Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Nos gustaría agradecer al laboratorio Balázsi por sus comentarios y sugerencias, al Dr. Karl P. Gerhardt y al Dr. Jeffrey J. Tabor por ayudarnos a construir el primer LPA, y al Dr. Wilfried Weber por compartir los plásmidos LOV2-degron. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R35 GM122561 y T32 GM008444]; El Centro Laufer de Biología Física y Cuantitativa; y una beca de Posgrado en Ciencias e Ingeniería de Defensa Nacional (NDSEG). Financiamiento para el cargo de acceso abierto: NIH [R35 GM122561].
Contribuciones de los autores: M.T.G. y G.B. concibieron el proyecto. M.T.G., D.C. y L.G., realizaron los experimentos. M.T.G., D.C., L.G. y G.B. analizaron los datos y prepararon el manuscrito. G.B. y M.T.G. supervisaron el proyecto.

1. Diseño de circuitos genéticos
<ol><li>Seleccionar componentes genéticos para combinarlos en un solo circuito genético/plásmido (por ejemplo, motivos de secuencia de integración de ADN de mamíferos32, elementos sensibles a la luz33 o genes funcionales34).</li>
	<li>Utilizando cualquier software de ingeniería genética y/o clonación molecular, almacene las secuencias de ADN para su uso y referencia posteriores, anote cada secuencia y exam...

Los lectores de este artículo pueden obtener información sobre los pasos vitales para caracterizar los circuitos genéticos optogenéticos (así como otros sistemas de expresión génica), incluidos 1) el diseño, la construcción y la validación de circuitos genéticos; 2) ingeniería celular para introducir circuitos genéticos en líneas celulares estables (por ejemplo, recombinación Flp-FRT); 3) inducción de las células diseñadas con una plataforma basada en la luz como el LPA; 4) caracterización inicial de e...

Al igual que otras disciplinas de la ingeniería, la biología sintética tiene como objetivo estandarizar los protocolos, permitiendo utilizar herramientas con funciones altamente reproducibles para explorar cuestiones relevantes para los sistemas biológicos1,2. Un dominio de la biología sintética donde se han construido muchos sistemas de control es el área de regulación de la expresión génica3,4. El control de la expresión génica puede dirigirse tanto a los niveles de proteínas como a la variabilidad (ruido o coeficiente de variación, CV = σ/μ, medido como la desviación estándar sobre la media), que son características celulares cruciales debido a su papel en los estados celulares fisiológicos y patológicos5,6,7,8. Muchos sistemas sintéticos que pueden controlar los niveles de proteínas y el ruido4,9,10,11,12 han sido diseñados, creando oportunidades para estandarizar protocolos en todas las herramientas.
Un nuevo conjunto de herramientas que pueden controlar las redes génicas que ha surgido recientemente es la optogenética, que permite el uso de la luz para controlar la expresión génica13,14,15,16,17. Al igual que sus predecesores químicos, los circuitos genéticos optogenéticos pueden introducirse en cualquier tipo de célula, desde bacterias hasta mamíferos, permitiendo la expresión de cualquier gen de interés aguas abajo18,19. Sin embargo, debido a la rápida generación de nuevas herramientas optogenéticas, han surgido muchos sistemas que varían en la arquitectura del circuito genético, el mecanismo de expresión (por ejemplo, la integración basada en plásmidos frente a la viral) y los equipos de control de suministro de luz11,16,20,21,22,23,24,25 . Por lo tanto, esto deja espacio para la estandarización de las características optogenéticas, como la construcción y optimización de circuitos genéticos, el método de utilización del sistema (por ejemplo, integración frente a expresión transitoria), las herramientas experimentales utilizadas para la inducción y el análisis de resultados.
Para avanzar en la estandarización de protocolos optogenéticos en células de mamíferos, este protocolo describe una tubería experimental para diseñar sistemas optogenéticos en células de mamíferos utilizando un circuito genético de retroalimentación negativa (NF) integrado en células HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano) como ejemplo. NF es un sistema ideal para demostrar la estandarización, ya que es muy abundante26,27,28 en la naturaleza, lo que permite ajustar los niveles de proteínas y minimizar el ruido. En resumen, nf permite un control preciso de la expresión génica mediante un represor que reduce su propia expresión lo suficientemente rápido, limitando así cualquier cambio lejos de un estado estacionario. El estado estacionario puede ser alterado por un inductor que inactiva o elimina el represor para permitir una mayor producción de proteínas hasta que se alcanza un nuevo estado estacionario para cada concentración de inductor. Recientemente, se creó un sistema optogenético NF diseñado que puede producir una respuesta ampliamente dinámica de la expresión génica, mantener un ruido bajo y responder a los estímulos de la luz, lo que permite el potencial de control de la expresión génica espacial11. Estas herramientas, conocidas como sintonizadores inducibles por la luz (LITers), se inspiraron en sistemas anteriores que permitían el control de la expresión génica en células vivas4,10,29,30 y se integraron de manera estable en las líneas celulares humanas para garantizar el control de la expresión génica a largo plazo.
Aquí, usando el LITer como ejemplo, se describe un protocolo para crear circuitos genéticos sensibles a la luz, inducir la expresión génica con un Aparato de Placa de Luz (LPA, un hardware de inducción optogenética)31 y analizar las respuestas de las líneas celulares diseñadas y controlables optogenéticamente a estímulos de luz personalizados. Este protocolo permite a los usuarios utilizar las herramientas LITer para cualquier gen funcional que deseen explorar. También se puede adaptar para otros sistemas optogenéticos con diversas arquitecturas de circuitos (por ejemplo, retroalimentación positiva, regulación negativa, etc.) mediante la integración de los métodos y equipos optogenéticos que se describen a continuación. Al igual que otros protocolos de biología sintética, las grabaciones de video y los protocolos optogenéticos descritos aquí se pueden aplicar en estudios unicelulares en diversas áreas, que incluyen, entre otras, la biología del cáncer, el desarrollo embrionario y la diferenciación de tejidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

El control confiable de la expresión génica en células de mamíferos requiere herramientas con alto cambio de pliegue, bajo ruido y funciones determinadas de transferencia de entrada a salida, independientemente del método utilizado. Hacia este objetivo, los sistemas de expresión génica optogenética han ganado mucha atención en la última década para el control espaciotemporal de los niveles de proteínas en las células de mamíferos. Sin embargo, la mayoría de los circuitos existentes que controlan la expresión génica inducida por la luz varían en arquitectura, se expresan a partir de plásmidos y utilizan equipos optogenéticos variables, lo que crea la necesidad de explorar la caracterización y estandarización de los componentes optogenéticos en líneas celulares estables. Aquí, el estudio proporciona una línea experimental de construcción, integración y caracterización de circuitos genéticos confiables para controlar la expresión génica inducible por la luz en células de mamíferos, utilizando un circuito optogenético de retroalimentación negativa como ejemplo de caso. Los protocolos también ilustran cómo la estandarización de equipos optogenéticos y regímenes de luz puede revelar de manera confiable las características del circuito génico, como el ruido de expresión génica y la magnitud de la expresión de proteínas. Por último, este documento puede ser de utilidad para los laboratorios que no están familiarizados con la optogenética que deseen adoptar dicha tecnología. La tubería descrita aquí debería aplicarse a otros circuitos optogenéticos en células de mamíferos, lo que permite una caracterización y un control más confiables y detallados de la expresión génica a nivel transcripcional, proteómico y, en última instancia, fenotípico en células de mamíferos.

El ensamblaje de circuitos genéticos y la generación de líneas celulares estables dentro de este artículo se basaron en células HEK-293 comerciales modificadas que contienen un sitio FRT estable único y transcripcionalmente activo (Figura 1). Los circuitos genéticos se construyeron en vectores que tenían sitios FRT dentro del plásmido, lo que permitió la integración Flp-FRT en el genoma celular HEK-293. Este enfoque no se limita a las células Flp-In, ya que los sitios FRT se pued...

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Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

El control fiable de las células de mamíferos sensibles a la luz requiere la estandarización de los métodos optogenéticos. Hacia este objetivo, este estudio describe una línea de construcción de circuitos genéticos, ingeniería celular, operación de equipos optogenéticos y ensayos de verificación para estandarizar el estudio de la expresión génica inducida por la luz utilizando un circuito genético optogenético de retroalimentación negativa como estudio de caso.

Ingeniería confiable y control de circuitos genéticos optogenéticos estables en células de mamíferos

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

El protocolo optogenético estandarizado está diseñado para laboratorios interesados en usar la luz como estímulo para controlar las propiedades celulares en sistemas celulares de mamíferos diseñados. Este protocolo es fácil de implementar en laboratorios que de otro modo no estarían familiarizados con la optogenética y proporciona métodos para el control temporal espacial preciso de sistemas biológicos diseñados. Este método tiene una amplia gama de aplicaciones en áreas de investigación específicas donde la información espaciotemporal puede ser importante, incluida la biología del cáncer, la biología de sistemas y la diferenciación de tejidos.Para empezar, seleccione los componentes genéticos para combinar que se unen en un solo circuito genético o plásmido. Por ejemplo, sitios de integración de ADN de mamíferos, elementos sensibles a la luz o genes funcionales. Después de ensamblar y examinar todas las características necesarias, como codones de inicio, secuencias regulatorias o traducidas, utilice cualquier software de ingeniería genética y clonación molecular, anote y almacene las secuencias de ADN para su uso posterior y como referencia.Valide los cebadores computacionalmente para la construcción de plásmidos a través de las características integradas del software de clonación molecular, por ejemplo, la alineación de secuencias. Para generar una línea celular estable, transfecte los circuitos genéticos de diseño y las células deseadas utilizando una mezcla de liposomas del ADN del circuito génico con la recombinasa adecuada. Después de que las células sean de 80 a 100% confluentes, congele las células en una mezcla de 45% de medios antiguos, 45% de medios frescos y 10% de DMSO.Transfiera las células restantes a un tubo estéril y realice una clasificación de una sola célula para aislar las células monoclonales en una placa de 96 pocillos. Aproximadamente dos o tres semanas después de la clasificación monoclonal, los pozos dentro de la placa de 96 pocillos deben tener focos. Cuando se logra una confluencia del 50 al 60%, divida las células en una placa de 12 pocillos.Agregue el firmware al circuito LPA ensamblado utilizando un programador de microcontroladores. A continuación, combine las piezas impresas en 3D en la placa de circuito ensamblada utilizando la placa de montaje, la placa de circuito, el espaciador LED, el adaptador de placa, una placa de 24 pocillos, una tapa de placa, pernos de montaje, tuercas de ala y componentes de apilamiento. Para comenzar un experimento optogenético, utilice el software Iris disponible en el sitio web de Tabor Lab para programar una tarjeta SD para el LPA y explorar las condiciones de luz apropiadas.A continuación, introduzca los valores de intensidad con las réplicas técnicas para el esquema experimental deseado. Agregue aproximadamente 75, 000 células por pozo en una placa negra de 24 pocillos en un volumen total de 500 microlitros, luego coloque las células en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono para permitirles asentarse durante dos a seis horas. Después de transferir las células en la campana de cultivo de tejidos al final de la incubación, retire la tapa de plástico y agregue una tira de lámina adhesiva a la parte superior de la placa para minimizar la transferencia de luz entre los pozos para que la luz solo pueda ingresar a través del LED ubicado en la parte inferior del pozo.Coloque la placa en las partes 3D instaladas del LPA, luego cubra la placa con la tapa LPA impresa en 3D que se ajusta sobre los tornillos del dispositivo en cada esquina. Conecte el dispositivo a la fuente de alimentación y presione el botón de reinicio en el dispositivo LPA para asegurarse de que se aplique la configuración actualizada del experimento LPA e incube las células. Después de la incubación, dentro de la campana de cultivo de tejidos, retire la tira de papel de aluminio de la placa y deje que la placa repose durante uno o dos minutos para evitar que se forme condensación en la tapa de plástico.A continuación, vuelva a colocar la tapa de plástico original en la placa y obtenga imágenes de las células con el contraste de fase apropiado o el microscopio de fluorescencia. Después de 24 a 72 horas después de la inducción, seguida de tripsinización, transfiera todo el contenido de cada pozo de aproximadamente 500 microlitros a los tubos etiquetados equipados con el colador celular. Luego, utilizando el software de instrumento de citometría de flujo apropiado, cree una puerta de dispersión hacia adelante y hacia afuera para capturar las células individuales del tamaño y la granularidad apropiados para excluir los desechos y los grupos celulares.Una vez que se establece la puerta, capture aproximadamente 10, 000 celdas con la puerta adecuada y ajuste el número de celdas según la cantidad de datos celulares requeridos y repita la captura de células experimentales en cada tubo. Después de la inducción y la tripsinización, transfiera todo el contenido de cada pocillo de aproximadamente 500 microlitros a los tubos etiquetados. Centrifugar las células durante cinco minutos a 400 veces G.Después de desechar el sobrenadante, mueva las muestras a una campana de humos químicos.Resuspender las células en 750 a 1,000 microlitros de 4% PFA diluidos en PBS y pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para romper los grupos celulares. Después de 15 minutos de incubación, agregue de 750 a 1, 000 microlitros de PBS y nuevamente pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces, luego pegue las células durante cinco minutos a 400 veces G a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, mueva las muestras a una campana de humos químicos y resuspenda las células en 750 a 1, 000 microlitros de metanol helado como se ha demostrado y permita que las células se asienten durante 30 minutos en un congelador de menos 20 grados centígrados.Después de la incubación, agregue de 750 a 1, 000 microlitros de PBS mientras pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces. Luego, después de centrifugar las células durante cinco minutos a 400 veces G, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos. Resuspender las células en 100 microlitros u otra dilución adecuada del anticuerpo primario marcado y pipetear hacia arriba y hacia abajo de seis a ocho veces, luego incubar durante una hora a temperatura ambiente.A continuación, agregue de 750 a 1, 000 microlitros del tampón de incubación y la solución de pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces, luego centrifugue las células durante cinco minutos a 400 veces G.A continuación, resuspenda las células en 500 microlitros de PBS y rompa los grupos mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera todo el contenido de cada tubo a tubos etiquetados con coladores de células. Lleve las células a instrumentos de citometría de flujo apropiados con láseres de las longitudes de onda correctas.La calibración óptica se realizó para los dispositivos. Utilizando la imagen adquirida, se calcularon los valores de compensación para el LED, se restó la señal de fondo y se dedujo la intensidad de los píxeles. El coeficiente de variación fue mínimo entre 96 pozos.El software de calibración demostró la variación del LED por ubicación y creó un ajuste de escala de grises para que cada LED se normalice a la misma intensidad. La expresión génica se indujo en células más ligeras diseñadas a través de microscopía de fluorescencia a diferentes duraciones de pulso de luz en el LPA y las células se tomaron imágenes para la expresión de Brightfield y GFP. Usando citometría de flujo, las células fueron inducidas a diferentes valores de longitud de pulso y mostraron una respuesta a la dosis de expresión génica cuantificada a nivel de la población de más de cuatro veces el cambio de los estados no inducidos.La retroalimentación negativa logró una reducción del ruido de expresión génica de más de cinco veces, como se muestra al comparar varios valores de intensidad de luz para el sistema más ligero versus vívido o ligero encendido. El análisis de qPCR mostró que las células más ligeras diseñadas expresaron los niveles de ARN de una manera sensible a la dosis con más de diez veces la inducción de estados no inducidos, coincidiendo con la cuantificación de citometría de flujo. El circuito genético más ligero diseñado mostró cantidades crecientes de luz azul que resultaron en un aumento de los niveles de proteína KRAS y niveles de ERK fosforilados.Se pueden realizar varios ensayos funcionales, incluidos los ensayos de crecimiento, motilidad celular, cicatrización de heridas, proliferación o invasión. Estos métodos podrían proporcionar información específica sobre los mecanismos de la biología del cáncer, la diferenciación de tejidos o la resistencia a los medicamentos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Investigación

Bioingeniería

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Biorreactores de fibra hueca para<em&gt; En Vivo</em&gt; -como Cultivo de tejidos de mamíferos

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularizado de Bioprinting de microfluidos para la ingeniería de tejidos y organitas

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

División de célula mamífera en Matrices 3D mediante microscopia de reflexión Confocal cuantitativa

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Un Orbital agitación cultivo de células mamíferas en vasos en forma de O para producir agregados uniforme

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Jeringa inyectable malla electrónica para electrofisiología roedor crónico estable

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...