Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Балажи за комментарии и предложения, доктора Карла. Герхардта и доктора Джеффри Табора за помощь в создании первого LPA и доктора Вильфрида Вебера за то, что они поделились плазмидами LOV2-дегрона. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R35 GM122561 и T32 GM008444]; Центр физической и количественной биологии Лауфера; и стипендия для выпускников национальной оборонной науки и техники (NDSEG). Финансирование платы за открытый доступ: NIH [R35 GM122561].
Авторский вклад: M.T.G. и G.B. задумали проект. М.Т.Г., Д.C. и Л.Г. проводили эксперименты. M.T.G., D.C., L.G. и G.B. проанализировали данные и подготовили рукопись. Г.B. и М.Т.Г. руководили проектом.

1. Проектирование генных схем
<ol><li>Выберите генетические компоненты для объединения в одну генную цепь/плазмиду (например, мотивы последовательности интеграции ДНК млекопитающих32, светочувствительные элементы33 или функциональные гены34).</li>
	<li>И...

Читатели этой статьи могут получить представление о шагах, жизненно важных для характеристики оптогенетических генных цепей (а также других систем экспрессии генов), включая 1) проектирование, построение и валидацию генных схем; 2) клеточная инженерия для введения генных цепей в стабил?...

Подобно другим инженерным дисциплинам, синтетическая биология направлена на стандартизацию протоколов, позволяя использовать инструменты с высоковоспроизводимыми функциями для изучения вопросов, относящихся к биологическим системам1,2. Одной из областей в синтетической биологии, где было построено много систем управления, является область регуляции экспрессии генов3,4. Контроль экспрессии генов может быть нацелен как на уровни белка, так и на изменчивость (шум или коэффициент вариации, CV = σ/μ, измеренный как стандартное отклонение от среднего), которые являются важнейшими клеточными характеристиками из-за их роли в физиологических и патологических клеточных состояниях5,6,7,8. Многие синтетические системы, которые могут контролировать уровень белка и шум4,9,10,11,12, были разработаны, создавая возможности для стандартизации протоколов между инструментами.
Одним из новых инструментов, которые могут контролировать генные сети, которые недавно появились, является оптогенетика, позволяющая использовать свет для контроля экспрессии генов13,14,15,16,17. Подобно своим химическим предшественникам, оптогенетические генные цепи могут быть введены в любой тип клеток, начиная от бактерий и заканчивая млекопитающими, что позволяет экспрессировать любой интересующий ген18,19. Однако из-за быстрого создания новых оптогенетических инструментов появилось много систем, которые различаются по архитектуре генетических схем, механизму экспрессии (например, плазмидная и вирусная интеграция) и светоснабжающему контрольному оборудованию11,16,20,21,22,23,24,25 . Таким образом, это оставляет место для стандартизации оптогенетических особенностей, таких как построение и оптимизация генной цепи, метод использования системы (например, интеграция против переходной экспрессии), экспериментальные инструменты, используемые для индукции, и анализ результатов.
Чтобы добиться прогресса в стандартизации оптогенетических протоколов в клетках млекопитающих, этот протокол описывает экспериментальный конвейер для разработки оптогенетических систем в клетках млекопитающих с использованием генной схемы отрицательной обратной связи (NF), интегрированной в клетки HEK293 (клеточная линия эмбриональной почки человека) в качестве примера. NF является идеальной системой для демонстрации стандартизации, поскольку она очень распространена в природе26,27,28, что позволяет настраивать уровни белка и минимизировать шум. Короче говоря, NF позволяет точно контролировать экспрессию генов с помощью репрессора, уменьшая свою собственную экспрессию достаточно быстро, тем самым ограничивая любое изменение от устойчивого состояния. Устойчивое состояние может быть изменено индуктором, который инактивирует или устраняет репрессор, чтобы обеспечить большую выработку белка до тех пор, пока не будет достигнуто новое устойчивое состояние для каждой концентрации индуктора. Недавно была создана спроектированная оптогенетическая система NF, которая может производить широкодинамический ответ экспрессии генов, поддерживать низкий уровень шума и реагировать на световые стимулы, что позволяет контролировать пространственную экспрессию генов11. Эти инструменты, известные как светоиндуцируемые тюнеры (LITers), были вдохновлены более ранними системами, которые позволяли контролировать экспрессию генов в живых клетках4,10,29,30 и были стабильно интегрированы в клеточные линии человека для обеспечения долгосрочного контроля экспрессии генов.
Здесь, используя LITer в качестве примера, описан протокол для создания светочувствительных генных цепей, индуцирующих экспрессию генов с помощью light Plate Apparatus (LPA, оптогенетическое индукционное оборудование)31, и анализа реакций инженерных, оптогенетически контролируемых клеточных линий на пользовательские световые стимулы. Этот протокол позволяет пользователям использовать инструменты LITer для любого функционального гена, который они хотят исследовать. Он также может быть адаптирован для других оптогенетических систем с различными схемными архитектурами (например, положительная обратная связь, отрицательное регулирование и т. Д.) Путем интеграции методов и оптогенетического оборудования, описанных ниже. Подобно другим протоколам синтетической биологии, видеозаписи и оптогенетические протоколы, изложенные здесь, могут применяться в одноклеточных исследованиях в различных областях, включая, но не ограничиваясь биологией рака, эмбриональным развитием и дифференцировкой тканей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

Надежный контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих требует инструментов с высоким изменением складки, низким уровнем шума и определенными функциями передачи ввода-вывода, независимо от используемого метода. Для достижения этой цели оптогенетические системы экспрессии генов за последнее десятилетие привлекли большое внимание для пространственно-височного контроля уровня белка в клетках млекопитающих. Однако большинство существующих схем, контролирующих экспрессию генов, индуцированных светом, различаются по архитектуре, экспрессируются из плазмид и используют переменное оптогенетическое оборудование, что создает необходимость изучения характеристик и стандартизации оптогенетических компонентов в стабильных клеточных линиях. Здесь исследование предоставляет экспериментальный конвейер надежного построения генной цепи, интеграции и характеристики для контроля экспрессии генов, индуцируемой светом, в клетках млекопитающих, используя в качестве примера оптогенетическую схему с отрицательной обратной связью. Протоколы также иллюстрируют, как стандартизация оптогенетического оборудования и режимов освещения может надежно выявить особенности генной цепи, такие как шум экспрессии генов и величина экспрессии белка. Наконец, эта статья может быть полезна для лабораторий, незнакомых с оптогенетикой, которые хотят принять такую технологию. Описанный здесь конвейер должен применяться к другим оптогенетическим схемам в клетках млекопитающих, что позволяет более надежно, подробно характеризовать и контролировать экспрессию генов на транскрипционном, протеомном и, в конечном счете, фенотипическом уровне в клетках млекопитающих.

Сборка генной цепи и генерация стабильной клеточной линии в рамках этой статьи были основаны на коммерческих, модифицированных клетках HEK-293, содержащих транскрипционно активный, один стабильный сайт FRT (рисунок 1). Генные цепи были построены в векторы, которые имели учас...

Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Надежное управление светочувствительными клетками млекопитающих требует стандартизации оптогенетических методов. Для достижения этой цели в этом исследовании излагается конвейер построения генной цепи, клеточной инженерии, работы оптогенетического оборудования и проверочных анализов для стандартизации изучения экспрессии генов, индуцированной светом, с использованием оптогенетической генной схемы с отрицательной обратной связью в качестве тематического исследования.

Надежное проектирование и управление стабильными оптогенетическими генными цепями в клетках млекопитающих

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Стандартизированный оптогенетический протокол предназначен для лабораторий, заинтересованных в использовании света в качестве стимула для управления клеточными свойствами в инженерных клеточных системах млекопитающих. Этот протокол легко реализовать в лабораториях, незнакомых с оптогенетикой, и предоставляет методы точного пространственного временного управления инженерными биологическими системами. Этот метод имеет широкий спектр применения в конкретных областях исследований, где пространственно-временная информация может быть важна, включая биологию рака, системную биологию и дифференцировку тканей.Для начала выберите генетические компоненты для объединения связывания в одну генную цепь или плазмиду. Например, сайты интеграции ДНК млекопитающих, светочувствительные элементы или функциональные гены. После сборки и изучения всех необходимых функций, таких как стартовые кодоны, регуляторные или переведенные последовательности, используйте любое программное обеспечение для генной инженерии и молекулярного клонирования, аннотируйте и храните последовательности ДНК для последующего использования и в качестве ссылки.Проверяйте праймеры вычислительно для построения плазмид с помощью встроенных функций программного обеспечения молекулярного клонирования, например, выравнивания последовательностей. Чтобы генерировать стабильную клеточную линию, трансфектируйте проектные генные цепи и желаемые клетки, используя липосомную смесь ДНК генной цепи с соответствующей рекомбиназой. После того, как клетки станут сливающимися на 80-100%, заморозьте клетки в смеси 45% старой среды, 45% свежей среды и 10% DMSO.Перенесите оставшиеся клетки в стерильную трубку и выполните одноклеточную сортировку для выделения моноклональных клеток в 96-луночную пластину. Примерно через две-три недели после моноклональной сортировки скважины в пределах 96-луночной плиты должны иметь очаги. Когда достигается слияние от 50 до 60%, разделите ячейки на 12-луночную пластину.Добавьте прошивку в собранную схему LPA с помощью программы микроконтроллера. Затем объедините 3D-печатные детали в собранной печатной плате с помощью монтажной пластины, печатной платы, светодиодной прокладки, адаптера пластины, 24-луночной пластины, крышки пластины, крепежных болтов, гаек крыла и компонентов штабелирования. Чтобы начать оптогенетический эксперимент, используйте программное обеспечение Iris, доступное на веб-сайте Tabor Lab, чтобы запрограммировать SD-карту для LPA и изучить соответствующие условия освещения.Затем введите значения интенсивности с техническими репликами для желаемого экспериментального контура. Добавьте около 75 000 клеток на лунку в 24-луночную черную пластину общим объемом 500 микролитров, затем поместите клетки в увлажненный инкубатор с 5% углекислым газом, чтобы они осели в течение двух-шести часов. После переноса клеток в вытяжку культуры тканей в конце инкубации снимите пластиковую крышку и добавьте полоску клейкой фольги в верхнюю часть пластины для минимизации передачи света между лунками, чтобы свет мог проникать только через светодиод, расположенный в нижней части колодца.Поместите пластину в установленные 3D-части LPA, затем накройте пластину 3D-печатной крышкой LPA, которая прилегает к винтам устройства на каждом углу. Подключите устройство к источнику питания и нажмите кнопку сброса на устройстве LPA, чтобы убедиться, что обновленные настройки эксперимента LPA применены и инкубируют клетки. После инкубации внутри вытяжки для культивирования тканей снимите полоску фольги с пластины и дайте пластине постоять в течение одной-двух минут, чтобы предотвратить образование конденсата на пластиковой крышке.Затем положите оригинальную пластиковую крышку обратно на пластину и визуализируйте клетки с помощью соответствующего фазового контраста или флуоресцентного микроскопа. Через 24-72 часа после индукции, с последующей трипсинизацией, перенесут все содержимое каждой лунки примерно на 500 микролитров в меченые трубки, оснащенные клеточным сетчатым фильтром. Затем, используя соответствующее программное обеспечение прибора для проточной цитометрии, создайте прямой и боковой затвор рассеяния для захвата отдельных клеток соответствующего размера и зернистости, чтобы исключить мусор и клеточные сгустки.Как только затвор установлен, захватите приблизительно 10 000 ячеек с соответствующим затвором и отрегулируйте номер ячейки в зависимости от количества требуемых сотовых данных и повторите захват экспериментальных клеток в каждой трубке. После индукции и трипсинизации перенесите все содержимое каждой лунки около 500 микролитров в меченые пробирки. Центрифугируйте клетки в течение пяти минут в 400 раз больше G. После выброса супернатанта переместите образцы в химический дымовой капюшон.Повторное суспендирование клеток в 750-1000 микролитров 4% PFA, разбавленных в PBS и пипетке вверх и вниз несколько раз, чтобы сломать сгустки клеток. После 15 минут инкубации добавьте от 750 до 1000 микролитров PBS и снова несколько раз пипетку вверх и вниз, затем гранулируйте клетки в течение пяти минут при 400 раз G при комнатной температуре. После выброса супернатанта переместите образцы в химический вытяжной капюшон и повторно суспендируйте клетки в 750-1000 микролитрах ледяного холодного метанола, как показано на рисунке, и позвольте клеткам сидеть в течение 30 минут в морозильной камере с температурой минус 20 градусов по Цельсию.После инкубации добавьте от 750 до 1000 микролитров PBS, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Затем, после центрифугирования клеток в течение пяти минут при 400 G, выбросьте супернатант и переместите образцы в химический дымовой капюшон. Повторно суспендируют клетки в 100 микролитрах или другом подходящем разведении меченого первичного антитела и пипетки вверх и вниз шесть-восемь раз, затем инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре.Затем добавляют от 750 до 1000 микролитров инкубационного буфера и раствора пипетки вверх и вниз несколько раз, затем центрифугируют клетки в течение пяти минут в 400 раз G. Далее повторно суспендируют клетки в 500 микролитрах PBS и разбивают сгустки, пипетируя вверх и вниз несколько раз. Перенесите все содержимое каждой трубки в меченые трубки с клеточными сетчатыми фильтрами. Подведите клетки к соответствующим приборам проточной цитометрии с помощью лазеров правильных длин волн.Для приборов была выполнена оптическая калибровка. С помощью полученного изображения рассчитывались значения компенсации для светодиода, вычитался фоновый сигнал и выводилась интенсивность пикселей. Коэффициент вариации был минимальным между 96 скважинами.Программное обеспечение для калибровки продемонстрировало изменение светодиодов в зависимости от местоположения и создало регулировку шкалы серого, чтобы каждый светодиод был нормализован с одинаковой интенсивностью. Экспрессия генов была индуцирована в инженерных более легких клетках с помощью флуоресцентной микроскопии при различной длительности светового импульса на LPA, и клетки были визуализированы для экспрессии Brightfield и GFP. Используя проточную цитометрию, клетки были индуцированы при разных значениях длины импульса и показали дозовый ответ экспрессии генов, количественно выраженный на уровне популяции более чем четырехкратного изменения от неиндуцированных состояний.Отрицательная обратная связь достигалась более чем пятикратного снижения шума экспрессии генов, как показано путем сравнения различных значений интенсивности света для более легкой системы с яркой или включенной. Анализ qPCR показал, что сконструированные более легкие клетки экспрессировали уровни РНК в дозочувствительной манере с более чем десятикратной индукцией из неиндукционных состояний, что соответствовало количественной оценке проточной цитометрии. Спроектированная более легкая генная схема показала увеличение количества синего света, что привело к повышению уровня белка KRAS и уровня фосфорилированного ERK.Может быть выполнено несколько функциональных анализов, включая анализы роста, подвижности клеток, заживления ран, пролиферации или инвазии. Эти методы могут дать конкретное представление о механизмах биологии рака, дифференцировки тканей или лекарственной устойчивости.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Сотовая Добыча липидов для целевой Стабильный изотопного разбавления жидкостной хроматографии-масс-спектрометрического анализа

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Инженерные 3D Cellularized Коллаген Гели для сосудистой регенерации ткани

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Полое волокно биореакторов для<em&gt; В Vivo</em&gt; -как Млекопитающим культуры ткани

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Разработка и внедрение автоматизированной освещая, культивированием и система отбора проб для микробного оптогенетика приложений

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic подложке для инженерных васкуляризированной ткани и Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

У млекопитающих деление клеток в 3D матрицы через количественного отражения конфокальная микроскопия

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Культивирование клеток млекопитающих в трехмерной пептид подмости

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Орбиталь, пожимая культуры Mammalian клеток в O-образный судов для получения единообразных агрегатов

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Шприц инъекционные сетки электроники для стабильной хронической грызунов электрофизиологии

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...