Name: wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 og 18H05491) til MT, National Science Foundation (IOS1557899 og MCB2016177) og National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G og 80NSSC19K0126) til SG.

1. Fremstilling af plantemateriale
<ol><li>I et 1,5 mL mikrorør steriliseres frøene af Arabidopsis thaliana (Kol-0 tiltrædelse) anlæg, der udtrykker enten GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR ved at ryste med 20% (v/ v) NaClO i 3 minutter og derefter vaske 5 gange med sterilt destilleret vand. BEMÆRK: De transgene linjer i Arabidopsis, der udtrykker GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR, er tidligere beskrevet6.</li>
	<li>I en steril hætte, så 13 overflade-steriliserede frø på en 10 cm ...

Systemisk signalering er vigtig for planter til at reagere på lokaliserede eksterne miljømæssige stimuli og derefter at opretholde deres homøostase på et helt anlægsniveau. Selv om de ikke er udstyret med et avanceret nervesystem som dyr, de beskæftiger hurtig kommunikation både inden for og mellem organer baseret på faktorer som mobile elektriske (og muligvis hydrauliske) signaler og formering bølger af ROS og Ca2 + 46,47. Den ovenfor beskr...

Planter kan ikke undslippe fra biotiske belastninger, f.eks. insekter, der fodrer dem, så de har udviklet sofistikerede stresssensorer og signaltransduktionssystemer til at opdage og derefter beskytte sig mod udfordringer som planteæder1. Ved sår eller planteædende angreb indleder planter hurtige forsvarsresponser, herunder akkumulering af phytohormone jasmonsyre (JA) ikke kun på det sårede sted, men også i ubeskadigede distale organer2. Denne JA så både udløser forsvar svar i direkte beskadigede væv og forebyggende inducerer forsvar i ubeskadigede dele af planten. I Arabidopsisblev akkumulering af JA induceret af sår opdaget i distale, intakte blade inden for få minutter efter skader andre steder i planten, hvilket tyder på, at et hurtigt og langdistancesignal overføres fra det sårede blad3. Flere kandidater, såsom Ca2 +, reaktiv ilt arter (ROS), og elektriske signaler, er blevet foreslået at tjene som disse langdistance sår signaler i anlæg4,5.
Ca2+ er et af de mest alsidige og allestedsnærværende andet budbringerelementer i eukaryote organismer. I planter forårsager larve tygge og mekanisk sår drastiske stigninger i den cytosolske Ca2 + koncentration ([Ca2 +]cyt) både i det sårede blad og i uhelede fjerne blade6,7. Dette systemiske Ca2+ signal modtages af intracellulære Ca2+-sensing proteiner, som fører til aktivering af downstream forsvarssignalveje, herunder JA biosyntese8,9. På trods af talrige sådanne rapporter, der støtter betydningen af Ca2+-signaler i skudsårsresponser, er oplysninger om de rumlige og tidsmæssige karakteristika ved Ca2+-signaler fremkaldt af sår begrænset.
Realtidsbilleddannelse ved hjælp af genetisk kodede Ca2+-indikatorer er et effektivt værktøj til at overvåge og kvantificere den rumlige og tidsmæssige dynamik i Ca2+-signaler. Til dato er der udviklet versioner af sådanne sensorer, der muliggør visualisering af Ca2 + signaler på niveau med en enkelt celle, til væv, organer og endda hele planter10. Den første genetisk kodede biosensor for Ca2+, der blev anvendt i planter, var det bioluminescerende protein aequorin, der stammer fra vandmændene Aequorea victoria11. Selv om dette chemiluminescent protein er blevet brugt til at opdage Ca2 + ændringer som reaktion på forskellige belastninger i planter12,13,14,15,16,17,18, det er ikke velegnet til real-time billeddannelse på grund af den ekstremt lave selvlysende signal, den producerer. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserede Ca2+ indikatorer, såsom de gule cameleoner, er også blevet anvendt med succes til at undersøge dynamikken i en række Ca2+ signalhændelser i anlæg19,20,21,22,23,24. Disse sensorer er kompatible med billeddannelse tilgange og oftest er sammensat af Ca2 + bindende protein calmodulin (CaM) og en CaM-bindende peptid (M13) fra en myosin lyskæde kinase, alle smeltet mellem to fluorophore proteiner, generelt en Cyan Fluorescerende Protein (CFP) og en gul fluorescerende Protein variant (YFP)10. Ca2+ binding til CaM fremmer samspillet mellem CaM og M13, hvilket fører til en kropsbygningsændring af sensoren. Denne ændring fremmer energioverførsel mellem den fælles fiskeripolitik og YFP, hvilket øger YFP'ens fluorescensintensitet, samtidig med at fluorescensemissionen mindskes fra den fælles fiskeripolitik. Overvågning af dette skift fra den fælles fiskeripolitik til YFP-fluorescens giver derefter et mål for stigningen i Ca2+-niveau. Ud over disse FRET sensorer, enkelt fluorescerende protein (FP)-baserede Ca2 + biosensorer, såsom GCaMP og R-GECO, er også kompatible med plante billeddannelse tilgange og er meget udbredt til at studere [Ca2 +]cyt ændringer på grund af deres høje følsomhed og brugervenlighed25,26,27,28,29,30. GCaMPs indeholder en enkelt cirkulært permuteret (cp) GFP, igen smeltet til CaM og M13 peptid. Ca2+-afhængig interaktion mellem CaM og M13 forårsager en kropsbygningsændring i sensoren, der fremmer et skift i protonationstilstanden af cpGFP, hvilket øger dets fluorescerende signal. Således, som Ca2 + niveauer stiger, cpGFP signalet stiger.
For at undersøge dynamikken i Ca2 + signaler genereret som reaktion på mekanisk sår eller planteæder fodring, har vi brugt transgene Arabidopsis thaliana planter udtrykke en GCaMP variant, GCaMP3, og en bred felt fluorescens mikroskop6. Denne tilgang har formået at visualisere hurtig transmission af et langdistance Ca2 + signal fra sårstedet på et blad til hele planten. Således blev en stigning i [Ca2 +]cyt straks opdaget på sårstedet, men dette Ca2 + signal blev derefter overført til de nærliggende blade gennem vaskulaturen inden for få minutter efter sår. Desuden fandt vi, at overførslen af dette hurtige systemiske sårsignal afskaffes i Arabidopsis-planter med mutationer i to glutamatreceptorlignende gener, Glutamat receptor som (GLR), GLR3.3 og GLR3.66. Den GLRs synes at fungere som amino-syre gated Ca2 + kanaler involveret i forskellige fysiologiske processer, herunder sårrespons3, pollen rør vækst31, rod udvikling32, koldrespons 33, og medfødte immunitet34. På trods af denne velkendte, brede fysiologiske funktion af GLR'erne er oplysninger om deres funktionelle egenskaber, såsom deres ligand specificitet, ion selektivitet og subcellulær lokalisering, begrænset35. Nylige undersøgelser rapporterede imidlertid, at GLR3.3 og GLR3.6 er lokaliseret i henholdsvis phloem og xylem. Plant GLRs har ligheder med ionotrope glutamatreceptorer (iGluRs)36 hos pattedyr, som aktiveres af aminosyrer, såsom glutamat, glycin og D-serin i pattedyrsnervesystemet37. Faktisk har vi vist, at anvendelsen af 100 mM glutamat, men ikke andre aminosyrer, på sårstedet fremkalder et hurtigt, langdistance Ca2 + signal i Arabidopsis, hvilket indikerer, at ekstracellulær glutamat sandsynligvis fungerer som et sårsignal i planter6. Dette svar er afskaffet i glr3.3/glr3.6 mutant tyder på, at glutamat kan virke gennem en eller begge af disse receptor-lignende kanaler og ja, AtGLR3.6 blev for nylig vist sig at være gated af disse niveauer af glutamat38.
I planter er glutamat ud over sin rolle som strukturel aminosyre også blevet foreslået som en vigtig udviklingsregulator39; dens rumlige og tidsmæssige dynamik er imidlertid dårligt forstået. Ligesom for Ca2+er der udviklet flere genetisk kodede indikatorer for glutamat til at overvåge dynamikken i denne aminosyre i levende celler40,41. iGluSnFR er en GFP-baseret enkelt-FP glutamat biosensor bestående af cpGFP og et glutamat bindende protein (GltI) fra Escherichia coli42,43. Den kropsbygningsændring af iGluSnFR, der er forårsaget af glutamatbinding til GltI, resulterer i en forbedret GFP-fluorescensemission. For at undersøge, om ekstracellulær glutamat fungerer som et signalmolekyle i plantens sårrespons, forbandt vi iGluSnFR-sekvensen med den grundlæggende chitinase signal peptidsekretionssekvens (CHIB-iGluSnFR) for at lokalisere denne biosensor i det apoplastiske rum6. Denne fremgangsmåde muliggjorde billeddannelse af eventuelle ændringer i koncentrationen af apoplastisk glutamat ([Glu]apo) ved hjælp af transgene Arabidopsis-planter, der udtrykker denne sensor. Vi opdagede hurtige stigninger i iGluSnFR-signalet på det sårende sted. Disse data understøtter tanken om, at glutamat lækker ud af de beskadigede celler / væv til apoplast ved sår og fungerer som et skadesignal, der aktiverer GLR'erne og fører til langdistance Ca2 + signal i planter6.
Her beskriver vi en plantedækkende realtidsbilleddannelsesmetode ved hjælp af genetisk kodede biosensorer til at overvåge og analysere dynamikken i langdistance Ca2+ og ekstracellulære glutamatsignaler som reaktion på sårende6. Tilgængeligheden af bredfelts fluorescensmikroskopi og transgene planter, der udtrykker genetisk kodede biosensorer, giver en kraftfuld, men let implementeret tilgang til at detektere hurtigt transmitterede langdistancesignaler, såsom Ca2+ bølger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>072-00501</td>
			<td>Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) medium</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>392-00591</td>
			<td>composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ25 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR analysis</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plastic Petri dish</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis

Planter reagerer på mekaniske belastninger såsom sår og planteædende ved at fremkalde forsvarsresponser både i de beskadigede og i de distale ubeskadigede dele. Ved såning af et blad sker der en stigning i cytosolic calciumionkoncentration (Ca2+ signal) på såret. Dette signal sendes hurtigt til ubeskadigede blade, hvor forsvarsresponser aktiveres. Vores seneste forskning viste, at glutamat lækker fra de sårede celler i bladet i apoplast omkring dem tjener som et sår signal. Dette glutamat aktiverer glutamat receptor-lignende Ca2 + gennemtrængelige kanaler, som derefter fører til langdistance Ca2 + signal formering i hele planten. Disse hændelsers rumlige og tidsmæssige karakteristika kan indfanges med realtidsbilleddannelse af levende planter, der udtrykker genetisk kodede fluorescerende biosensorer. Her introducerer vi en billeddannelsesmetode i hele fabrikken til at overvåge dynamikken i både Ca2+-signalerne og ændringer i apoplastisk glutamat, der opstår som reaktion på sår. Denne fremgangsmåde bruger et bredfelts fluorescensmikroskop og transgene Arabidopsis-planter, der udtrykker grønne fluorescerende protein (GFP)-baserede Ca2+ og glutamatbiosensorer. Derudover præsenterer vi metode til let at fremkalde sår-induceret, glutamat-udløst hurtig og langdistance Ca2 + signal formering. Denne protokol kan også anvendes på undersøgelser af andre anlæg understreger at hjælpe med at undersøge, hvordan anlægget systemiske signalering kan være involveret i deres signalering og respons netværk.

Signaludbredelse af [Ca2+]cyt og [Glu]apo som reaktion på sår er præsenteret i figur 3, figur 4, Movie S1og Movie S2. Skæring af bladbladets petiole 1 i planter, der udtrykker GCaMP3 (ved 0 s), førte til en betydelig stigning i [Ca2+]cyt, der hurtigt blev induceret lokalt gennem vaskulaturen (ved 40 s) (Figur 3</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Ekstracellulær glutamat-udløst systemisk calcium signalering er afgørende for induktion af planteforsvar svar på mekaniske sår og planteædende angreb i planter. Denne artikel beskriver en metode til at visualisere den rumlige og tidsmæssige dynamik i begge disse faktorer ved hjælp af Arabidopsis thaliana planter udtrykke calcium- og glutamat-følsomme fluorescerende biosensorer.

Wide-Field, Real-Time Imaging af lokale og systemiske sårsignaler i Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Denne protokol tillader billeddannelse i hele realtid af aktiviteten i det plante systemiske signalsystem ved at overvåge dynamikken i calcium og apoplastisk glutamat som reaktion på sår. Denne billeddannelsesmetode i hele anlægget i realtid giver et robust værktøj til at forstå dynamikken i de hurtige og lange afstande i planter, der kombinerer en høj rumlig tidsmæssig opløsning og brugervenlighed. Denne protokol giver mulighed for at give et nyt indblik i de rumlige og tidsmæssige egenskaber ved systemets calciumsignalering i både biotiske og abiotiske stressresponser hos andre plantearter.Demonstration af proceduren vil blive Takuya Uemura, en post ph.d.-stipendiat fra mit laboratorium. Begynd med at tænde for det motoriserede lysstofrørsmikroskop, der er udstyret med en 1X objektiv linse og et SCMOS-kamera. Konfigurer enhedens indstillinger til bestråling med excitationslys centreret på 470 nanometer, valgt ved hjælp af et filter, der sender lys mellem 450 og 490 nanometer.Anskaffe emissionslys ved hjælp af et filter, der sender mellem 510 og 560 nanometer. Fjern låget fra skålen, der indeholder planten, og læg det under den objektive linse. Tjek lysstofrøret fra anlægget.Vent derefter i ca. 30 minutter i mørket, indtil planterne er tilpasset de nye miljøforhold. Juster fokus og forstørrelse for at se hele planten i synsfeltet. Derefter indstilles anskaffelsesparametrene til at registrere de fluorescerende signaler ved hjælp af mikroskoper billedbehandling software.Indstil optagelsestiden til 11 minutter. Billede i fem minutter, før eksperimentet påbegyndes for at akklimatisere planten til bestråling af blåt lys fra mikroskopet, og begynd derefter at optage. At bestemme den gennemsnitlige baseline fluorescens rekord mindst 10 billeder før sår eller glutamat ansøgning.For real-time billeddannelse af sår induceret cytosol calcium ion og apoplastisk glutamat koncentration ændringer, skære petiole eller den midterste region af blade L1 med en saks. For real-time billeddannelse af glutamat udløste cytosol calcium ændringer, skåret cirka en millimeter fra spidsen af blade L1 på tværs af de vigtigste vene med en saks. Efter mindst 20 minutter påføres 10 mikroliter på 100 millimolar glutamat på bladets afskårne overflade.For fluorescensintensitetsanalyse over tid skal du definere en interesseregion på det sted, hvor fluorescensintensiteten skal analyseres. Definer to ROI'er til hastighedsberegningen af calciumbølgen. I billedbehandlingssoftwaren skal du klikke på tidsmåling, definere og cirkel.Mål afstanden mellem de to regioner ved at klikke på anmærkninger og måling, længde og enkel linje. Mål de rå florescence værdier i hver ROI over tid ved at klikke på foranstaltning, derefter eksportere de rå data til regneark software, for at konvertere fluorescerende signal til tal på hvert tidspunkt. Bestem den oprindelige fluorescensværdi, der er guddommelig som F nul, ved at beregne gennemsnittet F over de første 10 rammer i de registrerede data, og normaliser derefter F-dataene som beskrevet i tekstmanuskriptet.For calciumhastighedsbølgeanalyse defineres et signifikant signalstigningspunkt over de præstimulerede værdier som udtryk for påvisning af en calciumforøgelse i hvert investeringsafkast. Beregn tidsforskellen i calciumforøgelsen mellem de to ROI'er og afstanden mellem dem for at bestemme velocities af enhver calciumbølge. Formering af en sårudløst ændring i koncentrationerne af den cytosoliske calciumion og apoplastisk glutamat er vist her.Skæring af petiole af et blad i planter, der udtrykker GCaMP-3 førte til en betydelig stigning i calcium. Det blev induceret lokalt og derefter spredt over hele vaskulaturen. Signalet blev hurtigt forplantet til naboblade inden for få minutter.Ved at skære et blad og planter udtrykke grundlæggende chitinase jeg lim sniffer, en hurtig apoplastisk glutamat stigning blev observeret omkring cut regionen. Inden for få minutter formerede signalet sig også gennem vaskulaturen. For real-time billeddannelse af calcium signal formering udløst af anvendelsen af glutamat, kanten af et blad i planter udtrykke CCaMP-3 blev skåret.Dette forårsagede en lokal cytosolic calcium ion koncentration stigning, men signalet forsvandt inden for et par minutter. Efter ca. 10 minutter blev glutamat påført den afskårne overflade, hvilket forårsagede en hurtig lokal stigning i koncentrationen af cytosolsk calcium og derefter formering af dette signal til distale blade. For at måle ændringerne i en fast calciumkoncentration forårsaget af sår i det systemiske blad blev tidsændringen af GCaMP-3-signalintensiteten målt i to interesseregioner.Apoplastisk glutamatkoncentration ændringer som reaktion på mekaniske skader blev målt så godt. Glutamatsignaturen viste en enkelt top ca. 100 sekunder efter sår. Dette eksperiment bør udføres under temperatur- og fugtighedskontrollerede forhold, fordi det er forhøjet af ændringer i disse miljøforhold.Denne protokol giver mulighed for at give indsigt i de molekylære mekanismer, der ligger til grund for langdistance signalering ved hjælp af mutanter, at de defekte og formodede elementer i laboratoriet signalering system.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Unit 1

Principles of Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time Imaging af Single Engineered RNA-transkripter i levende celler Brug Ratiometrisk bimolekylær Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Måling rumlige og tidslige Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i Arabidopsis Planter

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i dyrkede pattedyrceller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baseret real-time PCR metoder til kvantitativ måling af microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Real-time Imaging af Plant Cell Surface Dynamics med variabel vinkel epifluorescens Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Lokale Field Fluorescens Mikroskopi: Billedbehandling Cellular Signaler i intakte hjerter

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

Anvendelse af genetisk indkodede fluorescerende nitrogenoxid (NO •) Probes, de geNOps, for Real-time Imaging af NO • Signaler i enkeltceller

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...