Name: wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 og 18H05491) til MT, National Science Foundation (IOS1557899 og MCB2016177) og National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G og 80NSSC19K0126) til SG.

1. Forberedelse av plantemateriale
<ol><li>I en 1,5 ml mikrotube steriliserer overflaten frøene til Arabidopsis thaliana (Col-0 tiltredelse) som uttrykker enten GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR ved å riste med 20% (v / v) NaClO i 3 minutter og vask deretter 5 ganger med sterilt destillert vann. MERK: De transgene linjene til Arabidopsis som uttrykker GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR har blitt beskrevet tidligere6.</li>
	<li>I en steril hette, så 13 overflatesteriliserte frø på en 1...

Systemisk signalering er viktig for planter å reagere på lokaliserte eksterne miljøstimuli og deretter opprettholde sin homeostase på et helt plantenivå. Selv om de ikke er utstyrt med et avansert nervesystem som dyr, bruker de rask kommunikasjon både i og mellom organer basert på faktorer som mobile elektriske (og muligens hydrauliske) signaler og forplantningsbølger av ROS og Ca2 + 46,47. Protokollen beskrevet ovenfor tillater planteomfatten...

Planter kan ikke unnslippe biotiske påkjenninger, for eksempel insekter som fôrer på dem, så de har utviklet sofistikerte stresssensor- og signaltransduksjonssystemer for å oppdage og deretter beskytte seg mot utfordringer som plantelevende1. Ved sår eller plantelevende angrep starter planter raske forsvarsresponser, inkludert opphopning av fytohormonet jasmonsyre (JA) ikke bare på det sårede stedet, men også i uskadede distale organer2. Denne JA utløser deretter begge forsvarsresponser i det direkte skadede vevet og induserer fortrinnsrett forsvar i de uskadede delene av anlegget. I Arabidopsisble akkumuleringen av JA indusert av sår oppdaget i distale, intakte blader innen bare noen få minutter etter skade andre steder i anlegget, noe som tyder på at et raskt og langdistansesignal overføres fra det sårede bladet3. Flere kandidater, som Ca2+, reaktive oksygenarter (ROS) og elektriske signaler, har blitt foreslått å tjene som disse langdistanse sårsignalene i anlegg4,5.
Ca2+ er et av de mest allsidige og allestedsnærværende andre messenger-elementene i eukaryote organismer. I planter forårsaker larve tygge og mekanisk såring drastiske økninger i cytosoliske Ca2 + konsentrasjon ([Ca2 +]cyt) både i det sårede bladet og i viklet fjerne blader6,7. Dette systemiske Ca2+ -signalet mottas av intracellulære Ca2+-sensing proteiner, noe som fører til aktivering av nedstrøms forsvarssignalveier, inkludert JA biosyntese8,9. Til tross for mange slike rapporter som støtter viktigheten av Ca2 + -signaler i plantesårresponser, er informasjon om de romlige og tidsmessige egenskapene til Ca2 + -signaler forårsaket av sår begrenset.
Sanntidsavbildning ved hjelp av genetisk kodede Ca2+-indikatorer er et kraftig verktøy for å overvåke og kvantifisere romlig og tidsmessig dynamikk i Ca2+-signaler. Til dags dato er det utviklet versjoner av slike sensorer som muliggjør visualisering av Ca2 + -signaler på nivået av en enkelt celle, til vev, organer og til og med hele planter10. Den første genetisk kodede biosensoren for Ca2 + brukt i planter var bioluminescent protein aequorin avledet fra maneter Aequorea victoria11. Selv om dette chemiluminescent proteinet har blitt brukt til å oppdage Ca2 + endringer som svar på ulike belastninger i planter12,13,14,15,16,17,18, er det ikke godt egnet for sanntidsavbildning på grunn av det ekstremt lave luminescerende signalet det produserer. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserte Ca2+ indikatorer, for eksempel de gule kamelonene, har også blitt brukt til å undersøke dynamikken i en rekke Ca2+ signalhendelser i anlegg19,20,21,22,23,24. Disse sensorene er kompatible med bildemetoder og består oftest av Ca2+ bindende protein calmodulin (CaM) og et CaM-bindende peptid (M13) fra en myosinlyskjedekinase, alle smeltet sammen mellom to fluoroforproteiner, vanligvis et cyan fluorescerende protein (CFP) og en Gul fluorescerende proteinvariant (YFP)10. Ca2+ binding til CaM fremmer samspillet mellom CaM og M13 som fører til en konformasjonsendring av sensoren. Denne endringen fremmer energioverføring mellom CFP og YFP, noe som øker fluorescensintensiteten til YFP samtidig som fluorescensutslippet reduseres fra CFP. Overvåking av dette skiftet fra CFP til YFP fluorescens gir deretter et mål på økningen i Ca2 + nivå. I tillegg til disse FRET-sensorene er enkelt fluorescerende protein (FP)-baserte Ca2+ biosensorer, som GCaMP og R-GECO, også kompatible med planteavbildningsmetoder og er mye brukt til å studere [Ca2 +]cytendringer på grunn av deres høye følsomhet og brukervennlighet25,26,27,28,29,30. GCaMPs inneholder en enkelt sirkulær permutert (cp) GFP, igjen smeltet sammen til CaM og M13 peptid. Ca2+-avhengig interaksjon mellom CaM og M13 forårsaker en konformasjonsendring i sensoren som fremmer et skifte i protonasjonstilstanden til cpGFP, noe som forbedrer fluorescerende signal. Dermed, når Ca2 + nivåer stiger, øker cpGFP-signalet.
For å undersøke dynamikken i Ca2 + -signaler generert som svar på mekanisk såring eller plantelevende fôring, har vi brukt transgene Arabidopsis thaliana-planter som uttrykker en GCaMP-variant, GCaMP3 og et bredfelts fluorescensmikroskop6. Denne tilnærmingen har lyktes i å visualisere rask overføring av et langdistanse Ca2 + -signal fra sårstedet på et blad til hele planten. Dermed ble en økning i [Ca2 +]cyt umiddelbart oppdaget på sårstedet, men dette Ca2 + -signalet ble deretter forplantet til nabobladene gjennom vaskulaturen innen få minutter etter sår. Videre fant vi ut at overføringen av dette raske systemiske sårsignalet avskaffes i Arabidopsis planter med mutasjoner i to glutamatreseptorlignende gener, Glutamatreseptor som (GLR), GLR3.3 og GLR3.66. GLR-ene ser ut til å fungere som aminosyre inngjerdede Ca2 + kanaler involvert i forskjellige fysiologiske prosesser, inkludert sårrespons3, pollenrørvekst31, rotutvikling32, kaldrespons33og medfødt immunitet34. Til tross for denne godt forståtte, brede fysiologiske funksjonen til GLRs, er informasjon om deres funksjonelle egenskaper, for eksempel deres ligand spesifisitet, ion selectivity og subcellulær lokalisering, begrenset35. Nyere studier rapporterte imidlertid at GLR3.3 og GLR3.6 er lokalisert i henholdsvis phloem og xylem. PlanteglRs har likheter med ionotrope glutamatreseptorer (iGluRs)36 hos pattedyr, som aktiveres av aminosyrer, som glutamat, glycin og D-serin i pattedyrnervesystemet37. Faktisk viste vi at anvendelsen av 100 mM glutamat, men ikke andre aminosyrer, på sårstedet induserer et raskt, langdistanse Ca2 + signal i Arabidopsis, noe som indikerer at ekstracellulær glutamat sannsynligvis fungerer som et sårsignal i planter6. Dette svaret er avskaffet i glr3.3/glr3.6 mutant som antyder at glutamat kan virke gjennom en eller begge disse reseptorlignende kanalene, og faktisk ble AtGLR3.6 nylig vist seg å være inngjerdet av disse nivåene av glutamat38.
I planter, i tillegg til sin rolle som en strukturell aminosyre, har glutamat også blitt foreslått som en viktig utviklingsregulator39; Imidlertid er dens romlige og tidsmessige dynamikk dårlig forstått. Akkurat som for Ca2 +, flere genetisk kodede indikatorer for glutamat er utviklet for å overvåke dynamikken i denne aminosyren i levende celler40,41. iGluSnFR er en GFP-basert enkelt-FP glutamat biosensor sammensatt av cpGFP og et glutamatbindingsprotein (GltI) fra Escherichia coli42,43. Konformasjonsendringen av iGluSnFR, som induseres av glutamatbinding til GltI, resulterer i et forbedret GFP-fluorescensutslipp. For å undersøke om ekstracellulært glutamat fungerer som et signalmolekyl i plantesårrespons, koblet vi iGluSnFR-sekvensen med den grunnleggende chitinase signalpeptidsekresjonssekvensen (CHIB-iGluSnFR) for å lokalisere denne biosensoren i det apoplastiske rommet6. Denne tilnærmingen gjorde det mulig å avbilde eventuelle endringer i den apoplastiske glutamatkonsentrasjonen ([Glu]apo) ved hjelp av transgene Arabidopsis-planter som uttrykker denne sensoren. Vi oppdaget raske økninger i iGluSnFR-signalet på sårstedet. Disse dataene støtter ideen om at glutamat lekker ut av de skadede cellene / vevene til apoplasten ved såring og fungerer som et skadesignal som aktiverer GLR-ene og fører til langdistanse Ca2 + -signalet i plante6.
Her beskriver vi en planteomfattende sanntidsavbildningsmetode ved hjelp av genetisk kodede biosensorer for å overvåke og analysere dynamikken i langdistanse Ca2 + og ekstracellulære glutamatsignaler som svar påsåring 6. Tilgjengeligheten av bredfelts fluorescensmikroskopi og transgene planter som uttrykker genetisk kodede biosensorer gir en kraftig, men likevel lett implementert tilnærming for å oppdage raskt overførte langdistansesignaler, for eksempel Ca2 + bølger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>072-00501</td>
			<td>Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) medium</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>392-00591</td>
			<td>composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ25 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR analysis</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plastic Petri dish</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis

Planter reagerer på mekaniske påkjenninger som sår og plantelevende ved å indusere forsvarsresponser både i de skadede og i de distale uskadede delene. Ved såring av et blad oppstår en økning i cytosolisk kalsiumionkonsentrasjon (Ca2 + signal) på sårstedet. Dette signalet overføres raskt til uskadede blader, hvor forsvarsresponser aktiveres. Vår nylige forskning viste at glutamat som lekker fra de sårede cellene i bladet inn i apoplasten rundt dem, fungerer som et sårsignal. Dette glutamatet aktiverer glutamatreseptorlignende Ca2+ gjennomtrengelige kanaler, noe som deretter fører til langdistanse Ca2 + signalutbredelse i hele anlegget. De romlige og tidsmessige egenskapene til disse hendelsene kan fanges opp med sanntidsavbildning av levende planter som uttrykker genetisk kodede fluorescerende biosensorer. Her introduserer vi en planteomfattende bildemetode i sanntid for å overvåke dynamikken i både Ca2+ -signalene og endringer i apoplastisk glutamat som oppstår som respons på sår. Denne tilnærmingen bruker et bredfelts fluorescensmikroskop og transgene Arabidopsis-planter som uttrykker Green Fluorescent Protein (GFP)-baserte Ca2+ og glutamatbiosensorer. I tillegg presenterer vi metodikk for enkelt å fremkalle sårindusert, glutamatutløst rask og langdistanse Ca2+ signalutbredelse. Denne protokollen kan også brukes på studier på andre plantespenninger for å bidra til å undersøke hvordan plantesystemisk signalering kan være involvert i deres signal- og responsnettverk.

Signalutbredelse av [Ca2+]cyt og [Glu]apo som svar på sår er presentert i figur 3, figur 4, film S1og film S2. Kutting av bladbladets petiole 1 i planter som uttrykker GCaMP3 (ved 0 s) førte til en betydelig økning i [Ca2+]cyt som raskt ble indusert lokalt gjennom vaskulaturen (ved 40 s) (Figur 3 og F...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Ekstracellulær glutamatutløst systemisk kalsiumsignalering er avgjørende for induksjon av planteforsvarsresponser på mekanisk såring og plantelevende angrep i planter. Denne artikkelen beskriver en metode for å visualisere den romlige og tidsmessige dynamikken i begge disse faktorene ved hjelp av Arabidopsis thaliana planter som uttrykker kalsium- og glutamatfølsomme fluorescerende biosensorer.

Wide-Field, sanntidsavbildning av lokale og systemiske sårsignaler i Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Denne protokollen tillater planteomfattende sanntidsavbildning av aktiviteten til det plantesystemiske signalsystemet gjennom overvåking av dynamikken i kalsium og apoplastisk glutamat som respons på sår. Denne planteomfattende sanntidsavbildningsmetoden gir et robust verktøy for å forstå dynamikken i de raske og lange avstandssignalene i planter, og kombinerer en høy romlig temporal oppløsning og brukervennlighet. Denne protokollen gir potensial til å gi et nytt innblikk i de romlige og tidsmessige egenskapene til systemet kalsiumsignalering i både biotiske og abiotiske stressresponser hos andre plantearter.Å demonstrere prosedyren vil være Takuya Uemura, en postdoktor fra laboratoriet mitt. Begynn med å slå på det motoriserte fluorescerende stereomikroskopet, utstyrt med en 1X objektiv linse og et sCMOS-kamera. Konfigurer enhetsinnstillingene til å bestråle med eksitasjonslys sentrert på 470 nanometer, valgt ved hjelp av et filter som overfører lys mellom 450 og 490 nanometer.Skaff utslippslys ved hjelp av et filter som overfører mellom 510 og 560 nanometer. Fjern lokket fra parabolen som inneholder planten, og plasser det under objektivlinsen. Kontroller fluorescerende signalet fra anlegget.Vent deretter i ca 30 minutter i mørket til plantene er tilpasset de nye miljøforholdene. Juster fokus og forstørrelse for å se hele anlegget innen synsfeltet. Angi deretter anskaffelsesparametrene for å oppdage fluorescerende signaler ved hjelp av mikroskopenes bildebehandlingsprogramvare.Still inn opptakstiden til 11 minutter. Bilde i fem minutter før du starter eksperimentet for å akklimatisere anlegget til det blå lyset bestråling fra mikroskopet, og deretter begynne å spille inn. For å bestemme gjennomsnittlig baseline fluorescens registrere minst 10 rammer før sår eller glutamat søknad.For sanntidsavbildning av sårindusert cytosolisk kalsiumion og apoplastisk glutamatkonsentrasjon endres, kutt petiolen eller den midterste delen av blad L1 med saks. For sanntidsavbildning av glutamat utløste cytosoliske kalsiumforandringer, kutt omtrent en millimeter fra spissen av blad L1 over hovedvenen med saks. Etter minst 20 minutter gjelder 10 mikroliter 100 millimolar glutamat til bladets kuttede overflate.For fluorescensintensitetsanalyse over tid, definer en interesseregion på stedet der fluorescensintensiteten skal analyseres. Definer to ROIer for hastighetsberegningen av kalsiumbølgen. I bildebehandlingsprogramvaren klikker du på tidsmåling, definerer og sirkler.Mål avstanden mellom de to regionene ved å klikke på merknader og måling, lengde og enkel linje. Mål rå florescensverdiene i hver avkastning over tid ved å klikke på mål, og eksporter deretter rådataene til regnearkprogramvare, for å konvertere fluorescerende signal til tall på hvert tidspunkt. Bestem den grunnleggende fluorescensverdien, som er guddommeliggjort som F null, ved å beregne gjennomsnittet F over de første 10 rammene i de registrerte dataene, og normaliser deretter F-dataene som beskrevet i tekstmanuskriptet.For kalsiumhastighetsbølgeanalyse definerer du et betydelig signalstigningspunkt over de pre-stimulerte verdiene som representerer deteksjon av en kalsiumøkning i hver avkastning. Beregn tidsforskjellen i kalsiumøkningen mellom de to ROIene og avstanden mellom dem for å bestemme hastigheten på en kalsiumbølge. Forplantning av en sårutløst endring i konsentrasjonene av den cytosoliske kalsiumionen og apoplastisk glutamat er vist her.Kutting av petiole av et blad i planter som uttrykker GCaMP-3 førte til en betydelig økning i kalsium. Det ble indusert lokalt og deretter spredt gjennom vaskulaturen. Signalet ble raskt forplantet til nærliggende blader i løpet av få minutter.Ved kutting av et blad og planter som uttrykker grunnleggende chitinase jeg lim sniffer, ble det observert en rask apoplastisk glutamatøkning rundt kuttområdet. I løpet av få minutter forplantet signalet seg også gjennom vaskulaturen. For sanntidsavbildning av kalsiumsignalutbredelse utløst av påføring av glutamat, ble kanten av et blad i planter som uttrykker CCaMP-3 kuttet.Dette forårsaket en lokal cytososolic kalsiumion konsentrasjonsøkning, men signalet forsvant i løpet av få minutter. Etter ca. 10 minutter ble glutamat påført kuttoverflaten, noe som førte til en rask lokal økning i konsentrasjonen av cytosolisk kalsium og deretter forplantning av dette signalet til distale blader. For å måle endringene inne i en solid kalsiumkonsentrasjon indusert ved såring i det systemiske bladet, ble tidsforløpendringen av GCaMP-3-signalintensitet målt i to interesseområder.Apoplastiske glutamatkonsentrasjonsendringer som følge av mekanisk skade ble også målt. Glutamatsignaturen viste en enkelt topp på omtrent 100 sekunder etter såring. Dette eksperimentet bør utføres under temperatur- og fuktighetskontrollerte forhold fordi det er forhøyet av endringer i disse miljøforholdene.Denne protokollen gir et potensial for å gi innsikt i molekylære mekanismer som ligger til grunn for fjernsignalering ved hjelp av mutanter som de defekte og putative elementene i laboratoriesignalsystemet.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Unit 1

Principles of Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time Imaging av Enkelt Engineered RNA transkripsjoner i levende celler ved hjelp Proporsjonellekspansjon bimolekylære Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Måle romlig og tidsmessig Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i Arabidopsis planter

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Lokal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i dyrkede pattedyrceller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baserte Real-time PCR tilnærminger for kvantitativ måling av microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics med variabel vinkel epifluorescens Mikros

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Lokal Feltet Fluorescensmikroskopi: Imaging Cellular Signaler i Intakte Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

Bruk av genetisk kodet Fluorescent Nitrogenoksid (NO •) sonder, de geNOps, for Real-time Imaging av NO • Signaler i enkeltceller

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...