Name: wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

この研究は、日本科学振興協会(17H05007および18H05491)からMT、国立科学財団(IOS1557899およびMCB2016177)および米国航空宇宙局(NNX14AT25Gおよび80NSSC19K0126)からのSGへの助成金によって支えられました。

1. 植物材料の準備
<ol><li>1.5 mLマイクロチューブでは、GCaMP3またはCHIB-iGluSnFRを20%(v/v)NaClOで3分間振盪し、滅菌蒸留水で5回洗浄することにより、 シロイヌナズナ (Col-0加盟)植物の種子を表面に殺菌します。 注:GCaMP3またはCHIB-iGluSnFRを発現する シロイヌナズナの トランスジェニックラインは、前に6を説明しました。</li>
	<li>無菌フードに、30 mLの無菌(オートク?...

全身シグナル伝達は、植物が局所的な外部環境刺激に応答し、その後、植物全体のレベルで恒常性を維持するために重要です。動物のような高度な神経系は装備されていないが、移動式電気信号(そしておそらく油圧)信号やROSとCa2+46、47の波を伝播するなどの要因に基づいて、臓器内および器官間の迅速なコミュニケーションを採用している。</...

植物は生物的ストレスから逃れることができない、例えば、昆虫がそれらに餌を与える、彼らは検出し、その後、草食1などの課題から身を守るために高度なストレスセンシングと信号伝達システムを進化させた。傷や草食動物の攻撃の際に、植物は負傷部位だけでなく損傷を受けていない遠位器官においても植物ホルモンジャスモン酸(JA)の蓄積を含む迅速な防御反応を開始する2。このJAは、両方の直接損傷した組織の防御応答をトリガし、先制的に、損傷していない部分の防御を誘導します。シロイヌナズナでは、傷によるJAの蓄積が遠位で検出され、無傷の葉は、傷ついた葉3から急速かつ長距離信号が伝達されていることを示唆する植物の他の場所で損傷のほんの数分の範囲内で検出された。Ca2+、活性酸素種(ROS)、および電気信号などのいくつかの候補は、植物4、5におけるこれらの長距離創傷信号として機能するように提案されている。
Ca2+は、真核生物の中で最も汎用性が高く、ユビキタスな第二のメッセンジャー要素の1つです。植物では、毛虫の咀嚼と機械的傷害は、傷ついた葉の中と傷ついていない遠葉6,7の両方で、細胞細胞体Ca2+濃度([Ca2+]cyt)の急激な増加を引き起こす。この全身Ca2+シグナルは、細胞内Ca2+センシングタンパク質によって受信され、JA生合成8,9を含む下流の防御シグナル伝達経路の活性化につながる。植物創傷応答におけるCa2+信号の重要性を支持する多数のそのような報告にもかかわらず、創傷によって誘発されるCa2+信号の空間的および時間的特性に関する情報は限られている。
遺伝的にコードされたCa2+指標を用いたリアルタイムイメージングは、Ca2+信号の空間的および時間的ダイナミクスを監視し、定量化するための強力なツールです。現在までに、このようなセンサーのバージョンは、単一の細胞のレベルでCa2+信号の可視化を可能にする開発された、組織、臓器、さらには植物全体10に。植物に使用されるCa2+の最初の遺伝子組み換えバイオセンサーは、クラゲエーコレアビクトリア11に由来する生物発光タンパク質aequorinであった。 この化学発光タンパク質は、植物12、13、13、14、15、16、17、18の様々なストレスに応じてCa2+の変化を検出するために使用されていますが、非常に低い発光シグナルのためにリアルタイムイメージングには適していません。黄色のカメレオンのようなフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)ベースのCa2+指標は、植物19、20、21、22、23、24におけるCa2+シグナル伝達事象の範囲のダイナミクスを調査するためにも成功して使用されています。これらのセンサは、イメージングアプローチと互換性があり、最も一般的には、カ2+結合タンパク質カルモジュリン(CaM)とミオシン軽鎖キナーゼからのCaM結合ペプチド(M13)で構成され、いずれも2つのフルオロフォアタンパク質の間で融合され、一般的にはシアン蛍光タンパク質(CFP)と黄色蛍光タンパク質(YFP)10である。CaMへのCa2+結合はセンサーの立体構造変化をもたらすCaMとM13の間の相互作用を促進する。この変化は、CFPとYFP間のエネルギー伝達を促進し、CFPからの蛍光放射を減少させながらYFPの蛍光強度を増加させる。CFPからYFP蛍光へのこのシフトを監視すると、Ca2+レベルの増加の尺度が提供されます。これらのFRETセンサーに加えて、GCaMPやR-GECOなどの単一蛍光タンパク質(FP)ベースのCa2+バイオセンサーは、植物イメージングアプローチと互換性があり、高感度と使いやすさ25、26、27、28、29、30によるcyt変化の研究に広く使用されています。GCAMPは、単一の円形に分通(cp)GFPを含み、再度CaMとM13ペプチドと融合する。CaMとM13の間のCa2+依存的相互作用は、cpGFPのプロトネーション状態の変化を促進するセンサーの立体構造変化を引き起こし、その蛍光シグナルを増強する。従って、Ca2+レベルが上昇するにつれて、cpGFP信号は増加する。
機械的な傷や草食に応答して発生するCa2+シグナルのダイナミクスを調べるには、GCaMP変異体を発現するトランスジェニックなシロイナナ植物、GCaMP3、および広視野蛍光顕微鏡6を用いた。このアプローチは、葉の創傷部位から植物全体への長距離Ca2+信号の迅速な伝達を視覚化することに成功した。したがって、創傷部位で[Ca2+]cytの増加がすぐに検出されたが、このCa2+信号は、創傷の数分以内に血管系を通って隣接する葉に伝播した。さらに、この急速な全身創傷シグナルの伝達が、2つのグルタミン酸受容体様遺伝子、グルタミン酸受容体様(GLR)、GLR3.3、GLR3.66の変異を有するシロイヌズナシス植物において消滅することを発見した。 GLRsは、創傷応答3、花粉管成長31、根発発生32、寒冷応答33、および自然免疫34を含む多様な生理学的プロセスに関与するアミノ酸ゲートCa2+チャネルとして機能するように見える。このよく理解されているにもかかわらず、GLRsの広範な生理学的機能、それらのリガンド特異性、イオン選択性、および細胞内局在性などのそれらの機能特性に関する情報は、35に制限されている。しかし、最近の研究では、GLR3.3とGLR3.6がそれぞれフロレムとキシレムに局在していると報告されています。植物GLRsは、哺乳動物におけるヨノトロピックグルタミン酸受容体(iGluRs)36と類似しており、哺乳類神経系37におけるグルタミン酸、グリシン、およびDセリンなどのアミノ酸によって活性化される。実際に、創傷部位における100mMグルタミン酸の適用は、他のアミノ酸ではなく、シロイヌナズナでの高速の長距離Ca2+シグナルを誘導することを実証した。この応答は、グルタミン酸がこれらの受容体様チャネルの一方または両方を介して作用し得ることを示唆するglr3.3/glr3.6突然変異体において廃止され、実際に、AtGLR3.6は、これらのレベルのグルタミン酸38によってゲート化されるのが最近示された。 
植物では、構造アミノ酸としての役割に加えて、グルタミン酸は主要な発達レギュレータ39として提案されている。しかし、その空間的および時間的なダイナミクスは十分に理解されていません。Ca2+と同様に、グルタミン酸に対する遺伝的にコード化された指標は、生細胞40, 41におけるこのアミノ酸のダイナミクスを監視するために開発されています。iGluSnFRは、エシェリヒア・コリ42,43由来のcpGFPおよびグルタミン酸結合タンパク質(GltI)で構成されるGFPベースのシングルFPグルタミン酸バイオセンサである。グルタミン酸結合によってGltIに誘導されるiGluSnFRの立体構造変化により、GFP蛍光発光が増強される。細胞外グルタミン酸が植物創傷応答においてシグナル伝達分子として働くかどうかを調べるため、iGluSnFR配列を基本的なキチナーゼシグナルペプチド分泌配列(CHIB-iGluSnFR)と結合し、このバイオセンサを再生不良空間6に局地化した。このアプローチにより、このセンサを発現するトランスジェニックなシロイヌナズナシス植物を用いた、無形成グルタミン酸濃度([Glu]apo)の変化を画像化することができました。創傷部位でのiGluSnFRシグナルの急激な増加を検出した。このデータは、グルタミン酸が損傷した細胞/組織から創傷時にアポプラストに漏れ出し、GLRsを活性化し、植物6における長距離Ca2+信号につながる損傷信号として作用するという考えを支持する。
ここでは、傷6に応答して長距離Ca2+ および細胞外グルタミン酸シグナルのダイナミクスを監視および分析するために、遺伝的にコードされたバイオセンサーを用いた植物全体のリアルタイムイメージング方法について述べている。遺伝子組み換えバイオセンサーを発現する広視野蛍光顕微鏡およびトランスジェニック植物の利用可能性は、Ca2+ 波などの高速に伝達された長距離信号を検出するための強力で簡単に実装されたアプローチを提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>072-00501</td>
			<td>Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) medium</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>392-00591</td>
			<td>composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ25 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR analysis</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plastic Petri dish</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis

植物は損傷や草藻などの機械的ストレスに反応し、損傷を受けた部分と遠位の損傷のない部分の両方で防御応答を誘導します。葉の傷を負った時、創傷部位で細胞細胞のカルシウムイオン濃度(Ca2+シグナル)の増加が起こる。この信号は、損傷していない葉に迅速に送信され、そこで防御応答が作動します。私たちの最近の研究は、葉の負傷した細胞から周囲のアポプラストに漏れるグルタミン酸が創傷信号として機能することを明らかにしました。このグルタミン酸はグルタミン酸受容体様Ca2+透過性チャネルを活性化し、植物全体に長距離Ca2+シグナル伝達をもたらす。これらの事象の空間的および時間的特性は、遺伝的にコードされた蛍光バイオセンサーを発現する生きている植物のリアルタイム画像化によって捉えることができる。ここでは、Ca2+シグナルのダイナミクスと、創傷に応答して発生する無熱性グルタミン酸の変化の両方を監視する植物全体のリアルタイムイメージング方法を紹介します。このアプローチでは、緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースのCa2+およびグルタミン酸バイオセンサーを発現する広視野蛍光顕微鏡およびトランスジェニックシロイヌズン植物を使用しています。さらに、創傷誘発、グルタミン酸誘発の急速かつ長距離Ca2+シグナル伝播を容易に引き出す方法論を提示する。このプロトコルは、他の植物ストレスに関する研究にも適用され、植物の全身シグナリングがシグナリングおよび応答ネットワークにどのように関与しているかを調査するのに役立ちます。

傷に応じて[Ca2+]cytと[Glu]アポの信号伝播は図3、図4、ムービーS1、およびムービーS2に示されている。GCaMP3を発現する植物で葉1のペチオールを切断(0s)で、血管構造を介して局所的に急速に誘導された[Ca2+]cytの有意な増加(図3およびムービ?...

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Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

細胞外グルタミン酸誘発全身カルシウムシグナル伝達は、植物における機械的創傷および草食動物攻撃に対する植物防御応答の誘導にとって極めて重要である。本稿では、カルシウムとグルタミン酸に敏感な蛍光バイオセンサーを発現する シロイヌナズナ植物 を用いて、これらの要因の空間的および時間的ダイナミクスを可視化する方法について述べる。

シロイヌナズナにおける局所および全身創傷信号の広視野、リアルタイムイメージング

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

このプロトコルは、創傷に応答してカルシウムおよび再生不良グルタミン酸のダイナミクスを監視することにより、植物全身シグナル伝達システムの活性の植物全体のリアルタイムイメージングを可能にする。このプラント全体のリアルタイムイメージング法は、高い空間的時間分解能と使いやすさを組み合わせた、プラントの高速および長距離信号のダイナミクスを理解するための堅牢なツールを提供します。このプロトコルは、他の植物種における生物的および非生物的ストレス応答におけるシステムカルシウムシグナル伝達の空間的および時間的特性に関する新しい洞察を提供する可能性を提供する。この手順を実証するのが、研究室の博士研究員の上村卓也さんです。まず、1X対物レンズとsCMOSカメラを搭載した電動蛍光ステレオ顕微鏡をオンにします。470ナノメートルを中心とする励起光を照射するようにデバイス設定を構成し、450〜490ナノメートルの間の光を透過するフィルタを使用して選択した。510~560ナノメートルの間を透過するフィルターを用いて発光光を取得します。植物を含む皿から蓋を取り出し、対物レンズの下に置きます。植物からの蛍光シグナルを確認します。その後、植物が新しい環境条件に適応されるまで、暗闇の中で約30分待ちます。視野の植物全体を見るために焦点と拡大を調整します。次に、取得パラメータを設定して、顕微鏡イメージングソフトウェアを用いて蛍光シグナルを検出する。記録時間を11分に設定します。実験開始前に5分間画像を用いて、植物を顕微鏡から青色光照射に順応させ、次いで記録を開始する。平均ベースライン蛍光記録を決定するために、創傷またはグルタミン酸塗布の前に少なくとも10フレーム。創傷誘発性細胞質カルシウムイオン及び無熱刺激性グルタミン酸濃度変化のリアルタイム画像化のために、葉L1のペチオールまたは中間領域をはさみで切断する。グルタミン酸誘発細胞体カルシウム変化のリアルタイムイメージングでは、葉L1の先端から主静脈を横切ってハサミで約1ミリメートルカットする。少なくとも20分後、葉の切断面に100ミリモルグルタミン酸の10マイクロリットルを適用する。時間の経過に関する蛍光強度解析では、蛍光強度を分析する場所で対象領域を定義します。カルシウム波の速度計算に 2 つの ROI を定義します。イメージングソフトウェアで時間測定をクリックし、定義して円を描きます。注釈と測定、長さと単純な線をクリックして、2つの領域間の距離を測定します。測定をクリックして各ROIの生の蛍光値を時間をかけて測定し、その生データをスプレッドシートソフトウェアにエクスポートして、各時点で蛍光信号を数値に変換します。Fゼロとして占めるベースライン蛍光値を、記録されたデータの最初の10フレームにわたって平均Fを計算し、次にテキスト原稿に記載されているようにFデータを正規化して決定する。カルシウム速度波解析では、事前に刺激された値より大きなシグナル上昇点を、各ROIのカルシウム増加の検出を表すものとして定義します。2つのROI間のカルシウム増加の時間差とそれらの間の距離を計算して、カルシウム波の速度を決定します。細胞体カルシウムイオンおよび再生不良性グルタミン酸の濃度における創傷誘発変化の伝播をここに示す。GCaMP-3を発現する植物で葉のペチオールを切断すると、カルシウムの有意な増加につながった。それは局所的に誘発され、その後、血管系全体に広がった。信号は数分以内に隣接する葉に急速に伝播した。葉と植物を切断して基本的なキチナーゼI接着剤スニファーを発現すると、切り出し領域の周りに急速な再生不良性グルタミン酸増加が観察された。数分以内に、信号も脈管系を通って伝播した。グルタミン酸の適用によって引き起こされるカルシウムシグナル伝搬のリアルタイムイメージングのために、CCaMP-3を発現する植物における葉の縁を切断した。これは局所的な細胞体カルシウムイオン濃度の増加を引き起こしたが、数分以内にシグナルが消失した。約10分後、グルタミン酸を切断面に塗布し、細胞質カルシウムの濃度を急激に局所的に増加させ、次にこのシグナルを遠位葉に伝播させた。全身葉での創傷によって誘導される固体カルシウム濃度の内部変化を測定するために、GCaMP-3シグナル強度の経時変化を対象とする2つの領域で測定した。機械的損傷に対するアポプラスチックグルタミン酸濃度変化も測定した。グルタミン酸シグネチャは、創傷後約100秒で単一のピークを示した。この実験は、この環境条件の変化によって上昇するため、温度と湿度の制御条件下で行われるべきです。このプロトコルは、ラボシグナリングシステムの欠陥要素と推定要素を変異体を使用して、長距離シグナリングの基礎となる分子メカニズムに関する洞察を提供する可能性を提供します。

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Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Unit 1

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Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

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