Name: wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Société japonaise pour la promotion de la science (17H05007 et 18H05491) à MT, à la National Science Foundation (IOS1557899 et MCB2016177) et à la National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G et 80NSSC19K0126) à SG.

1. Préparation du matériel végétal
<ol><li>Dans un microtube de 1,5 mL, stériliser en surface les graines de la plante Arabidopsis thaliana (Col-0 accession) exprimant soit GCaMP3, soit CHIB-iGluSnFR en secouant avec 20% (v/v) de NaClO pendant 3 min, puis laver 5 fois avec de l’eau distillée stérile. NOTE: Les lignées transgéniques d’Arabidopsis exprimant GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR ont été décrites précédemment6.</li>
	<li>Dans une hotte stérile, semez 13 gra...

La signalisation systémique est importante pour que les plantes réagissent à des stimuli environnementaux externes localisés, puis maintiennent leur homéostasie à un niveau de plante entière. Bien qu’ils ne soient pas équipés d’un système nerveux avancé comme les animaux, ils emploient une communication rapideà la fois à l’intérieur et entre les organes en fonction de facteurs tels que les signaux électriques mobiles (et éventuellement hydrauliques) et les ondes de propagation de ROS et<s...

Les plantes ne peuvent pas échapper aux stress biotiques, par exemple les insectes qui s’en nourrissent, elles ont donc développé des systèmes sophistiqués de détection du stress et de transduction des signaux pour détecter et ensuite se protéger contre des défis tels que l’herbivorie1. Lors d’une blessure ou d’une attaque herbivore, les plantes déclenchent des réponses de défense rapides, y compris l’accumulation de l’acide jasmonique phytohormone (JA) non seulement sur le site blessé, mais également dans les organes distaux intacts2. Ce JA déclenche alors à la fois des réponses de défense dans les tissus directement endommagés et induit préventivement des défenses dans les parties intactes de la plante. Chez Arabidopsis,l’accumulation de JA induite par la blessure a été détectée dans des feuilles distales et intactes en quelques minutes seulement après avoir été endommagées ailleurs dans la plante, ce qui suggère qu’un signal rapide et à longue distance est transmis à partir de la feuille blessée3. Plusieurs candidats, tels queCa2+,les espèces réactives de l’oxygène (ROS), et les signaux électriques, ont été proposés pour servir de signaux enroulés à longue distance dans les plantes4,5.
Ca2+ est l’un des éléments messagers deuxièmes les plus polyvalents et les plus omniprésents dans les organismes eucaryotes. Chez les plantes, la mastication des chenilles et les blessures mécaniques provoquent des augmentations drastiques de la concentration cytosolique deCa2+ ([Ca2+]cyt)à la fois dans la feuille blessée et dans les feuilles éloignées non enroulées6,7. Ce signal systémiqueCa2+ est reçu par des protéines de détectionca2+intracellulaires, qui conduisent à l’activation des voies de signalisation de défense en aval, y compris la biosynthèse JA8,9. En dépit de nombreux tels rapports soutenant l’importance des signaux de Ca2+ dans des réponses de blessure d’usine, l’information sur les caractéristiques spatiales et temporelles des signaux de Ca2+ induits par blessure est limitée.
L’imagerie en temps réel à l’aide d’indicateurs Ca2+ génétiquement codés est un outil puissant pour surveiller et quantifier la dynamique spatiale et temporelle des signaux Ca2+. À ce jour, des versions de ces capteurs ont été développées qui permettent la visualisation des signaux Ca2+ au niveau d’une seule cellule, vers des tissus, des organes et même des plantes entières10. Le premier biocapteur génétiquement codé pour Ca2+ utilisé dans les plantes était la protéine bioluminescente aequorine dérivée de la méduse Aequorea victoria11. Bien que cette protéine chimiluminescente ait été utilisée pour détecter les changements deCa2+ en réponse à diverses contraintes chez les plantes12,13,14,15,16,17,18,elle n’est pas bien adaptée à l’imagerie en temps réel en raison du signal luminescent extrêmement faible qu’elle produit. Les indicateurs Ca2+ basés sur le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET), tels que les caméléons jaunes, ont également été utilisés avec succès pour étudier la dynamique d’une gamme d’événements de signalisation Ca2 + dans les plantes19,20,21,22,23,24. Ces capteurs sont compatibles avec les approches d’imagerie et sont le plus souvent composés de la protéine de liaison Ca2+ calmoduline (CaM) et d’un peptide de liaison au CaM (M13) à partir d’une kinase à chaîne légère de myosine, toutes fusionnées entre deux protéines fluorophores, généralement une protéine fluorescente cyan (CFP) et une variante de protéine fluorescente jaune (YFP)10. Ca2+ se liant au CaM favorise l’interaction entre le CaM et le M13 conduisant à un changement conformationnel du capteur. Ce changement favorise le transfert d’énergie entre le CFP et le YFP, ce qui augmente l’intensité de fluorescence du YFP tout en diminuant l’émission de fluorescence du CFP. La surveillance de ce passage de la CFP à la fluorescence YFP fournit ensuite une mesure de l’augmentation du niveau de Ca2 +. En plus de ces capteurs FRET, les biocapteurs Ca2+ à base de protéines fluorescentes uniques (FP), tels que GCaMP et R-GECO, sont également compatibles avec les approches d’imagerie végétale et sont largement utilisés pour étudier les changementsde cytaires [Ca2+ ] en raison de leur sensibilité élevée et de leur facilité d’utilisation25,26,27,28,29,30. Les GCaMPs contiennent un seul GFP permuté circulairement (cp), à nouveau fusionné au CaM et au peptide M13. L’interaction dépendante du Ca2+entre le CaM et le M13 provoque un changement conformationnel dans le capteur qui favorise un changement dans l’état de protonation du cpGFP, améliorant ainsi son signal fluorescent. Ainsi, à mesure que les niveaux de Ca2+ augmentent, le signal cpGFP augmente.
Pour étudier la dynamique des signaux Ca2+ générés en réponse à une blessure mécanique ou à une alimentation herbivore, nous avons utilisé des plantes transgéniques Arabidopsis thaliana exprimant une variante GCaMP, GCaMP3, et un microscope à fluorescence à large champ6. Cette approche a réussi à visualiser la transmission rapide d’un signal Ca2+ longue distance du site de la plaie sur une feuille à la plante entière. Ainsi, une augmentation de [Ca2+]cyt a été immédiatement détectée à l’emplacement de blessure mais ce signal de Ca2+ a été alors propagé aux feuilles voisines par la vascularisation dans quelques minutes de blessure. En outre, nous avons constaté que la transmission de ce signal de plaie systémique rapide est abolie dans les plantes Arabidopsis avec des mutations dans deux gènes récepteur-comme de glutamate, glutamate récepteur comme (GLR), GLR3.3, et GLR3.66. Les GLR semblent fonctionner comme des canaux Ca2+ à capté d’acides aminés impliqués dans divers processus physiologiques, y compris la réponse de la plaie3,la croissance du tubepollinique 31,le développement des racines32,la réponse au froid33et l’immunité innée34. Malgré cette fonction physiologique large et bien comprise des GLRs, les informations sur leurs propriétés fonctionnelles, telles que leur spécificité de ligand, leur sélectivité ionique et leur localisation subcellulaire, sont limitéesà 35. Cependant, des études récentes ont rapporté que GLR3.3 et GLR3.6 sont localisés dans le phloème et le xylème, respectivement. Les GLR végétaux présentent des similitudes avec les récepteurs ionotropes du glutamate (iGluRs)36 chez les mammifères, qui sont activés par des acides aminés, tels que le glutamate, la glycine et la D-sérine dans le système nerveux des mammifères37. En effet, nous avons démontré que l’application de glutamate de 100 mM, mais pas d’autres acides aminés, sur le site de la plaie induit un signalCa2+ rapide et à longue distance chez Arabidopsis,indiquant que le glutamate extracellulaire agit probablement comme un signal de plaie dans les plantes6. Cette réponse est supprimée dans le mutant glr3.3/glr3.6 suggérant que le glutamate peut agir par l’un ou les deux canaux de type récepteur et en effet, AtGLR3.6 s’est récemment avéré être fermée par ces niveaux de glutamate38.
Dans les plantes, en plus de son rôle d’acide aminé structurel, le glutamate a également été proposé comme régulateur clé du développement39; cependant, sa dynamique spatiale et temporelle est mal comprise. Tout comme pour leCa2+,plusieurs indicateurs génétiquement codés pour le glutamate ont été développés pour surveiller la dynamique de cet acide aminé dans les cellules vivantes40,41. iGluSnFR est un biocapteur de glutamate mono-FP à base de GFP composé de cpGFP et d’une protéine de liaison au glutamate (GltI) d’Escherichia coli42,43. Le changement conformationnel d’iGluSnFR, qui est induit par la liaison de glutamate à GltI, a comme conséquence une émission augmentée de fluorescence de GFP. Pour étudier si le glutamate extracellulaire agit comme une molécule de signalisation dans la réponse de la plaie végétale, nous avons connecté la séquence iGluSnFR avec la séquence de sécrétion peptidique signal de chitinase de base (CHIB-iGluSnFR) pour localiser ce biocapteur dans l’espace apoplasique6. Cette approche a permis l’imagerie de tout changement dans la concentration de glutamate apoplasique ([Glu]apo)en utilisant des plantes transgéniques d’Arabidopsis exprimant ce capteur. Nous avons détecté des augmentations rapides du signal d’iGluSnFR à l’emplacement de blessure. Ces données soutiennent l’idée que le glutamate s’échappe des cellules / tissus endommagés vers l’apoplaste lors de la blessure et agit comme un signal de dommage activant les GLRs et conduisant au signal Ca2 + à longue distance dans les plantes6.
Ici, nous décrivons une méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante utilisant des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller et analyser la dynamique des signaux Ca2+ à longue distance et extracellulaires du glutamate en réponse à la blessure6. La disponibilité de la microscopie à fluorescence à large champ et de plantes transgéniques exprimant des biocapteurs génétiquement codés fournit une approche puissante, mais facile à mettre en œuvre pour détecter les signaux à longue distance transmis rapidement, tels que les ondes Ca2 +.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>072-00501</td>
			<td>Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) medium</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>392-00591</td>
			<td>composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ25 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR analysis</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plastic Petri dish</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis

Les plantes réagissent aux contraintes mécaniques telles que la blessure et l’herbivorie en induisant des réponses de défense à la fois dans les parties endommagées et dans les parties distales non endommagées. Lors du enroulement d’une feuille, une augmentation de la concentration cytosolique d’ions calcium (signal Ca2+) se produit sur le site de la plaie. Ce signal est rapidement transmis aux feuilles intactes, où les réponses de défense sont activées. Nos recherches récentes ont révélé que le glutamate qui fuit des cellules blessées de la feuille dans l’apoplaste qui les entoure sert de signal de plaie. Ce glutamate active les canaux perméables Ca2+ de type récepteur du glutamate, ce qui conduit ensuite à la propagation du signal Ca2+ à longue distance dans toute la plante. Les caractéristiques spatiales et temporelles de ces événements peuvent être capturées avec l’imagerie en temps réel de plantes vivantes exprimant des biocapteurs fluorescents génétiquement codés. Ici, nous introduisons une méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante pour surveiller la dynamique des signaux Ca2 + et des changements dans le glutamate apoplasique qui se produisent en réponse à la blessure. Cette approche utilise un microscope à fluorescence à large champ et des plantes arabidopsis transgéniques exprimant des biocapteurs Ca2+ et glutamate à base de protéines fluorescentes vertes (GFP). En outre, nous présentons la méthodologie pour obtenir facilement la propagation rapide et à longue distance causée par la blessure et glutamate-déclenchée de signal de Ca2+. Ce protocole peut également être appliqué à des études sur d’autres contraintes de la plante pour aider à étudier comment la signalisation systémique de la plante pourrait être impliquée dans leurs réseaux de signalisation et de réponse.

La propagation du signal de[Ca2+]cyt et [Glu]apo en réponse à la blessure est présentée à la figure 3, à la figure 4, au film S1et au film S2. La coupe du pétiole de la feuille 1 chez les plantes exprimant GCaMP3 (à 0 s) a conduit à une augmentation significative ducyte [Ca2+]qui a été rapidement induite localement par la vasculari...

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Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

La signalisation systémique glutamate-déclenchée extracellulaire de calcium est critique pour l’induction des réponses de défense des plantes à la blessure mécanique et à l’attaque herbivore dans les plantes. Cet article décrit une méthode pour visualiser la dynamique spatiale et temporelle de ces deux facteurs utilisant des plantes de thaliana d’Arabidopsis exprimant des biocapteurs fluorescents calcium et glutamate-sensibles.

Imagerie en temps réel à large champ des signaux de plaies locales et systémiques chez Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Ce protocole permet l’imagerie en temps réel à l’échelle de l’usine de l’activité du système de signalisation systémique de la plante grâce à la surveillance de la dynamique du glutamate de calcium et apoplasique en réponse à la blessure. Cette méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante fournit un outil robuste pour comprendre la dynamique des signaux rapides et à longue distance dans les plantes, combinant une résolution temporelle spatiale élevée et une facilité d’utilisation. Ce protocole offre le potentiel de fournir un nouvel aperçu des caractéristiques spatiales et temporelles de la signalisation du calcium du système dans les réponses au stress biotique et abiotique chez d’autres espèces végétales.Takuya Uemura, un post-doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par allumer le stéréomicroscope fluorescent motorisé, équipé d’un objectif 1X et d’une caméra sCMOS. Configurez les paramètres de l’appareil pour irradier avec une lumière d’excitation centrée sur 470 nanomètres, sélectionnée à l’aide d’un filtre qui transmet la lumière entre 450 et 490 nanomètres.Acquérir de la lumière d’émission à l’aide d’un filtre qui transmet entre 510 et 560 nanomètres. Retirez le couvercle de la parabole contenant la plante et placez-le sous la lentille de l’objectif. Vérifiez le signal fluorescent de la plante.Attendez ensuite environ 30 minutes dans l’obscurité jusqu’à ce que les plantes soient adaptées aux nouvelles conditions environnementales. Ajustez la mise au point et le grossissement pour voir la plante entière dans le champ de vision. Définissez ensuite les paramètres d’acquisition pour détecter les signaux fluorescents à l’aide du logiciel d’imagerie des microscopes.Définissez la durée d’enregistrement sur 11 minutes. Image pendant cinq minutes avant de commencer l’expérience pour acclimater la plante à l’irradiation de la lumière bleue du microscope, puis commencez à enregistrer. Pour déterminer la fluorescence de base moyenne, enregistrez au moins 10 images avant la blessure ou l’application de glutamate.Pour l’imagerie en temps réel des changements de concentration en calcium cytosolique induits par la plaie et du glutamate apoplasique, coupez le pétiole ou la région médiane de la feuille L1 avec des ciseaux. Pour l’imagerie en temps réel du glutamate déclenché des changements de calcium cytosolique, couper environ un millimètre de l’extrémité de la feuille L1 à travers la veine principale avec des ciseaux. Après au moins 20 minutes, appliquez 10 microlitres de glutamate de 100 millimolaires sur la surface coupée de la feuille.Pour l’analyse de l’intensité de la fluorescence au fil du temps, définissez une région d’intérêt à l’endroit où l’intensité de la fluorescence doit être analysée. Définissez deux ROIs pour le calcul de la vitesse de l’onde de calcium. Dans le logiciel d’imagerie, cliquez sur mesure du temps, définissez et encerclez.Mesurez la distance entre les deux régions en cliquant sur annotations et mesure, longueur et ligne simple. Mesurez les valeurs de florescence brutes dans chaque roi au fil du temps en cliquant sur la mesure, puis exportez les données brutes vers un tableur, pour convertir le signal fluorescent en nombres à chaque point de temps. Déterminer la valeur de fluorescence de base, qui est devinée F zéro, en calculant le F moyen sur les 10 premières trames dans les données enregistrées, puis normaliser les données F comme décrit dans le manuscrit de texte.Pour l’analyse des ondes de vitesse du calcium, définissez un point de montée de signal significatif au-dessus des valeurs pré-stimulées comme représentant la détection d’une augmentation du calcium dans chaque retour sur investissement. Calculer la différence de temps dans l’augmentation du calcium entre les deux ER et la distance entre eux pour déterminer les vitesses de toute onde de calcium. La propagation d’un changement blessure-déclenché des concentrations de l’ion cytosolique de calcium et du glutamate apoplastic est montrée ici.Couper le pétiole d’une feuille dans les plantes exprimant GCaMP-3 a conduit à une augmentation significative du calcium. Il a été induit localement et puis écarté dans toute la vascularisation. Le signal s’est rapidement propagé aux feuilles voisines en quelques minutes.En coupant une feuille et des plantes exprimant le renifleur de base de colle de la chitinase I, on a observé une augmentation apoplasique rapide de glutamate autour de la région de coupe. En quelques minutes, le signal s’est également propagé à travers la vascularisation. Pour l’imagerie en temps réel de la propagation du signal de calcium déclenchée par l’application de glutamate, le bord d’une feuille dans les plantes exprimant CCaMP-3 a été coupé.Ceci a causé une augmentation cytosolique locale de concentration en ions de calcium, mais le signal a disparu en quelques minutes. Après environ 10 minutes, le glutamate a été appliqué sur la surface coupée, provoquant une augmentation locale rapide de la concentration de calcium cytosolique, puis la propagation de ce signal aux feuilles distales. Pour mesurer les changements à l’intérieur d’une concentration solide de calcium induite par la blessure dans la feuille systémique, le changement de cours de temps de l’intensité du signal GCaMP-3 a été mesuré dans deux régions d’intérêt.Des changements apoplastiques de concentration en glutamate en réponse aux dommages mécaniques ont été mesurés aussi bien. La signature de glutamate a montré un pic simple à approximativement 100 secondes après blessure. Cette expérience devrait être menée dans des conditions contrôlées par la température et l’humidité, car elles sont élevées par les changements dans ces conditions environnementales.Ce protocole offre un potentiel pour fournir des informations sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la signalisation à longue distance en utilisant des mutants que les éléments défectueux et putatifs du système de signalisation de laboratoire.

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