Name: site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Уэсли Вана за то, что он заложил основу для этого протокола и его ценного наставничества. Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (Grants R01GM127575 и R01GM121584) и Фондом Уэлча (Grant A-1715).

1. Плазмидная конструкция
<ol><li>Начните с принятия решения, какой белок гистон будет ацетилирован и на котором лизин сайта. Мутировать сайт к янтарной остановки кодон (TAG) с помощью сайта направлены мутагенез. ПРИМЕЧАНИЕ: Есть четыре ранее разработанных плазмидов, используемых для выра...

<ol>
	<li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea:+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA.">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li><li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysyl-tRNA+synthetase:+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool.">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li><li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo.">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li><li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases.">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li><li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes.">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li><li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7.">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Gallego-Jara, J., &#201;cija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., C&#225;novas D&#237;az, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide.">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS.">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li><li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol.">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li><li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+DNA+sensing+pathways:+STING,+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses.">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li><li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGAS+produces+a+2'-5'-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING.">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+[G(2',5')pA(3',5')p]+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase.">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+PLPLRT/SD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1.">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li></ol>

Важно следовать этому протоколу во всех деталях во время эксперимента. Нуклеосомы не очень стабильны, и при определении этого протокола было допущено много проб и ошибок. Это ключ к удалению осадков на каждом шагу (или при наблюдении), потому что частицы могут легко вмешиваться в процес?...

Мы использовали PylRS и tRNAPyl для синтеза и сборки восстановленных мононуклеосом с конкретными ацетилированными гистонами. PylRS оказался бесценным в качестве инструмента расширения генетического кода для производства белков с пост-трансляционными модификациями (PTMs) и был генетически эволюционировал, чтобы включить около 200 различных ncAAs. PylRS включает в себя на янтарной остановке кодон, устраняя конкуренцию с другими аминокислотами во время перевода. PylRS был впервые обнаружен в метамфетаминовых археев, и с тех пор был использован в химической биологии для включения новых реактивных химическихгрупп в белки 1,2.
MmAcKRS1 был создан из метаносаркина mazei PylRS и часто используется в нашей лаборатории для синтеза ацетилированныхбелков 3,4,5,6. MmAcKRS1 поставляет AcK на место мутации янтаря в мРНК выбора во время перевода в Escherichia coli. Этот метод ранее был использован для включения AcK на K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, и K79 histone H3 лизин сайтов для изучения деятельности Sirtuin 1, 2, 6, и 7 на ацетилированных мононуклеозом4,5,6. Здесь мы подробно этот метод, чтобы выразить ацетилированные гистоны и восстановить ацетилированные нуклеосомы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M GuHCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyllysine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column Wash Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Variable-Flow Chemical Transfer Pump</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-077-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-TEV protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone Lysis Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Clean-Up Kit</td>
			<td>Epoch Life Sicences</td>
			<td>2360050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet Wash Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H2A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-AckRS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>137976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-3z/601</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli

Ацетилированные белки гистона могут быть легко выражены в Escherichia coli кодирования мутанта, Nε-ацетил-лизин (AcK)-специфический Метаносарчина Мази пирролизин тРНК-синтезаз (MmAcKRS1) и его cognate tRNA (tRNAPyl) для сборки восстановленных мононуклеом с сайта конкретных ацетилированных гистонов. MmAcKRS1 и tRNAPyl доставляют AcK на место мутации янтаря в мРНК выбора во время перевода в Escherichia coli. Этот метод широко используется для включения AcK на участках лизина H3. Пирролизил-тРНА синтезаз (PylRS) также может быть легко развивались для включения других неканонических аминокислот (ncAAs) для сайта конкретной модификации белка или функционализации. Здесь мы подробно метод для включения AcK с использованием системы MmAcKRS1 в гистон H3 и интегрировать ацетилированные белки H3 в восстановленных мононуклеозом. Ацетилированные восстановленные мононуклеосомы могут быть использованы в биохимических и связывающих анализах, определении структуры и многое другое. Получение модифицированных мононуклеом имеет решающее значение для разработки экспериментов, связанных с открытием новых взаимодействий и пониманием эпигенетики.

Димеры, тетрамеры и октамеры можно оценить, запуская гель SDS PAGE 12%(рисунок 1 и рисунок 2). Здесь вы можете видеть, что некоторые из ацетилированных теттрамеров имеют более низкую урожайность, чем другие(рисунок 1). На самом д?...

Watch this Scientific Journal Video about Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli at JoVE.com

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Здесь мы представляем метод выражения ацетилированных белков гистона с помощью расширения генетического кода и собираем восстановленные нуклеосомы в пробирке.

Сайт Конкретные лизин ацетиляции гистонов для нуклеосомы Восстановление с использованием генетического расширения кода в Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;: Проектирование, производство и очистка

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Обнаружение рН-зависимой активности<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Сопровождающий HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; и<em&gt; В Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Эффективная и сайта специфических антител к Этикетировочное штаммом раскрученной азида-алкиновая циклоприсоединения

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Количественная оценка изобилие и зарядки уровней передачи РНК в Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Крупномасштабное производство рекомбинантных молекул РНК на круговой лески с помощью вироиды производные системы в Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Сайт Направленный мутагенез для In Vitro и In Vivo экспериментов примером взаимодействия РНК в Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

В Vitro Увселицивание и Deubiquitination Анализы Нуклеосомальных Хистонов

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Экстракция и визуализация белковых агрегатов после лечения кишечной палочки протеотоксическим стрессором

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...