Name: site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00
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हम इस प्रोटोकॉल और उनकी बहुमूल्य सदस्यता की बुनियाद रखने के लिए डॉ वेस्ले वांग को धन्यवाद देना चाहते हैं । इस काम को आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (अनुदान R01GM127575 और R01GM121584) और वेल्च फाउंडेशन (ग्रांट ए-1715) द्वारा समर्थित किया गया था।

1. प्लाज्मिड निर्माण
<ol><li>यह तय करके शुरू करें कि कौन सा हिस्टोन प्रोटीन एसिटिलेटेड होगा और किस lysine साइट पर। साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस का उपयोग करके साइट को एंबर स्टॉप कोडन (टैग) में म्यूटेट करें। नोट...

<ol>
	<li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea:+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA.">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li><li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysyl-tRNA+synthetase:+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool.">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li><li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo.">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li><li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases.">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li><li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes.">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li><li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7.">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Gallego-Jara, J., &#201;cija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., C&#225;novas D&#237;az, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide.">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS.">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li><li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol.">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li><li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+DNA+sensing+pathways:+STING,+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses.">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li><li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGAS+produces+a+2'-5'-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING.">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+[G(2',5')pA(3',5')p]+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase.">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+PLPLRT/SD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1.">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li></ol>

किसी प्रयोग के दौरान हर विस्तार से इस प्रोटोकॉल का पालन करना आवश्यक है। न्यूक्लियोसोम बहुत स्थिर नहीं हैं और इस प्रोटोकॉल का निर्धारण करने में बहुत अधिक परीक्षण और त्रुटि हो गई है। हर कदम (या जब भी मनाय...

हमने साइट विशिष्ट एसिटिलेटेड हिस्टटोन के साथ पुनर्गठित मोनोन्यूकोसोम को संश्लेषित करने और इकट्ठा करने के लिएपिलआरएस और ट्रान पीआईएल का उपयोग किया है। PylRS एक आनुवंशिक कोड विस्तार उपकरण के रूप में अमूल्य साबित कर दिया है पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधनों (PTMs) के साथ प्रोटीन का उत्पादन और आनुवंशिक रूप से २०० विभिंन ncAAs के बारे में शामिल करने के लिए विकसित किया गया है । PylRS अनुवाद के दौरान अन्य अमीनो एसिड से प्रतिस्पर्धा को हटाने, एक एंबर स्टॉप कोडन में शामिल किया गया है। पिलआरएस को पहली बार मेथानोजेनिक आर्किया में खोजा गया था, और तब से रासायनिक जीव विज्ञान में उपयोग किया गया है ताकि उपन्यास प्रतिक्रियाशील रासायनिक समूहों को प्रोटीन1,2में शामिल किया जा सके।
एमएमएकक्रस 1 को मेथानोसेसिना माज़ी पिलआरएस से विकसित किया गया था और अक्सर हमारी प्रयोगशाला में एसिटिलेटेड प्रोटीन के संश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता था3,4,5,6. MmAcKRS1 एस्चेरिचिया कोलाईमें अनुवाद के दौरान पसंद के एमएनए में एक एंबर उत्परिवर्तन स्थल पर एक्यूसी बचाता है। इस तकनीक का उपयोग पहले के4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, और K79 हिस्टोन H3 lysine साइटों पर AcK को शामिल करने के लिए किया गया है सिरतुइन 1, 2, 6, और 7 की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एसीटीके पर एसीके को शामिल करने के लिए एसीटी4,5,6। यहां हम इस विधि का विस्तार करते हैं ताकि एसिटिलेटेड हिस्टटोन को व्यक्त किया जा सके और एसिटिलेटेड न्यूक्लियोसोम्स का पुनर्गठन किया जा सके।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M GuHCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyllysine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column Wash Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Variable-Flow Chemical Transfer Pump</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-077-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-TEV protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone Lysis Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Clean-Up Kit</td>
			<td>Epoch Life Sicences</td>
			<td>2360050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet Wash Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H2A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-AckRS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>137976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-3z/601</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli

एसेरिचिया कोलाई में एक उत्परिवर्ती को एन्कोडिंग करने में एसीटायलेटेड हाइस्टोन प्रोटीन आसानी से व्यक्त किया जा सकता है, एनε-एसिटिल-लाइसिन (एक्क) - विशिष्ट मेथानोसिरिना माज़ी पाइरोलिन टर्ना-सिंथेटास (MmAcKRS1) और इसके कॉग्नेट टीआरएनए (टीआरएनएपिल)साइट विशिष्ट एसिटाइलेटेड हिस्टोन के साथ पुनर्गठित मोनोन्यूसोम को इकट्ठा करने के लिए। MmAcKRS1 और tRNAPyl एस्चेरिचिया कोलाईमें अनुवाद के दौरान पसंद के एमएनए में एक एंबर उत्परिवर्तन साइट पर AcK उद्धार । इस तकनीक का बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है H3 lysine साइटों पर AcK शामिल करने के लिए । साइट विशिष्ट प्रोटीन संशोधन या कार्यात्मकता के लिए अन्य गैर-कैनॉनिकल अमीनो एसिड (एनसीएए) को शामिल करने के लिए पाइरोलिसिल-टीआरएनए संश्लेषण (पीएलआर) को भी आसानी से विकसित किया जा सकता है। यहां हम एक विधि का विस्तार करते हैं जो MmAcKRS1 प्रणाली का उपयोग करते हुए हिस्टोन एच 3 में शामिल किया गया है और एसिटिलेटेड एच 3 प्रोटीन को पुनर्गठित मोनोन्यूक्लियोसोम्स में एकीकृत करता है। जैव रासायनिक और बाध्यकारी परख, संरचना निर्धारण, और अधिक में एसीस्टाइलेटेड पुनर्गठित मोनोन्यूकोसोम का उपयोग किया जा सकता है। नई बातचीत की खोज और एपिजेनेटिक्स को समझने से संबंधित प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए संशोधित मोनोन्यूक्लियोसोम प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।

डिमर्स, टेट्रामर्स और ऑक्टैमर्स का आकलन 12% एसडीएस पेज जेल(चित्रा 1 और चित्रा 2)चलाकर किया जा सकता है । यहां आप देख सकते हैं कि कुछ एसिटिलेटेटेड टेट्रामर्स में दूसरों की ?...

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

यहां हम आनुवंशिक कोड विस्तार का उपयोग करके एसिटिलेटेड हिस्टोन प्रोटीन को व्यक्त करने और विट्रो में पुनर्गठित न्यूक्लियोसोम को इकट्ठा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

एस्चेरिचिया कोलाई में जेनेटिक कोड विस्तार का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम पुनर्गठन के लिए हिस्टोन्स की साइट विशिष्ट लाइसिन एसिटिलेशन

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

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Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

साइट-निर्देशित Mutagenesis इन विट्रो में और Vivo प्रयोगों उदाहरण में आरएनए बातचीत के साथ ई कोलाई

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

इन विट्रो Ubicuitination और न्यूक्लिओसोमल हिस्टोन्स के Deubiquitination परख

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

प्रोटोटॉक्सिक स्ट्रेसर के साथ एस्चेरिचिया कोलाई के उपचार के बाद प्रोटीन समुच्चय का निष्कर्षण और दृश्य

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...