Name: reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Yorum ve önerileriniz için Balázsi laboratuvarına, ilk LPA'yı oluşturmamıza yardımcı oldukları için Dr. Karl P. Gerhardt ve Dr. Jeffrey J. Tabor'a ve LOV2-degron plazmidlerini paylaştıkları için Dr. Wilfried Weber'e teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R35 GM122561 ve T32 GM008444]; Laufer Fiziksel ve Kantitatif Biyoloji Merkezi; ve Ulusal Savunma Bilimi ve Mühendisliği Yüksek Lisans (NDSEG) Bursu. Açık erişim ücreti için finansman: NIH [R35 GM122561].
Yazar katkıları: M.T.G. ve G.B. projeyi tasarladı. M.T.G., D.C. ve L.G. deneyleri gerçekleştirdi. M.T.G., D.C., L.G. ve G.B. verileri analiz etmiş ve makaleyi hazırlamıştır. G.B. ve M.T.G. projeyi denetledi.

1. Gen devresi tasarımı
<ol><li>Tek bir gen devresinde/plazmidinde birleştirilecek genetik bileşenleri seçin (örneğin; memeli DNA entegrasyon dizisi motifleri32, ışığa duyarlı elementler33 veya fonksiyonel genler34).</li>
	<li>Herhangi bir genetik mühendisliği ve/veya moleküler klonlama yazılımı kullanarak, DNA dizilerini daha sonra kullanmak ve referans almak üzere saklayın, her diziye açıklama ekleyin ve gerekli tüm özelli...

Bu makalenin okuyucuları, optogenetik gen devrelerini (ve diğer gen ekspresyon sistemlerini) karakterize etmek için hayati önem taşıyan adımlar hakkında fikir edinebilirler: 1) gen devresi tasarımı, yapımı ve doğrulanması; 2) gen devrelerini kararlı hücre hatlarına sokmak için hücre mühendisliği (örneğin, Flp-FRT rekombinasyonu); 3) mühendislik hücrelerinin LPA gibi ışık tabanlı bir platformla indüklenmesi; 4) floresan mikroskopi ile ışık indüksiyon tahlillerinin ilk karakterizasyonu; ve...

Diğer mühendislik disiplinlerine benzer şekilde, sentetik biyoloji de protokolleri standartlaştırmayı ve biyolojik sistemlerle ilgili soruları araştırmak için yüksek oranda tekrarlanabilir işlevlere sahip araçların kullanılmasına izin vermeyi amaçlamaktadır1,2. Sentetik biyolojide birçok kontrol sisteminin inşa edildiği alanlardan biri de gen ekspresyon regülasyonu alanıdır3,4. Gen ekspresyon kontrolü, fizyolojik ve patolojik hücresel durumlardaki rolleri nedeniyle çok önemli hücresel özellikler olan hem protein seviyelerini hem de değişkenliği (gürültü veya varyasyon katsayısı, CV = σ / μ, ortalamanın standart sapması olarak ölçülür) hedefleyebilir5,6,7,8. Protein seviyelerini ve gürültüyü kontrol edebilen birçok sentetik sistem4,9,10,11,12 tasarlanmış ve araçlar arasında protokolleri standartlaştırmak için fırsatlar yaratılmıştır.
Son zamanlarda ortaya çıkan gen ağlarını kontrol edebilen yeni bir araç seti optogenetiktir ve gen ekspresyonunu kontrol etmek için ışığın kullanılmasını sağlar13,14,15,16,17. Kimyasal öncüllerine benzer şekilde, optogenetik gen devreleri, bakterilerden memelilere kadar herhangi bir hücre tipine sokulabilir ve ilgilenilen herhangi bir aşağı akış geninin ekspresyonuna izin verir18,19. Bununla birlikte, yeni optogenetik araçların hızlı bir şekilde üretilmesi nedeniyle, genetik devre mimarisinde, ekspresyon mekanizmasında (örneğin, plazmid bazlı ve viral entegrasyon) ve ışık sağlayan kontrol ekipmanlarında farklılık gösteren birçok sistem ortaya çıkmıştır11,16,20,21,22,23,24,25 . Bu nedenle, bu, gen devresi yapımı ve optimizasyonu, sistem kullanım yöntemi (örneğin, entegrasyon ve geçici ifade), indüksiyon için kullanılan deneysel araçlar ve sonuçların analizi gibi optogenetik özelliklerin standardizasyonu için yer bırakmaktadır.
Memeli hücrelerinde optogenetik protokollerin standartlaştırılmasında ilerleme kaydetmek için, bu protokol, örnek olarak HEK293 hücrelerine (insan embriyonik böbrek hücresi hattı) entegre edilmiş bir negatif geri besleme (NF) gen devresi kullanarak memeli hücrelerinde optogenetik sistemlerin mühendisliğini yapmak için deneysel bir boru hattını açıklamaktadır. NF, standardizasyonu göstermek için ideal bir sistemdir, çünkü doğada oldukça bol miktarda bulunur26,27,28, protein seviyelerinin ayarlanmasına ve gürültünün en aza indirilmesine izin verir. Kısacası, NF, bir baskılayıcı tarafından kendi ekspresyonunu yeterince hızlı bir şekilde azaltarak hassas gen ekspresyon kontrolüne izin verir, böylece herhangi bir değişikliği kararlı bir durumdan uzaklaştırır. Kararlı durum, her bir indükleyici konsantrasyonu için yeni bir kararlı duruma ulaşılana kadar daha fazla protein üretimine izin vermek için baskılayıcıyı inaktive eden veya ortadan kaldıran bir indükleyici tarafından değiştirilebilir. Son zamanlarda, gen ekspresyonunun geniş dinamik bir tepkisini üretebilen, düşük gürültüyü koruyabilen ve mekansal gen ekspresyon kontrolü potansiyeline izin veren ışık uyaranlarına cevap verebilen mühendislik ürünü bir NF optogenetik sistemi oluşturuldu11. Işık kaynaklı tunerler (LITers) olarak bilinen bu araçlar, canlı hücrelerde gen ekspresyon kontrolüne izin veren daha önceki sistemlerden esinlenmiştir4,10,29,30 ve uzun süreli gen ekspresyon kontrolünü sağlamak için insan hücre hatlarına istikrarlı bir şekilde entegre edilmiştir.
Burada, LITer'i örnek olarak kullanarak, ışığa duyarlı gen devreleri oluşturmak, bir Işık Plakası Aparatı (LPA, bir optogenetik indüksiyon donanımı)31 ile gen ekspresyonunu indüklemek ve mühendislik yapılmış, optogenetik olarak kontrol edilebilir hücre hatlarının özel ışık uyaranlarına tepkilerini analiz etmek için bir protokol özetlenmiştir. Bu protokol, kullanıcıların keşfetmek istedikleri herhangi bir işlevsel gen için LITer araçlarını kullanmalarını sağlar. Ayrıca, aşağıda özetlenen yöntemleri ve optogenetik ekipmanı entegre ederek çeşitli devre mimarilerine (örneğin, olumlu geri bildirim, negatif düzenleme vb.) sahip diğer optogenetik sistemler için uyarlanabilir. Diğer sentetik biyoloji protokollerine benzer şekilde, burada özetlenen video kayıtları ve optogenetik protokoller, kanser biyolojisi, embriyonik gelişim ve doku farklılaşması dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli alanlarda tek hücreli çalışmalarda uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>reagent for carrying out PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>reagent for splitting &#38; harvesting mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000020</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#956;L Adjustable Volume Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>tool used for pipetting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>reagent for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628113</td>
			<td>equipment for mammalian culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>GR140-500</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foils for 96-well Plates</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>60941-126</td>
			<td>tool used for covering plates in light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td>reagent for selecting bacteria with correct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog vortex mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365PR</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140010</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRAria</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td>tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>649225</td>
			<td>tool for characterizing engineered cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Government Scientific Source</td>
			<td>SIGA4919-1G</td>
			<td>reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22628113</td>
			<td>instrument for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for carrying out IF reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>plate used for growing monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne T25 filter cap TC flask</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-4825</td>
			<td>container for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>reagent used for freezing down engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-585-011</td>
			<td>reagent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td>container for growing sorted monoclonal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS Express</td>
			<td>De Novo Software:</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>equipment for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-092</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10687-010</td>
			<td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td>reagent for converting RNA to cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -20 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76210-392</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Freezer -80 &#176;C</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MDF-U74VC</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Refrigerator +4 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76359-220</td>
			<td>equipment for storing experimental reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-250G</td>
			<td>reagent for growing bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 3000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2019</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for analyzing experimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413775000</td>
			<td>reagent for immunofluorescence reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td>plasticware container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4331182</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiTherm Shaker</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H5000-HC</td>
			<td>equipment for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-NDL-US-CAN</td>
			<td>equipment for DNA/RNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492S</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>bacterial cells for amplifying gene circuit of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>E2621L</td>
			<td>reagent for combining gene circuit fragements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>instrument for quantifying gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for characterizing fluorescence microscopy data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>reagent used for PCR of gene circuit components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVHL-PA</td>
			<td>instrument for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>reagent for growing mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370S</td>
			<td>primary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary KRAS antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0003845M1</td>
			<td>primary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>reagent kit for purifying gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A28137</td>
			<td>equipment for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relative Quantification App</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>kit for extracting RNA of engineered mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8889S</td>
			<td>secondary ERK antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary KRAS antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>secondary KRAS antibody for immunifluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipets 5.0 mL</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td>reagents used for setting up a variety of chemical reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartView Pro Imager System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>UVCI-1200</td>
			<td>tool for imaging correct PCR bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer (free) or SnapGene</td>
			<td>SnapGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software DNA sequence design and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU-TIZ</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4326317E</td>
			<td>qPCR Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>plate used for light-induction experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>reagent for mammalian cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-290</td>
			<td>equipment for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flp-In 293</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R75007</td>
			<td>Engineered cell line with FRT site</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells

Memeli hücrelerinde güvenilir gen ekspresyon kontrolü, kullanılan yöntemden bağımsız olarak, yüksek katlama değişimi, düşük gürültü ve belirlenmiş giriş-çıkış transfer işlevlerine sahip aletler gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, optogenetik gen ekspresyon sistemleri, memeli hücrelerinde protein seviyelerinin mekansal zamansal kontrolü için son on yılda çok dikkat çekmiştir. Bununla birlikte, ışık kaynaklı gen ekspresyonunu kontrol eden mevcut devrelerin çoğu mimaride farklılık gösterir, plazmidlerden eksprese edilir ve değişken optogenetik ekipman kullanır, bu da kararlı hücre hatlarında optogenetik bileşenlerin karakterizasyonunu ve standardizasyonunu keşfetme ihtiyacı yaratır. Burada, çalışma, memeli hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu kontrol etmek için güvenilir gen devresi yapımı, entegrasyonu ve karakterizasyonunun deneysel bir boru hattını sunarak, bir vaka örneği olarak negatif geri beslemeli optogenetik devre kullanmaktadır. Protokoller ayrıca, optogenetik ekipmanın ve ışık rejimlerinin standartlaştırılmasının, gen ekspresyon gürültüsü ve protein ekspresyon büyüklüğü gibi gen devresi özelliklerini nasıl güvenilir bir şekilde ortaya çıkarabileceğini göstermektedir. Son olarak, bu makale optogenetiğe aşina olmayan ve bu teknolojiyi benimsemek isteyen laboratuvarlar için yararlı olabilir. Burada tarif edilen boru hattı, memeli hücrelerindeki diğer optogenetik devreler için geçerli olmalı ve memeli hücrelerinde transkripsiyonel, proteomik ve nihayetinde fenotipik düzeyde gen ekspresyonunun daha güvenilir, ayrıntılı karakterizasyonuna ve kontrolüne izin vermelidir.

Bu makalede yer alan gen devresi montajı ve kararlı hücre hattı üretimi, transkripsiyonel olarak aktif, tek kararlı FRT bölgesi içeren ticari, modifiye HEK-293 hücrelerine dayanmaktadır (Şekil 1). Gen devreleri, plazmid içinde FRT bölgelerine sahip vektörler halinde inşa edildi ve HEK-293 hücre genomuna Flp-FRT entegrasyonuna izin verdi. Bu yaklaşım Flp-In hücreleriyle sınırlı değildir, çünkü FRT siteleri, CRISPR / Cas950 gibi DNA düzenleme ...

Watch this Scientific Journal Video about Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells at JoVE.com

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Standartlaştırılmış optogenetik protokol, mühendislik ürünü memeli hücre sistemlerinde hücresel özellikleri kontrol etmek için ışığı uyaran olarak kullanmakla ilgilenen laboratuvarlar için tasarlanmıştır. Bu protokolün optogenetiğe aşina olmayan laboratuvarlarda uygulanması kolaydır ve mühendislik biyolojik sistemlerinin hassas mekansal zamansal kontrolü için yöntemler sağlar. Bu yöntem, kanser biyolojisi, sistem biyolojisi ve doku farklılaşması dahil olmak üzere mekansal zamansal bilgilerin önemli olabileceği belirli araştırma alanlarında geniş bir uygulama alanına sahiptir.Başlangıç olarak, tek bir gen devresine veya plazmidine bağlanacak genetik bileşenleri seçin. Örneğin, memeli DNA entegrasyon bölgeleri, ışığa duyarlı elementler veya fonksiyonel genler. Başlangıç kodonları, düzenleyici veya çevrilmiş diziler gibi gerekli tüm özellikleri bir araya getirdikten ve inceledikten sonra, herhangi bir genetik mühendisliği ve moleküler klonlama yazılımı kullanın, DNA dizilerine daha sonra kullanmak ve referans olarak açıklama ekleyin ve saklayın.Astarları, plazmid yapımı için hesaplamalı olarak, yerleşik moleküler klonlama yazılımı özellikleri, örneğin dizi hizalaması aracılığıyla doğrulayın. Kararlı bir hücre hattı oluşturmak için, uygun rekombinaz ile gen devresi DNA'sının lipozom karışımını kullanarak tasarım gen devrelerini ve istenen hücreleri transfekte edin. Hücreler% 80 ila% 100 birleştikten sonra,% 45 eski ortam,% 45 taze ortam ve% 10 DMSO karışımında hücreleri dondurun.Kalan hücreleri steril bir tüpe aktarın ve monoklonal hücreleri 96 delikli bir plakaya izole etmek için tek hücreli sıralama yapın. Monoklonal sıralamadan yaklaşık iki ila üç hafta sonra, 96 delikli plaka içindeki kuyucukların odakları olmalıdır. % 50 ila% 60 akıcılık elde edildiğinde, hücreleri 12 delikli bir plakaya bölün.Ürün yazılımını bir mikrodenetleyici programcısı kullanarak monte edilmiş LPA devresine ekleyin. Daha sonra, montaj plakası, devre kartı, LED ara parça, plaka adaptörü, 24 delikli bir plaka, bir plaka kapağı, montaj cıvataları, kanat somunları ve istifleme bileşenlerini kullanarak monte edilmiş devre kartındaki 3D baskılı parçaları birleştirin. Bir optogenetik deneye başlamak için, LPA için bir SD kart programlamak ve uygun ışık koşullarını keşfetmek için Tabor Lab web sitesinde bulunan Iris yazılımını kullanın.Ardından, istenen deneysel anahat için teknik kopyalarla yoğunluk değerlerini girin. Toplam 500 mikrolitre hacimde 24 kuyucuklu siyah bir plakaya kuyucuk başına yaklaşık 75.000 hücre ekleyin, ardından hücreleri iki ila altı saat boyunca yerleşmelerini sağlamak için% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Kuluçka sonunda doku kültürü davlumbazındaki hücreleri aktardıktan sonra, plastik kapağı çıkarın ve kuyucuklar arasındaki ışık transferini en aza indirmek için plakanın üstüne yapışkan bir folyo şerit ekleyin, böylece ışık yalnızca kuyunun dibinde bulunan LED'den girebilir.Plakayı LPA'nın takılı 3D parçalarına yerleştirin, ardından plakayı her köşedeki cihaz vidalarının üzerine oturan 3D baskılı LPA kapağıyla örtün. Güncellenmiş LPA deney ayarlarının uygulandığından emin olmak ve hücreleri inkübe etmek için cihazı güç kaynağına takın ve LPA cihazındaki sıfırlama düğmesine basın. Kuluçkadan sonra, doku kültürü davlumbazının içinde, folyo şeridini plakadan çıkarın ve plastik kapakta yoğuşmanın oluşmasını önlemek için plakayı bir ila iki dakika bekletin.Ardından, orijinal plastik kapağı tekrar plakaya koyun ve hücreleri uygun faz kontrastı veya floresan mikroskobu ile görüntüleyin. İndüksiyondan 24 ila 72 saat sonra, ardından tripsinizasyon, yaklaşık 500 mikrolitrelik her bir kuyucuğun tüm içeriğini hücre süzgeci ile donatılmış etiketli tüplere aktarın. Daha sonra uygun akış sitometri cihazı yazılımını kullanarak, enkaz ve hücresel kümeleri dışlamak için uygun boyut ve granülerlikteki tek hücreleri yakalamak için bir ileri ve yan saçılma kapısı oluşturun.Kapı ayarlandıktan sonra, uygun kapıyla yaklaşık 10.000 hücre yakalayın ve gerekli hücresel veri miktarına bağlı olarak hücre sayısını ayarlayın ve her tüpteki deneysel hücreleri yakalamayı tekrarlayın. İndüksiyon ve tripsinizasyondan sonra, yaklaşık 500 mikrolitrelik her bir kuyucuğun tüm içeriğini etiketli tüplere aktarın. Hücreleri 400 kez beş dakika boyunca santrifüj yapın G.Supernatant'ı attıktan sonra, numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.PBS'de seyreltilmiş 750 ila 1.000 mikrolitre PFA'daki hücreleri yeniden askıya alın ve hücre kümelerini kırmak için pipet birkaç kez yukarı ve aşağı doğru pipet yapın. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, 750 ila 1.000 mikrolitre PBS ekleyin ve tekrar birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ekleyin, ardından hücreleri oda sıcaklığında 400 kez G'de beş dakika boyunca pelet edin. Süper natantı attıktan sonra, numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın ve hücreleri gösterildiği gibi 750 ila 1.000 mikrolitre buz gibi soğuk metanol içinde yeniden askıya alın ve hücrelerin eksi 20 santigrat derece dondurucuda 30 dakika oturmasına izin verin.Kuluçkadan sonra, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle çekerken 750 ila 1.000 mikrolitre PBS ekleyin. Daha sonra hücreleri 400 kat G'de beş dakika santrifüj ettikten sonra, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın. Hücreleri 100 mikrolitrede veya etiketli birincil antikor ve pipetin altı ila sekiz kez yukarı ve aşağı doğru başka bir uygun seyreltmesinde yeniden askıya alın, ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Daha sonra, 750 ila 1.000 mikrolitre inkübasyon tamponu ve pipet çözeltisini birkaç kez yukarı ve aşağı ekleyin, ardından hücreleri 400 kez G.Next'te beş dakika boyunca santrifüj edin, hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yaparak kümeleri kırın. Her tüpün tüm içeriğini hücre süzgeçleri olan etiketli tüplere aktarın. Hücreleri doğru dalga boylarında lazerlerle uygun akış sitometri cihazlarına getirin.Cihazlar için optik kalibrasyon yapıldı. Elde edilen görüntü kullanılarak, LED için telafi değerleri hesaplandı, arka plan sinyali çıkarıldı ve piksel yoğunluğu çıkarıldı. Varyasyon katsayısı 96 kuyu arasında minimum düzeydeydi.Kalibrasyon yazılımı, konuma göre LED varyasyonunu gösterdi ve her LED'in aynı yoğunluğa normalleştirilmesi için gri bir ölçek ayarı oluşturdu. Gen ekspresyonu, LPA üzerindeki farklı ışık darbe sürelerinde floresan mikroskobu yoluyla mühendislik ürünü daha hafif hücrelerde indüklendi ve hücreler Brightfield ve GFP ekspresyonu için görüntülendi. Akış sitometrisi kullanılarak, hücreler farklı nabız uzunluğu değerlerinde indüklendi ve indüklenmemiş durumlardan dört kattan fazla değişimin popülasyon seviyesinde ölçülen gen ekspresyonunun bir doz yanıtını gösterdi.Negatif geri bildirim, daha hafif sistem için çeşitli ışık yoğunluğu değerlerini canlı veya açık olarak karşılaştırarak gösterildiği gibi beş kat gen ekspresyonu gürültü azaltma elde etti. qPCR analizi, mühendislik ürünü daha hafif hücrelerin, RNA seviyelerini, indüklenmemiş durumlardan on kattan fazla indüksiyonla doza duyarlı bir şekilde ifade ettiğini ve akış sitometrisi nicelleştirmesiyle eşleştiğini göstermiştir. Tasarlanmış daha hafif gen devresi, KRAS protein seviyelerinin ve fosforile ERK seviyelerinin artmasına neden olan artan miktarda mavi ışık gösterdi.Büyüme, hücre hareketliliği, yara iyileşmesi, proliferasyon veya invazyon testleri dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel testler yapılabilir. Bu yöntemler, kanser biyolojisi, doku farklılaşması veya ilaç direnci mekanizmaları hakkında spesifik bilgiler sağlayabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

için içi boş fiber Biyoreaktörler<em&gt; İn Vivo</em&gt; Benzeri Memeli Doku Kültürü

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Memeli hücre kültür Tekdüzen toplamları üretmek için O şeklindeki damarlarının sallayarak bir Orbital

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Stabil Kronik kemirgen Elektrofizyoloji için şırınga enjekte edilebilir Mesh elektronik

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...