Name: wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (17H05007 और 18H05491) से एमटी, नेशनल साइंस फाउंडेशन (IOS1557899 और MCB2016177) और नेशनल एयरोनॉटिक्स एंड स्पेस एडमिनिस्ट्रेशन (एनएनएक्स14AT25G और 80NSSC19K0126) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

1. पौधे सामग्री तैयार करने
<ol><li>एक 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में, सतह अरबीडोप्सिस थैलियाना (कर्नल-0 परिग्रहण) संयंत्र के बीजों को 3 मिनट के लिए 20% (v/v) NaClO के साथ मिलाते हुए GCaMP3 या CHIB-iGluSnFR व्यक्त करने और फिर बाँझ आसुत प?...

पौधों के लिए स्थानीयकृत बाहरी पर्यावरणीय उत्तेजनाओं का जवाब देने और फिर पूरे पौधे के स्तर पर अपने होमोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए प्रणालीगत संकेत महत्वपूर्ण है। यद्यपि वे जानवरों की तरह उन्नत तंत्रि...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>072-00501</td>
			<td>Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) medium</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>392-00591</td>
			<td>composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ25 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR analysis</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plastic Petri dish</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis

पौधे क्षतिग्रस्त और डिस्टल अक्षतिग्रस्त हिस्सों में रक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करके घायल और शाकाहारी जैसे यांत्रिक तनावों का जवाब देते हैं। एक पत्ती के घायल होने पर, घाव स्थल पर साइटोसॉलिक कैल्शियम आयन एकाग्रता (सीए2 + सिग्नल) में वृद्धि होती है। यह संकेत तेजी से अक्षतिग्रस्त पत्तियों को प्रेषित किया जाता है, जहां रक्षा प्रतिक्रियाएं सक्रिय होती हैं। हमारे हाल के शोध से पता चला है कि उनके चारों ओर एपोप्लास्ट में पत्ती की घायल कोशिकाओं से लीक ग्लूटामेट एक घाव संकेत के रूप में कार्य करता है । यह ग्लूटामेट ग्लूटामेट रिसेप्टर जैसे सीए2 + पारमेबल चैनलों को सक्रिय करता है, जो तब पूरे संयंत्र में लंबी दूरी की सीए2 + सिग्नल प्रचार की ओर जाता है। इन घटनाओं की स्थानिक और लौकिक विशेषताओं को आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट बायोसेंसर व्यक्त करने वाले जीवित पौधों के वास्तविक समय इमेजिंग के साथ कैप्चर किया जा सकता है। यहां हम सीए2 + संकेतों और घायल होने के जवाब में होने वाले एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट में परिवर्तन दोनों की गतिशीलता की निगरानी के लिए एक संयंत्र-चौड़ा, वास्तविक समय इमेजिंग विधि पेश करते हैं। यह दृष्टिकोण ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) आधारित सीए2 + और ग्लूटामेट बायोसेंसर को व्यक्त करने वाले व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और ट्रांसजेनिक अरबीडोप्सिस पौधों का उपयोग करता है। इसके अलावा, हम आसानी से घाव से प्रेरित, ग्लूटामेट-ट्रिगर रैपिड और लंबी दूरी के सीए2 + सिग्नल प्रचार को प्रकाश में लाने के लिए कार्यप्रणाली पेश करते हैं। इस प्रोटोकॉल को अन्य संयंत्र तनावों पर अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है ताकि यह जांच करने में मदद मिल सके कि संयंत्र प्रणालीगत सिग्नलिंग उनके सिग्नलिंग और प्रतिक्रिया नेटवर्क में कैसे शामिल हो सकती है।

घायल होने के जवाब में [सीए2+]साइट और [ग्लू]एपीओ का सिग्नल प्रचार चित्र 3, चित्रा 4, मूवी एस 1और मूवी एस 2में प्रस्तुत किया गया है । GCaMP3 (0 एस पर) व्यक्त ?...

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Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

पौधों में यांत्रिक घायल और शाकाहारी हमले के लिए पौधों की रक्षा प्रतिक्रियाओं को शामिल करने के लिए अतिरिक्त ग्लूटामेट-ट्रिगर प्रणालीगत कैल्शियम सिग्नलिंग महत्वपूर्ण है। यह लेख इन दोनों कारकों की स्थानिक और लौकिक गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है जिसमें कैल्शियम और ग्लूटामेट-सेंसेंट बायोसेंसर व्यक्त किए गए अरबीडोप्सिस थैलियाना पौधों का उपयोग किया जाता है।

वाइड-फील्ड, अरबीडोप्सिस में स्थानीय और प्रणालीगत घाव संकेतों की वास्तविक समय इमेजिंग

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

यह प्रोटोकॉल घायल होने के जवाब में कैल्शियम और एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट की गतिशीलता की निगरानी के माध्यम से संयंत्र प्रणालीगत सिग्नलिंग प्रणाली की गतिविधि के पौधे-व्यापी वास्तविक समय इमेजिंग की अनुमति देता है। यह पौधे-चौड़ा वास्तविक समय इमेजिंग विधि पौधों में तेजी से और लंबी दूरी के संकेतों की गतिशीलता को समझने के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करती है, जो एक उच्च स्थानिक लौकिक संकल्प और उपयोग में आसानी का संयोजन करती है। यह प्रोटोकॉल अन्य पौधों की प्रजातियों में बायोटिक और अजैविक तनाव प्रतिक्रियाओं दोनों में सिस्टम कैल्शियम सिग्नलिंग की स्थानिक और लौकिक विशेषताओं में एक नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता प्रदान करता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन ताकुया उमुरा, मेरी प्रयोगशाला से एक पोस्ट डॉक्टरेट फेलो होगा । मोटराइज्ड फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप को चालू करके शुरू करें, जो 1X ऑब्जेक्टिव लेंस और एक एससीएमओएस कैमरे से लैस है। डिवाइस सेटिंग्स को 470 नैनोमीटर पर केंद्रित उत्तेजन प्रकाश के साथ विकिरणित करने के लिए कॉन्फ़िगर करें, जो एक फ़िल्टर का उपयोग करके चुना गया है जो 450 और 490 नैनोमीटर के बीच प्रकाश पहुंचाता है।510 और 560 नैनोमीटर के बीच पहुंचाता है कि एक फिल्टर का उपयोग कर उत्सर्जन प्रकाश प्राप्त करें। पौधे वाले पकवान से ढक्कन निकालें और इसे ऑब्जेक्टिव लेंस के नीचे रखें। पौधे से फ्लोरोसेंट सिग्नल की जांच करें।फिर अंधेरे में लगभग 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि पौधों को नई पर्यावरणीय स्थितियों के अनुकूल न हो जाए। देखने के क्षेत्र में पूरे संयंत्र को देखने के लिए ध्यान और आवर्धन समायोजित करें। फिर माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें।रिकॉर्डिंग का समय 11 मिनट तक सेट करें। माइक्रोस्कोप से नीली रोशनी विकिरण के लिए संयंत्र को अनुकूलित करने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले पांच मिनट के लिए छवि, फिर रिकॉर्डिंग शुरू करें। घायल या ग्लूटामेट आवेदन से पहले औसत बेसलाइन फ्लोरेसेंस रिकॉर्ड रिकॉर्ड निर्धारित करने के लिए।घाव प्रेरित साइटोसोलिक कैल्शियम आयन और एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट एकाग्रता परिवर्तन के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए, पेटियोल या पत्ती L1 के मध्य क्षेत्र को कैंची से काटें। ग्लूटामेट के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए साइटोसोलिक कैल्शियम परिवर्तन शुरू हुआ, कैंची के साथ मुख्य नस के पार पत्ती L1 की नोक से लगभग एक मिलीमीटर काटें। कम से कम 20 मिनट के बाद पत्ती की कटी हुई सतह पर 100 मिलीमोलर ग्लूटामेट के 10 माइक्रोलीटर लगाएं।समय के साथ फ्लोरेसेंस तीव्रता विश्लेषण के लिए, उस स्थान पर ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करें जहां फ्लोरेसेंस तीव्रता का विश्लेषण किया जाना है। कैल्शियम तरंग के वेग गणना के लिए दो आरओआई को परिभाषित करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर में समय माप पर क्लिक करें, परिभाषित और सर्कल।एनोटेशन और माप, लंबाई और सरल रेखा पर क्लिक करके दोनों क्षेत्रों के बीच की दूरी को मापें। उपाय पर क्लिक करके समय के साथ प्रत्येक आरओआई में कच्चे फ्लोरोसेंस मूल्यों को मापें, फिर हर समय बिंदु पर फ्लोरोसेंट सिग्नल को संख्याओं में परिवर्तित करने के लिए स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में कच्चे डेटा का निर्यात करें। रिकॉर्ड किए गए डेटा में पहले 10 फ्रेम पर औसत एफ की गणना करके बेसलाइन फ्लोरेसेंस मूल्य निर्धारित करें, जिसे एफ शून्य के रूप में दिव्य किया गया है, फिर पाठ पांडुलिपि में वर्णित एफ डेटा को सामान्य करें।कैल्शियम वेग तरंग विश्लेषण के लिए, प्रत्येक आरओआई में कैल्शियम वृद्धि का पता लगाने का प्रतिनिधित्व करने के रूप में पूर्व-उत्तेजित मूल्यों के ऊपर एक महत्वपूर्ण संकेत वृद्धि बिंदु को परिभाषित करें। किसी भी कैल्शियम तरंग के वेग को निर्धारित करने के लिए दो आरओआई और उनके बीच की दूरी के बीच कैल्शियम वृद्धि में समय अंतर की गणना करें। साइटोसोलिक कैल्शियम आयन और एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट की सांद्रता में घाव से शुरू होने वाले परिवर्तन का प्रचार यहां दिखाया गया है।जीसीएएमपी-3 को व्यक्त करने वाले पौधों में एक पत्ती के पेटियोल को काटने से कैल्शियम में काफी वृद्धि हुई। यह स्थानीय रूप से प्रेरित किया गया था और फिर पूरे वैक्यूलेचर में फैल गया था। संकेत तेजी से कुछ ही मिनटों के भीतर पड़ोसी पत्तियों के लिए प्रचारित किया गया था ।एक पत्ती और पौधों को काटने पर बुनियादी चिटनस आई गोंद रूमाल व्यक्त करते हुए, कट क्षेत्र के चारों ओर एक तेजी से एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट वृद्धि देखी गई। कुछ ही मिनटों के भीतर सिग्नल को वैक्यूलेचर के जरिए प्रचारित भी कर दिया। ग्लूटामेट के आवेदन से शुरू होने वाले कैल्शियम सिग्नल प्रचार के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए, CCaMP-3 को व्यक्त करने वाले पौधों में एक पत्ती का किनारा काट दिया गया था।इसकी वजह से लोकल साइटोसोलिक कैल्शियम आयन कंसंट्रेशन में बढ़ोतरी हुई, लेकिन सिग्नल कुछ ही मिनटों में गायब हो गया। लगभग 10 मिनट के बाद, ग्लूटामेट को कट सतह पर लागू किया गया था, जिससे साइटोसोलिक कैल्शियम की एकाग्रता में तेजी से स्थानीय वृद्धि हुई और फिर इस संकेत का प्रचार डिस्टल पत्तियों के लिए किया गया। प्रणालीगत पत्ती में घायल होने से प्रेरित एक ठोस कैल्शियम एकाग्रता के अंदर परिवर्तन को मापने के लिए, GCaMP-3 सिग्नल तीव्रता के समय पाठ्यक्रम परिवर्तन ब्याज के दो क्षेत्रों में मापा गया था ।यांत्रिक क्षति के जवाब में एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट एकाग्रता परिवर्तन भी मापा गया। ग्लूटामेट हस्ताक्षर घायल होने के बाद लगभग १०० सेकंड में एक ही चोटी का प्रदर्शन किया । यह प्रयोग तापमान और आर्द्रता नियंत्रित स्थितियों के तहत किया जाना चाहिए क्योंकि इस पर्यावरणीय स्थितियों में परिवर्तन से ऊंचा है ।यह प्रोटोकॉल प्रयोगशाला सिग्नलिंग सिस्टम के दोषपूर्ण और ख्यात तत्वों का उपयोग करके लंबी दूरी के संकेतों में अंतर्निहित आणविक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता प्रदान करता है।

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Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Unit 1

Principles of Cell Signaling

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

लंबी अवधि के इमेजिंग स्तनधारी वाइड फील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग कक्ष

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

मेल QD झल्लाहट और Microfluidics वास्तविक समय में डीएनए स्व विधानसभा Nanocomplex मॉनिटर करने के लिए

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

में आनुवंशिक अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारण सी. एलिगेंस माइक्रोएरे और वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Ratiometric bimolecular संकेतकों का उपयोग जीवित कोशिकाओं में एकल इंजीनियर शाही सेना टेप के वास्तविक समय इमेजिंग

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

मापने स्थानिक और लौकिक सीए<sup&gt; 2 +</supArabidopsis संयंत्रों में&gt; सिग्नल

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

इमेजिंग स्थानीय सीए<sup&gt; 2 +</sup&gt; संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में सिग्नल

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

जांच-आधारित वास्तविक समय पीसीआर microRNAs के मात्रात्मक मापन के लिए दृष्टिकोण

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

चर-कोण Epifluorescence माइक्रोस्कोपी के साथ संयंत्र सेल भूतल गतिशीलता की वास्तविक समय इमेजिंग

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी: बरकरार दिल में सेलुलर संकेतों इमेजिंग

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट नाइट्रिक ऑक्साइड का आवेदन (सं •) जांच, geNOps, एकल कक्षों में सं • सिग्नल की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...