Name: site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli at JoVE.com

ونود أن نشكر الدكتور ويسلي وانغ على إرساء الأساس لهذا البروتوكول وإرشاده القيم. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المنح R01GM127575 وR01GM121584) ومؤسسة ويلش (منحة A-1715).

1. البناء البلازميد
<ol><li>تبدأ من خلال تحديد البروتين الهستون الذي سيتم أسيتيلاتيد وفي أي موقع ليسين. تحور الموقع إلى وقف الكهرمان كودون (TAG) باستخدام موقع موجهة mutagenesis. ملاحظة: هناك أربعة البلازميدات المصممة سابقا المستخدمة للتعبير عن بروتينات الهستون. تم استنساخ جميع بروتينات الهستون ال...

<ol>
	<li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea:+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA.">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li><li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysyl-tRNA+synthetase:+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool.">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li><li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo.">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li><li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases.">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li><li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes.">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li><li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7.">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Gallego-Jara, J., &#201;cija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., C&#225;novas D&#237;az, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide.">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS.">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li><li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol.">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li><li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+DNA+sensing+pathways:+STING,+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses.">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li><li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGAS+produces+a+2'-5'-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING.">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+[G(2',5')pA(3',5')p]+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase.">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+PLPLRT/SD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1.">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li></ol>

من الضروري اتباع هذا البروتوكول بكل التفاصيل أثناء التجربة. النوى ليست مستقرة جدا والكثير من التجربة والخطأ قد ذهب إلى تحديد هذا البروتوكول. من المهم إزالة الرواسب في كل خطوة (أو كلما لوحظ) لأن الجسيمات يمكن أن تتداخل بسهولة مع عمليات التجميع. دائما احتفظ بعينات الهستون على الثلج إذا تم تخ?...

لقد استخدمنا PylRS و TRNAPyl لتجميع وتجميع mononucleosomes المعاد تشكيلها مع الهستونات الأسيتيlated الموقع محددة. وقد ثبت PylRS لا تقدر بثمن كأداة لتوسيع الشفرة الوراثية لإنتاج البروتينات مع تعديلات ما بعد التحويل (PTMs) وتطورت وراثيا لدمج حوالي 200 ncAAs مختلفة. PylRS يدمج في وقف الكهرمان codon، وإزالة المنافسة من الأحماض الأمينية الأخرى أثناء الترجمة. تم اكتشاف PylRS لأول مرة في archaea الميثانوجينية ، ومنذ ذلك الحين تم استخدامه في البيولوجيا الكيميائية لدمج مجموعات كيميائية تفاعلية جديدة في البروتينات1،2.
تم تطوير MmAcKRS1 من ميتانوساركينا مازي PylRS وكثيرا ما تستخدم في مختبرنا لتركيب البروتينات الأسيتيلاتيد3،4،5،6. MmAcKRS1 يسلم AcK في موقع طفرة العنبر في مرنا من اختيار أثناء الترجمة في الإشريكية القولونية. وقد استخدمت هذه التقنية سابقا لدمج ACK في K4، K9، K14، K18، K23، K27، K36، K56، K64، و K79 هيستون H3 مواقع ليسين لدراسة نشاط سيرتوين 1، 2، 6، و 7 على mononucleosomes أسيتيلاتيد4،5،6. هنا نحن بالتفصيل هذه الطريقة للتعبير عن الهستونات أسيتيلاتيد وإعادة تشكيل النيوكليوسومات الأسيتيlated.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M GuHCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyllysine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column Wash Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Variable-Flow Chemical Transfer Pump</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-077-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-TEV protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone Lysis Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Clean-Up Kit</td>
			<td>Epoch Life Sicences</td>
			<td>2360050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet Wash Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H2A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-AckRS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>137976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-3z/601</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli

يمكن التعبير بسهولة عن بروتينات الهستون الأسيتية في الإشريكية القولونية ترميز متحولة، Nε-أسيتيل ليسين (AcK) محددة ميتانوساركينا مازي بيروليسين tRNA-synthetase (MmAcKRS1) ورنا cognate (tRNAPyl)لتجميع الرتابات المعاد تشكيلها مع الهستونات المحددة الموقع. MmAcKRS1 و TRNAPyl تسليم ACK في موقع طفرة العنبر في مرنا من اختيار أثناء الترجمة في الإشريكية القولونية. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لدمج AcK في مواقع ال ليسين H3. يمكن أيضا أن تتطور بسهولة بيروليسيل-TRNA synthetase (PylRS) لدمج الأحماض الأمينية غير الكانانية الأخرى (ncAAs) لتعديل البروتين محددة الموقع أو وظيفية. هنا نحن بالتفصيل طريقة لدمج AcK باستخدام نظام MmAcKRS1 في H3 الهستون ودمج البروتينات H3 أسيتيلاتيد في mononucleosomes المعاد تشكيلها. يمكن استخدام أحاديات النوكليوسومات المعاد تشكيلها في المقايسات الكيميائية الحيوية والملزمة ، وتحديد الهيكل ، وأكثر من ذلك. يعد الحصول على النويدات أحادية النواة المعدلة أمرا حاسما لتصميم التجارب المتعلقة باكتشاف تفاعلات جديدة وفهم علم الوراثة اللاجينية.

يمكن تقييم الديمرات والتترامر والأوكتامات عن طريق تشغيل هلام صفحة SDS بنسبة 12٪ (الشكل 1 والشكل 2). هنا يمكنك أن ترى أن بعض tetramers أسيتيلاتيد لديها عائد أقل من غيرها(الشكل 1). في الواقع، كلما اقتربنا من المنطقة الأساسية، انخفض ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli at JoVE.com

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

هنا نقدم طريقة للتعبير عن بروتينات الهستون الأسيتية باستخدام توسيع الشفرة الوراثية وتجميع النيوكليوسومات المعاد تشكيلها في المختبر.

موقع محدد ليسين أسيتيل الهستونات لإعادة تشكيل النوكليوسوم باستخدام توسيع الشفرة الوراثية في الإشريكية القولونية

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em&gt; كولاي</em&gt;: تصميم وإنتاج وتنقية

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

كفاءة والخاصة بالموقع الأجسام المضادة وصفها من قبل Cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

إعادة تشكيل جسيم نووي مع الهستونات الأخت المسمى النظائر-تفاضلي

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

الطفرات موقع الموجه لفي المختبر وفي فيفو التجارب المتمثلة بالتفاعلات الحمض النووي الريبي في الإشريكيّة القولونية

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

في كل مكان في المختبر واختبارات الديوبيكيتيمنت النيوكليوسوم

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

استخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإشريكية القولونية مع الإجهاد البروتيوكسي

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...