Name: wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 e 18H05491) a MT, dalla National Science Foundation (IOS1557899 e MCB2016177) e dalla National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G e 80NSSC19K0126) a SG.

1. Preparazione del materiale vegetale
<ol><li>In un microtubo da 1,5 mL, sterilizzare in superficie i semi della pianta arabidopsis thaliana (adesione Col-0) esprimendo GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR tremando con il 20% (v/v) NaClO per 3 minuti e quindi lavare 5 volte con acqua distillata sterile. NOTA: Le linee transgeniche di Arabidopsis che esprimono GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR sono state descritte in precedenza6.</li>
	<li>In un cappuccio sterile, seminare 13 semi sterilizzati in su...

La segnalazione sistemica è importante per le piante per rispondere agli stimoli ambientali esterni localizzati e quindi per mantenere la loro omeostasi a un intero livello di impianto. Sebbene non siano dotati di un sistema nervoso avanzato come gli animali, impiegano una comunicazione rapida sia all'interno che tra gli organi sulla base di fattori come segnali elettrici mobili (ed eventualmente idraulici) e onde di propagazione di ROS e Ca2 +46,47. ...

Le piante non possono sfuggire agli stress biotici, ad esempio gli insetti che si nutrono di loro, quindi hanno sviluppato sofisticati sistemi di rilevamento dello stress e trasduzione del segnale per rilevare e quindi proteggersi da sfide come l'erbivoro1. Al momento del mento o dell'attacco di erbivoro, le piante avviano risposte rapide di difesa tra cui l'accumulo dell'acido jasmonico fitoormone (JA) non solo nel sito ferito ma anche negli organi distale non danneggiati2. Questo JA quindi innesca risposte di difesa nei tessuti direttamente danneggiati e induce preemptive difese nelle parti non danneggiate della pianta. In Arabidopsis, l'accumulo di JA indotto dal mento è stato rilevato in foglie distale e intatte entro pochi minuti dai danni altrove nella pianta suggerendo che un segnale rapido e a lunga distanza viene trasmesso dalla fogliaferita 3. Diversi candidati, come Ca2+,specie reattive dell'ossigeno (ROS) e segnali elettrici, sono stati proposti per servire come questi segnali di ferita a lunga distanza nellepiante 4,5.
Ca2+ è uno dei secondi elementi messaggeri più versatili e onnipresenti negli organismi eucarioti. Nelle piante, la masticazione del bruco e il mento meccanico causano drastici aumenti della concentrazione citosolica di Ca2 + ([Ca2+]cyt) sia nella foglia ferita che nelle foglie lontane non liche6,7. Questo segnale ca2+ sistemico viene ricevuto dalle proteine intracellulari ca2+,che portano all'attivazione di vie di segnalazione della difesa a valle, tra cui biosintesi JA8,9. Nonostante numerosi rapporti di questo tipo supportano l'importanza dei segnali Ca2+ nelle risposte delle ferite delle piante, le informazioni sulle caratteristiche spaziali e temporali dei segnali Ca2+ indotti dal ferimento sono limitate.
L'imaging in tempo reale utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati è un potente strumento per monitorare e quantificare la dinamica spaziale e temporale dei segnali Ca2+. Ad oggi, sono state sviluppate versioni di tali sensori che consentono la visualizzazione di segnali Ca2 + a livello di una singola cellula, a tessuti, organi e persino piante intere10. Il primo biosensore geneticamente codificato per Ca2+ utilizzato nelle piante è stata l'aequorina proteica bioluminescente derivata dalla medusa Aequorea victoria11. Sebbene questa proteina chemiluminescente sia stata utilizzata per rilevare cambiamenti Ca2+ in risposta a varie sollecitazioni nelle piante12,13,14,15,16,17,18, non è adatta per l'imaging in tempo reale a causa del segnale luminescente estremamente basso che produce. Gli indicatori Ca2+ basati su Förster Resonance Energy Transfer (FRET), come i camelioni gialli, sono stati utilizzati con successo anche per indagare la dinamica di una serie di eventidi segnalazione Ca 2 + negliimpianti 19,20,21,22,23,24. Questi sensori sono compatibili con gli approcci di imaging e più comunemente sono composti dalla calmodulina proteica legante Ca2+ (CaM) e da un peptide legante CaM (M13) da una chinasi della catena leggera della miosina, tutti fusi tra due proteine fluorofori, generalmente una proteina fluorescente ciano (CFP) e una variante della proteina fluorescente gialla (YFP)10. L'associazione Ca2+ a CaM favorisce l'interazione tra CaM e M13 portando a un cambiamento conformazionale del sensore. Questo cambiamento promuove il trasferimento di energia tra la PCP e l'YFP, il che aumenta l'intensità di fluorescenza dell'YFP riducendo al contempo le emissioni di fluorescenza della PCP. Il monitoraggio di questo passaggio dalla PCP alla fluorescenza YFP fornisce quindi una misura dell'aumento del livello Ca2+. Oltre a questi sensori FRET, i biosensori Ca2+ a base di proteine fluorescenti singole (FP), come GCaMP e R-GECO, sono anche compatibili con gli approcci di imaging vegetale e sono ampiamente utilizzati per studiare [Ca2+]cambiamenti del cito a causa della loro elevata sensibilità e facilità d'uso25,26,27,28,29,30. I GCAMP contengono un singolo GFP permutato circolare (cp), nuovamente fuso a CaM e al peptide M13. L'interazione dipendente da Ca2+tra CaM e M13 provoca un cambiamento conformazionale nel sensore che promuove uno spostamento dello stato di protonazione del cpGFP, migliorando il suo segnale fluorescente. Pertanto, conl'aumento dei livelli di Ca 2+, il segnale cpGFP aumenta.
Per indagare la dinamica dei segnali Ca2+ generati in risposta a ferite meccaniche o alimentazione di erbivori, abbiamo utilizzato piante transgeniche arabidopsis thaliana che esprimono una variante GCaMP, GCaMP3, e un microscopio a fluorescenza a campolargo 6. Questo approccio è riuscito a visualizzare la trasmissione rapida di un segnale Ca2+ a lunga distanza dal sito della ferita su una foglia a tutta la pianta. Pertanto, un aumento del cito [Ca2+]è stato immediatamente rilevato nel sito della ferita, ma questo segnale Ca2 + è stato poi propagato alle foglie vicine attraverso la vascucolatura entro pochi minuti dal mento. Inoltre, abbiamo scoperto che la trasmissione di questo rapido segnale di ferita sistemica è abolita nelle piante arabidopsis con mutazioni in due geni simili al recettore del glutammato, Glutammato Recettore Like (GLR), GLR3.3 e GLR3.66. I GLR sembrano funzionare come canali Ca2+ recintati da amminoacidi coinvolti in diversi processi fisiologici, tra cui rispostaalle ferite 3,crescita del tubo di polline31,sviluppo delle radici32,risposta alfreddo 33e immunità innata34. Nonostante questa ben compresa, ampia funzione fisiologica dei GLR, le informazioni sulle loro proprietà funzionali, come la loro specificità ligando, la selettività ioniche e la localizzazione subcellulare, sonolimitate 35. Tuttavia, studi recenti hanno riferito che GLR3.3 e GLR3.6 sono localizzati rispettivamente nel phloem e nello xilema. I GLR vegetali hanno somiglianze con i recettori del glutammato ionotropico (iGluRs)36 nei mammiferi, che vengono attivati dagli amminoacidi, come glutammato, glicina e D-serina nel sistema nervoso dei mammiferi37. Infatti, abbiamo dimostrato che l'applicazione di glutammato di 100 mM, ma non di altri amminoacidi, nel sito della ferita induce un segnale Ca2 + rapido e a lunga distanza in Arabidopsis, indicando che il glutammato extracellulare agisce probabilmente come un segnale di ferita nelle piante6. Questa risposta è abolita nel mutante glr3.3/glr3.6 suggerendo che il glutammato possa agire attraverso uno o entrambi questi canali simili a recettori e, in effetti, AtGLR3.6 è stato recentemente dimostrato essere gated da questi livelli di glutammato38.
Nelle piante, oltre al suo ruolo di amminoacido strutturale, il glutammato è stato proposto anche come regolatore chiave dello sviluppo39; tuttavia, le sue dinamiche spaziali e temporali sono poco comprese. Proprio come per Ca2+,sono stati sviluppati diversi indicatori geneticamente codificati per il glutammato per monitorare la dinamica di questo amminoacido nelle celluleviventi 40,41. iGluSnFR è un biosensore glutammato single-FP basato su GFP composto da cpGFP e una proteina legante il glutammato (GltI) di Escherichia coli42,43. Il cambiamento conformazionale di iGluSnFR, indotto dal legame del glutammato con GltI, si traduce in una maggiore emissione di fluorescenza GFP. Per indagare se il glutammato extracellulare agisce come una molecola di segnalazione nella risposta della ferita vegetale, abbiamo collegato la sequenza iGluSnFR con la sequenza di secrezione peptidica del segnale chitinasio di base (CHIB-iGluSnFR) per localizzare questo biosensore nello spazio apoplastico6. Questo approccio ha permesso di imaging di eventuali cambiamenti nella concentrazione di glutammato apoplastico ([Glu]apo) utilizzando piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono questo sensore. Abbiamo rilevato rapidi aumenti del segnale iGluSnFR nel sito di wounding. Questi dati supportano l'idea che il glutammato fuoriesi dalle cellule / tessuti danneggiati all'apoplasto al momento del mento e agisce come un segnale di danno attivando i GLR e portando al segnale Ca2 + a lunga distanza nelle piante6.
Qui, descriviamo un metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale utilizzando biosensori geneticamente codificati per monitorare e analizzare la dinamica dei segnali ca2+ a lunga distanza e glutammato extracellulare in risposta almento 6. La disponibilità di microscopia a fluorescenza a campo largo e piante transgeniche che esprimono biosensori geneticamente codificati fornisce un approccio potente ma facilmente implementato per rilevare segnali a lunga distanza trasmessi rapidamente, come le onde Ca2+.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>072-00501</td>
			<td>Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) medium</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>392-00591</td>
			<td>composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ25 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR analysis</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plastic Petri dish</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis

Gli impianti rispondono a sollecitazioni meccaniche come ferite ed erbivori inducendo risposte di difesa sia nelle parti danneggiate che in quelle non danneggiate. Al momento del mento di una foglia, si verifica un aumento della concentrazione citosolica di ioni di calcio (segnale Ca2 +) nel sito della ferita. Questo segnale viene rapidamente trasmesso a foglie non danneggiate, dove vengono attivate le risposte della difesa. La nostra recente ricerca ha rivelato che il glutammato che fuorie' dalle cellule ferite della foglia nell'apoplasto che li circonda serve come segnale di ferita. Questo glutammato attiva canali permeabili Ca2+ simili al recettore del glutammato, che quindi porta alla propagazione del segnale Ca2+ a lunga distanza in tutta la pianta. Le caratteristiche spaziali e temporali di questi eventi possono essere catturate con l'imaging in tempo reale di piante viventi che esprimono biosensori fluorescenti geneticamente codificati. Qui introduciamo un metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale per monitorare la dinamica dei segnali Ca2 + e i cambiamenti nel glutammato apoplastico che si verificano in risposta al mento. Questo approccio utilizza un microscopio a fluorescenza a campo ampio e piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono biosensori Ca2+ a base di proteina fluorescente verde (GFP) e biosensori glutammati. Inoltre, presentiamo una metodologia per suscitare facilmente la propagazione del segnale Ca2+ indotta da ferite, innescata dal glutammato e rapida e a lunga distanza. Questo protocollo può anche essere applicato a studi su altre sollecitazioni dell'impianto per aiutare a studiare come la segnalazione sistemica degli impianti potrebbe essere coinvolta nelle loro reti di segnalazione e risposta.

La propagazione del segnale di [Ca2+]cyt e [Glu]apo in risposta al collare è presentata nella Figura 3, Figura 4, Filmato S1e Filmato S2. Il taglio del picciolo della foglia 1 nelle piante che esprimono GCaMP3 (a 0 s) ha portato a un aumento significativo delcit [Ca2+] che è stato rapidamente indotto localmente attraverso la vascucolatura (...

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Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

La segnalazione sistemica del calcio extracellulare innescata dal glutammato è fondamentale per l'induzione delle risposte della difesa delle piante al mento meccanico e all'attacco di erbivoro nelle piante. Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la dinamica spaziale e temporale di entrambi questi fattori utilizzando piante di thaliana arabidopsis che esprimono biosensori fluorescenti sensibili al calcio e al glutammato.

Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Questo protocollo consente l'imaging in tempo reale a livello vegetale dell'attività del sistema di segnalazione sistemica vegetale attraverso il monitoraggio della dinamica del glutammato di calcio e apoplastico in risposta al mento. Questo metodo di imaging in tempo reale a livello di impianto fornisce uno strumento robusto per comprendere la dinamica dei segnali rapidi e a lunga distanza nelle piante, combinando un'elevata risoluzione temporale spaziale e facilità d'uso. Questo protocollo offre il potenziale per fornire una nuova visione delle caratteristiche spaziali e temporali del sistema di segnalazione del calcio sia nelle risposte di stress biotico che abiotico in altre specie di piante.A dimostrare la procedura sarà Takuya Uemura, un dottoranda del mio laboratorio. Inizia accendendo il microscopio stereo fluorescente motorizzato, dotato di un obiettivo 1X e di una fotocamera sCMOS. Configurare le impostazioni del dispositivo per l'irradiazione con luce di eccitazione centrata su 470 nanometri, selezionata utilizzando un filtro che trasmette luce tra 450 e 490 nanometri.Acquisire luce di emissione utilizzando un filtro che trasmette tra 510 e 560 nanometri. Rimuovere il coperchio dal piatto contenente la pianta e posizionarlo sotto l'obiettivo. Controllare il segnale fluorescente dalla pianta.Quindi attendere circa 30 minuti al buio fino a quando le piante non sono adattate alle nuove condizioni ambientali. Regolare la messa a fuoco e l'ingrandimento per vedere l'intera pianta nel campo visivo. Quindi impostare i parametri di acquisizione per rilevare i segnali fluorescenti utilizzando il software di imaging al microscopio.Impostare il tempo di registrazione su 11 minuti. Immagine per cinque minuti prima di iniziare l'esperimento per acclimatare la pianta all'irradiazione della luce blu dal microscopio, quindi iniziare a registrare. Per determinare la media della fluorescenza basale registrare almeno 10 fotogrammi prima del rilevamento o dell'applicazione del glutammato.Per l'imaging in tempo reale dello ione calcio citosolico indotto dalla ferita e dei cambiamenti di concentrazione di glutammato apoplastico, tagliare il picciolo o la regione centrale della foglia L1 con le forbici. Per l'imaging in tempo reale del glutammato ha innescato cambiamenti di calcio citosolico, tagliare circa un millimetro dalla punta della foglia L1 attraverso la vena principale con le forbici. Dopo almeno 20 minuti applicare 10 microlitri di glutammato millimolare sulla superficie tagliata della foglia.Per l'analisi dell'intensità della fluorescenza nel tempo, definire una regione di interesse nel luogo in cui deve essere analizzata l'intensità della fluorescenza. Definire due ROM per il calcolo della velocità dell'onda di calcio. Nel software di imaging fare clic sulla misurazione del tempo, definire e cerchiare.Misurare la distanza tra le due regioni facendo clic su annotazioni e misure, lunghezza e linea semplice. Misurare i valori di florescence grezzi in ogni ROI nel tempo facendo clic sulla misura, quindi esportare i dati grezzi nel software del foglio di calcolo, per convertire il segnale fluorescente in numeri in ogni punto di tempo. Determinare il valore di fluorescenza di base, che è intuito come F zero, calcolando la F media sui primi 10 fotogrammi nei dati registrati, quindi normalizzare i dati F come descritto nel manoscritto testuale.Per l'analisi delle onde di velocità del calcio, definire un significativo punto di aumento del segnale al di sopra dei valori pre-stimolati come rappresentazione del rilevamento di un aumento del calcio in ogni ROI. Calcola la differenza di tempo nell'aumento del calcio tra le due ROM e la distanza tra loro per determinare le velocità di qualsiasi ondata di calcio. La propagazione di un cambiamento innescato da ferite nelle concentrazioni dello ione calcio citosolico e del glutammato apoplastico è mostrata qui.Tagliare il picceolo di una foglia nelle piante che esprimono GCaMP-3 ha portato a un aumento significativo del calcio. È stato indotto localmente e poi diffuso in tutta la vascucolatura. Il segnale si propagava rapidamente alle foglie vicine in pochi minuti.Dopo aver tagliato una foglia e piante che esprimono lo sniffer di colla chitinasi I di base, è stato osservato un rapido aumento del glutammato apoplastico intorno alla regione tagliata. Nel giro di pochi minuti, il segnale si propagava anche attraverso la vascucolatura. Per l'imaging in tempo reale della propagazione del segnale di calcio innescata dall'applicazione del glutammato, è stato tagliato il bordo di una foglia nelle piante che esprimono CCaMP-3.Ciò causò un aumento della concentrazione locale di ioni di calcio citosolico, ma il segnale scomparve in pochi minuti. Dopo circa 10 minuti, il glutammato è stato applicato sulla superficie tagliata, causando un rapido aumento locale della concentrazione di calcio citosolico e quindi la propagazione di questo segnale alle foglie distali. Per misurare i cambiamenti all'interno di una concentrazione solida di calcio indotta dallo ingrato nella foglia sistemica, il cambio di rotta del tempo dell'intensità del segnale GCaMP-3 è stato misurato in due regioni di interesse.Sono stati misurati anche i cambiamenti di concentrazione di glutammato apoplastico in risposta ai danni meccanici. La firma del glutammato mostrava un singolo picco a circa 100 secondi dopo il mento. Questo esperimento deve essere condotto in condizioni controllate da temperatura e umidità perché sono elevati da cambiamenti in queste condizioni ambientali.Questo protocollo offre un potenziale per fornire informazioni sui meccanismi molecolari alla base della segnalazione a lunga distanza attraverso l'uso di mutanti che gli elementi difettosi e putativi del sistema di segnalazione di laboratorio.

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