Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Vi vill tacka Balázsi lab för kommentarer och förslag, Dr. Karl P. Gerhardt och Dr. Jeffrey J. Tabor för att hjälpa oss att bygga den första LPA, och Dr Wilfried Weber för att dela LOV2-degron plasmids. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health [R35 GM122561 och T32 GM008444].; Laufer centrerar för läkarundersökning och kvantitativ biologi; och ett NDSEG-stipendium (National Defense Science and Engineering). Finansiering av öppen avgift: NIH [R35 GM122561].
Författarbidrag: M.T.G. och G.B. utformade projektet. M.T.G., D.C., och L.G., utförde experimenten. M.T.G., D.C., L.G., och G.B. analyserade data och förberedde manuskriptet. G.B och M.T.G. övervakade projektet.

1. Genkretsdesign
<ol><li>Välj genetiska komponenter att kombinera till en enda genkrets/plasmid (t.ex. dna-integrationssekvensmotiv för däggdjur32, ljuskänsliga element33 eller funktionella gener34).</li>
	<li>Använd någon genteknik och/eller molekylär kloningsprogramvara, lagra DNA-sekvenserna för senare användning och referens, kommentera varje sekvens och undersöka alla nödvändiga funktioner (t.ex. START-kodoner, reglerande eller ö...

Läsare av denna artikel kan få insikt i de steg som är avgörande för att karakterisera optogenetiska genkretsar (liksom andra genuttryckssystem), inklusive 1) genkretsdesign, konstruktion och validering; 2) Cellteknik för införande av genkretsar i stabila cellinjer (t.ex. Flp-FRT-rekombination). 3) Induktion av de konstruerade cellerna med en ljusbaserad plattform såsom LPA; 4) Inledande karakterisering av ljusinduktionsanalyser via fluorescensmikroskopi. och 5) slutlig genuttryck karakterisering med en mängd ol...

I likhet med andra tekniska discipliner syftar syntetisk biologi till att standardisera protokoll, så att verktyg med mycket reproducerbara funktioner kan användas för att utforska frågor som är relevanta för biologiska system1,2. En domän inom syntetisk biologi där många styrsystem har byggts är området genuttrycksreglering3,4. Genuttryckskontroll kan rikta in sig på både proteinnivåer och variabilitet (brus eller variationskoefficient, CV = σ/μ, mätt som standardavvikelsen över medelvärdet), som är avgörande cellulära egenskaper på grund av deras roller i fysiologiska och patologiska cellulära tillstånd5,6,7,8. Många syntetiska system som kan kontrollera proteinnivåer och brus4,9,10,11,12 har konstruerats, vilket skapar möjligheter att standardisera protokoll över verktyg.
En ny uppsättning verktyg som kan kontrollera gennätverk som nyligen har uppstått är optogenetik, vilket möjliggör användning av ljus för att kontrollera genuttryck13,14,15,16,17. I likhet med sina kemiska föregångare kan optogenetiska genkretsar införas i alla celltyper, allt från bakterier till däggdjur, vilket möjliggör uttryck för någon nedströmsgen av intresse18,19. På grund av den snabba genereringen av nya optogenetiska verktyg har dock många system uppstått som varierar i genetisk kretsarkitektur, uttrycksmekanism (t.ex. plasmidbaserad kontra viral integration) och ljusförsörjningskontrollutrustning11,16,20,21,22,23,24,25 . Därför lämnar detta utrymme för standardisering av optogenetiska funktioner som genkretskonstruktion och optimering, metod för systemutnyttjande (t.ex. integration kontra transienta uttryck), experimentella verktyg som används för induktion och analys av resultat.
För att göra framsteg med att standardisera optogenetiska protokoll i däggdjursceller beskriver detta protokoll en experimentell pipeline för att konstruera optogenetiska system i däggdjursceller med hjälp av en negativ feedback (NF) genkrets integrerad i HEK293-celler (mänsklig embryonal njurcelllinje) som ett exempel. NF är ett idealiskt system för att demonstrera standardisering eftersom det är mycket rikligt26,27,28 i naturen, vilket gör att proteinnivåer kan justeras och ljudminimering uppstå. Kort sagt, NF möjliggör exakt genuttryckskontroll genom en undertryckare som minskar sitt eget uttryck tillräckligt snabbt, vilket begränsar alla förändringar bort från ett stabilt tillstånd. Steady state kan ändras av en inducerare som inaktiverar eller eliminerar tryckpressorn för att möjliggöra mer proteinproduktion tills ett nytt stabilt tillstånd uppnås för varje inducerarkoncentration. Nyligen skapades ett konstruerat NF optogenetiskt system som kan producera ett brett dynamiskt svar av genuttryck, upprätthålla lågt brus och svara på ljusstimuli som möjliggör potentialen för rumslig genuttryckskontroll11. Dessa verktyg, så kallade ljusinducerbara tuners (LITers), inspirerades av tidigare system som tillät genuttryckskontroll i levande celler4,10,29,30 och var stabilt integrerade i mänskliga cellinjer för att säkerställa långsiktig genuttryckskontroll.
Här, med LITer som exempel, beskrivs ett protokoll för att skapa ljuskänsliga genkretsar, inducera genuttryck med en ljusplattaapparat (LPA, en optogenetisk induktionsmaskinvara)31 och analysera svaren från de konstruerade, optogenetiskt kontrollerbara cellinjerna till anpassade ljusstimuli. Detta protokoll tillåter användare att använda LITer-verktygen för alla funktionella gener de vill utforska. Det kan också anpassas för andra optogenetiska system med olika kretsarkitekturer (t.ex. positiv feedback, negativ reglering etc.) genom att integrera de metoder och optogenetisk utrustning som beskrivs nedan. I likhet med andra syntetiska biologi protokoll, videoinspelningar och optogenetic protokoll beskrivs här kan tillämpas i encellsstudier i olika områden, inklusive men inte begränsat till cancerbiologi, embryonal utveckling och vävnad differentiering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

Tillförlitlig genuttryckskontroll i däggdjursceller kräver verktyg med hög vikförändring, lågt brus och bestämda överföringsfunktioner från ingång till utgång, oavsett vilken metod som används. Mot detta mål har optogenetiska genuttryckssystem fått mycket uppmärksamhet under det senaste decenniet för spatiotemporal kontroll av proteinnivåer i däggdjursceller. De flesta befintliga kretsar som styr ljusinducerade genuttryck varierar dock i arkitektur, uttrycks från plasmider och använder variabel optogenetisk utrustning, vilket skapar ett behov av att utforska karakterisering och standardisering av optogenetiska komponenter i stabila cellinjer. Här ger studien en experimentell pipeline av tillförlitlig genkretskonstruktion, integration och karakterisering för att kontrollera ljusinducerbart genuttryck i däggdjursceller, med hjälp av en negativ feedback optogenetisk krets som ett exempel. Protokollen illustrerar också hur standardisering av optogenetisk utrustning och ljusregimer på ett tillförlitligt sätt kan avslöja genkretsfunktioner som genuttrycksljud och proteinuttrycksstorlek. Slutligen kan detta dokument vara till nytta för laboratorier som inte känner till optogenetik och som vill använda sådan teknik. Pipelinen som beskrivs här bör gälla för andra optogenetiska kretsar i däggdjursceller, vilket möjliggör mer tillförlitlig, detaljerad karakterisering och kontroll av genuttryck på transkriptionell, proteomisk och i slutändan fenotypisk nivå i däggdjursceller.

Genkretsmontering och stabil cellinjegenerering i denna artikel baserades på kommersiella, modifierade HEK-293 celler som innehåller en transkriptionellt aktiv, enda stabil FRT-plats (figur 1). Genkretsarna konstruerades till vektorer som hade FRT-platser inom plasmiden, vilket möjliggör Flp-FRT-integrationen i HEK-293-cellsgenomet. Detta tillvägagångssätt är inte begränsat till Flp-In-celler, eftersom FRT-webbplatser kan läggas till i alla cellinjer av intresse var som helst i gen...

Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Att på ett tillförlitligt sätt kontrollera ljuskänsliga däggdjursceller kräver standardisering av optogenetiska metoder. Mot detta mål beskriver denna studie en pipeline av genkrets konstruktion, cellteknik, optogenetic utrustning drift och verifiering analyser för att standardisera studien av ljusinducerade genuttryck med hjälp av en negativ-feedback optogenetic genkrets som en fallstudie.

Tillförlitligt konstruera och kontrollera stabila optogenetiska genkretsar i däggdjursceller

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Det standardiserade optogenetiska protokollet är utformat för laboratorier som är intresserade av att använda ljus som stimulans för att kontrollera cellulära egenskaper i konstruerade däggdjurscellsystem. Detta protokoll är lätt att implementera i laboratorier som annars inte känner till optogenetik och ger metoder för exakt rumslig temporal kontroll av konstruerade biologiska system. Denna metod har ett brett användningsområde inom specifika forskningsområden där spatiotemporal information kan vara viktig inklusive cancerbiologi, systembiologi och vävnadsdifferentiering.Till att börja med väljer du de genetiska komponenterna för att kombinera bindning till en enda genkrets eller plasmid. Till exempel dna-integrationsplatser för däggdjur, ljuskänsliga element eller funktionella gener. Efter att ha monterat och undersökt alla nödvändiga funktioner som start codons, reglerande eller översatta sekvenser, använd någon genteknik och molekylär kloning programvara, kommentera och lagra DNA-sekvenserna för senare användning och som referens.Validera primers beräkningsmässigt för plasmidkonstruktion genom de inbyggda molekylära kloningsprogramvaran, till exempel sekvensjustering. För att generera en stabil cellinje, transfect designgenkretsarna och de önskade cellerna med hjälp av en liposomblandning av genkretsens DNA med lämplig rekombination. När cellerna är 80 till 100% sammanflöde fryser du cellerna i en blandning av 45% gamla medier, 45% färska medier och 10%DMSO.Överför de återstående cellerna till ett sterilt rör och utför encellssortering för att isolera monoklonala celler till en 96-välplatta. Ungefär två till tre veckor efter monoklonal sortering bör brunnarna inom 96-brunnsplattan ha högborgar. När 50 till 60% sammanflöde uppnås, dela cellerna i en 12-brunnsplatta.Lägg till firmware till den monterade LPA-kretsen med hjälp av en mikrokontrollerprogrammerare. Kombinera sedan 3D-utskrivna delar i det monterade kretskortet med monteringsplattan, kretskortet, LED-distansen, plattadaptern, en 24-välplatta, ett plåtlock, monteringsbultar, vingmuttrar och staplingskomponenter. För att påbörja ett optogenetiskt experiment, använd Iris-programvaran som finns tillgänglig på Tabor Labs webbplats för att programmera ett SD-kort för LPA och utforska lämpliga ljusförhållanden.Ange sedan intensitetsvärden med de tekniska replikaten för önskad experimentell disposition. Tillsätt cirka 75 000 celler per brunn i en 24-brunns svart platta i en total volym av 500 mikroliter och placera sedan cellerna i en fuktad inkubator med 5% koldioxid så att de kan nöja sig i två till sex timmar. Efter överföring av cellerna i vävnadsodlingshuven i slutet av inkubationen, ta bort plastlocket och tillsätt en självhäftande folieremsa till toppen av plattan för att minimera ljusöverföringen mellan brunnarna så att ljuset bara kan komma in genom lysdioden som ligger längst ner på brunnen.Placera plattan i de monterade 3D-delarna av LPA och täck sedan plattan med det 3D-utskrivna LPA-locket som passar över enhetens skruvar i varje hörn. Anslut enheten till strömkällan och tryck på återställningsknappen på LPA-enheten för att säkerställa att de uppdaterade LPA-experimentinställningarna tillämpas och inkuberar cellerna. Efter inkubation, inuti vävnadsodlingshuven, ta bort folieremsan från plattan och låt plattan sitta i en till två minuter för att förhindra att kondens bildas på plastlocket.Sätt sedan tillbaka det ursprungliga plastlocket på plattan och avbilda cellerna med lämplig faskontrast eller fluorescensmikroskop. Efter 24 till 72 timmar efter induktion, följt av trypsinisering, överför hela innehållet i varje brunn på cirka 500 mikroliter till de märkta rören utrustade med cellsilen. Använd sedan lämplig programvara för flödescytometriinstrument, skapa en framåt- och sidospridningsport för att fånga de enskilda cellerna av lämplig storlek och granularitet för att utesluta skräp och cellulära klumpar.När porten är inställd fångar du cirka 10 000 celler med lämplig grind och justerar cellnumret beroende på mängden celldata som krävs och upprepar att fånga experimentella celler i varje rör. Efter induktion och trypsinisering, överför hela innehållet i varje brunn på cirka 500 mikroliter till de märkta rören. Centrifugera cellerna i fem minuter vid 400 gånger G.Efter att ha kasserat supernatanten, flytta proverna till en kemisk rökhuv.Återsuspend cellerna i 750 till 1 000 mikroliter av 4% PFA utspädd i PBS och pipetter upp och ner flera gånger för att bryta cellklumparna. Efter 15 minuters inkubation tillsätt 750 till 1 000 mikroliter PBS och rör igen upp och ner flera gånger och sedan pellet ner cellerna i fem minuter vid 400 gånger G vid rumstemperatur. Efter att ha kasserat supernatanten, flytta proverna till en kemisk rökhuv och återanvända cellerna i 750 till 1 000 mikroliter iskall metanol som visats och låt cellerna sitta i 30 minuter i en minus 20 grader Celsius frys.Efter inkubationen tillsätt 750 till 1 000 mikroliter PBS medan du pipetterar upp och ner flera gånger. Sedan efter att ha centrifugat cellerna i fem minuter vid 400 gånger G, kassera supernatanten och flytta proverna till en kemisk rökhuv. Återsuspendera cellerna i 100 mikroliter eller annan lämplig utspädning av märkta primära antikroppar och pipetter upp och ner sex till åtta gånger och inkubera sedan i en timme vid rumstemperatur.Tillsätt sedan 750 till 1 000 mikroliter av inkubationsbufferten och pipettenlösningen upp och ner flera gånger, centrifugera sedan cellerna i fem minuter vid 400 gånger G.Next, återanvänd cellerna i 500 mikroliter PBS och bryta klumparna genom pipettering upp och ner flera gånger. Överför hela innehållet i varje rör till märkta rör med cellssiler. För cellerna till lämpliga flödescytometriinstrument med lasrar med rätt våglängder.Den optiska kalibreringen utfördes för enheterna. Med hjälp av den förvärvade bilden beräknades kompensationsvärden för LED, bakgrundssignal subtraherades och pixelintensiteten härleddes. Variationskoefficienten var minimal mellan 96 brunnar.Kalibreringsprogramvaran demonstrerade LED-variationen efter plats och skapade en gråskalajustering så att varje lysdiod normaliseras till samma intensitet. Gen uttryck inducerades i konstruerade lättare celler via fluorescence mikroskopi vid olika ljus puls varaktigheter på LPA och cellerna var avbildade för Brightfield och GFP uttryck. Med hjälp av flöde cytometri inducerades cellerna vid olika puls längd värden och visade en dos svar av gen uttryck kvantifieras på populationsnivå över fyrfaldig förändring från oinducerade stater.Den negativa återkopplingen uppnåddes över femfaldig genuttrycksbrusreducering som visas genom att jämföra olika ljusintensitetsvärden för det lättare systemet kontra levande eller ljust på. QPCR-analysen visade att de konstruerade lättare cellerna uttryckte RNA-nivåer på ett dos-responsivt sätt med över tiofaldig induktion från oinducerade tillstånd, som matchade flödescytometrikvantifieringen. Den konstruerade lättare genkretsen visade ökande mängder blått ljus som resulterade i ökade KRAS-proteinnivåer och fosforylerade ERK-nivåer.Flera funktionella analyser kan utföras inklusive tillväxt, cellmotilitet, sårläkning, spridning eller invasion analyser. Dessa metoder kan ge specifika insikter om mekanismerna för cancerbiologi, vävnad differentiering eller läkemedelsresistens.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Extraction för riktade Stabil isotoputspädning Vätskekromatografi-masspektrometri Analys

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingenjörs 3D Cellularized kollagengeler för kärlvävnad Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hålfiber Bioreaktorer för<em&gt; In Vivo</em&gt; -liknande Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design och implementering av en automatisk Lysande, Odling och provtagningssystemet för Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Simuleras Bioprinting för Engineering vaskulariserad vävnad och Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Däggdjur celldelning i 3D matriser via kvantitativa Confocal speglar mikroskopi

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Odling däggdjursceller i tredimensionella peptid ställningar

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital skakar kultur av däggdjursceller i O-formade fartyg att producera enhetliga aggregat

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Spruta-injicerbara Mesh elektronik för stabil kronisk gnagare elektrofysiologi

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...