA e as células foram imagens para expressão Brightfield e GFP. Usando citometria de fluxo, as células foram induzidas em diferentes valores de comprimento do pulso e mostraram uma resposta de dose da expressão genética quantificada ao nível populacional de mais de quatro vezes a mudança de estados não induzidos.O feedback negativo alcançou mais de cinco vezes a redução de ruído de expressão genética, como mostrado, comparando vários valores de intensidade de luz para o sistema mais leve versus vívido ou leve ligado. A análise qPCR mostrou que as células mais leves projetadas expressavam níveis de RNA de forma responsiva com indução de mais de dez vezes de estados não induzidos, correspondendo à quantificação da citometria de fluxo. O circuito genético mais leve projetado mostrou quantidades crescentes de luz azul que resultaram no aumento dos níveis de proteína KRAS e níveis de ERK fosforilatos.Vários ensaios funcionais podem ser realizados, incluindo crescimento, motilidade celular, cicatrização de feridas, proliferação ou ensaios de invasão. Esses métodos poderiam fornecer insights específicos sobre os mecanismos de biologia do câncer, diferenciação tecidual ou resistência a medicamentos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Bioengenharia

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Biorreactores de fibras ocas para<em&gt; In Vivo</em&gt; -como Cultura tecidos de mamíferos

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Divisão celular dos mamíferos em matrizes 3D através de microscopia de reflexão Confocal quantitativa

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Um Orbital agitando a cultura de células de mamíferos em vasos em forma do produzir agregados uniformes

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia roedor crônica estável

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...