Name: wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Японского общества содействия развитию науки (17H05007 и 18H05491) MT, Национального научного фонда (IOS1557899 и MCB2016177) и Национального управления по аэронавтике и исследованию космического пространства (NNX14AT25G и 80NSSC19K0126) SG.

1. Подготовка растительного сырья
<ol><li>В микротрубке 1,5 мл поверхностно стерилизуют семена растения Arabidopsis thaliana (присоединение Col-0), экспрессируя либо GCaMP3, либо CHIB-iGluSnFR путем встряхивания с 20% (v/v) NaClO в течение 3 мин, а затем промыть 5 раз стерильной дистиллированной водой. ПРИМЕЧАНИЕ...

Системная сигнализация важна для растений, чтобы реагировать на локализованные внешние раздражители окружающей среды, а затем поддерживать свой гомеостаз на уровне всего растения. Хотя они не оснащены развитой нервной системой, как животные, они используют быструю связь как внутри, т?...

Растения не могут избежать биотических стрессов, например, насекомые, питающиеся ими, поэтому они разработали сложные системы восприятия стресса и передачи сигналов, чтобы обнаружить, а затем защитить себя от таких проблем, как травоядные1. При ранении или травоядной атаке растения инициируют быстрые защитные реакции, включая накопление фитогормонной жасмоновой кислоты (JA) не только в раненом месте, но и в неповрежденные дистальные органы2. Затем эта JA вызывает защитные реакции в непосредственно поврежденных тканях и упреждающе индуцирует защиту в неповрежденных частях растения. У Arabidopsisнакопление JA, вызванное ранением, было обнаружено в дистальных, неповрежденных листьях всего за несколько минут после повреждения в другом месте растения, что говорит о том, что от раненого листа3передается быстрый и дальний сигнал. Несколько кандидатов, таких как Ca2+,активные формы кислорода (АФК) и электрические сигналы, были предложены для того, чтобы служить в качестве этих сигналов на большие расстояния в растениях4,5.
Ca2+ является одним из самых универсальных и вездесущих вторых мессенджеров в эукариотических организмах. У растений жевание гусениц и механическое ранение вызывают резкое повышение концентрации цитозоля Ca2+ ([Ca2+]cyt)как в раненом листе, так и в нераненых отдаленных листьях6,7. Этот системный сигнал Ca2+ принимается внутриклеточными Ca2+-чувствительными белками, которые приводят к активации нисходящих защитных сигнальных путей, включая биосинтез JA8,9. Несмотря на многочисленные такие сообщения, подтверждающие важность сигналов Ca2+ в реакциях на раны растений, информация о пространственных и временных характеристиках сигналов Ca2+, вызванных ранением, ограничена.
Визуализация в режиме реального времени с использованием генетически закодированных индикаторов Ca2+ является мощным инструментом для мониторинга и количественной оценки пространственной и временной динамики сигналов Ca2+. На сегодняшний день разработаны версии таких датчиков, позволяющие визуализировать сигналы Ca2+ на уровне одной клетки, к тканям, органам и даже целым растениям10. Первым генетически закодированным биосенсором для Ca2+, используемым в растениях, был биолюминесцентный белок экворин, полученный из медузы Aequorea victoria11. Хотя этот хемилюминесцентный белок использовался для обнаружения изменений Ca2+ в ответ на различные стрессы в растениях12,13,14,15,16,17,18,он не очень хорошо подходит для визуализации в режиме реального времени из-за чрезвычайно низкого люминесцентного сигнала, который он производит. Индикаторы Ca2+, основанные на резонансном переносе энергии Фёрстера (FRET), такие как желтые камелоны, также успешно используются для исследования динамики диапазона сигнальных событий Ca2+ в растениях19,20,21,22,23,24. Эти датчики совместимы с подходами к визуализации и чаще всего состоят из Ca2+, связывающего белка кальмодулина (CaM) и CaM-связывающего пептида (M13) из миозиновой киназы легкой цепи, все они слиты между двумя флуорофорными белками, как правило, синим флуоресцентным белком (CFP) и вариантом желтого флуоресцентного белка (YFP)10. Связывание Ca2+ с CaM способствует взаимодействию между CaM и M13, что приводит к конформационному изменению датчика. Это изменение способствует передаче энергии между CFP и YFP, что увеличивает интенсивность флуоресценции YFP при одновременном уменьшении флуоресцентного излучения от CFP. Мониторинг этого перехода от флуоресценции CFP к флуоресценции YFP затем обеспечивает измерение увеличения уровня Ca2+. В дополнение к этим датчикам FRET, биосенсоры Ca2+ на основе одного флуоресцентного белка (FP), такие как GCaMP и R-GECO, также совместимы с подходами к визуализации растений и широко используются для изучения измененийцит [Ca2+]из-за их высокой чувствительности и простоты использования25,26,27,28,29,30. GCaMP содержат один циркулярно перестановленный (cp) GFP, снова сплавленный с CaM и пептидом M13. Ca2+-зависимое взаимодействие между CaM и M13 вызывает конформационное изменение датчика, которое способствует сдвигу в протонационном состоянии cpGFP, усиливая его флуоресцентный сигнал. Таким образом, по мере повышения уровня Ca2+ сигнал cpGFP увеличивается.
Чтобы исследовать динамику сигналов Ca2+, генерируемых в ответ на механическое ранение или кормление травоядных, мы использовали трансгенные растения Arabidopsis thaliana, экспрессирующие вариант GCaMP, GCaMP3, и широкопольный флуоресцентный микроскоп6. Этот подход позволил визуализировать быструю передачу сигнала Ca2+ на большие расстояния от места раны на листе ко всему растению. Таким образом, увеличениециты [Ca2+]было немедленно обнаружено в месте раны, но этот сигнал Ca2 + затем распространялся на соседние листья через сосудистую азкулятуру в течение нескольких минут после ранения. Кроме того, мы обнаружили, что передача этого быстрого системного сигнала раны отменяется у растений Arabidopsis с мутациями в двух генах, подобных рецепторам глутамата, Glutamate Receptor Like (GLR), GLR3.3 и GLR3.66. GLR, по-видимому, функционируют как аминокислотные закрытые каналы Ca2+, участвующие в различных физиологических процессах, включая раневую реакцию3,рост пыльцевой трубки31,развитие корней32,холодный ответ33и врожденный иммунитет34. Несмотря на эту хорошо понятную, широкую физиологическую функцию GLR, информация об их функциональных свойствах, таких как их лигандная специфичность, селективность ионов и субклеточная локализация, ограничена35. Однако недавние исследования показали, что GLR3.3 и GLR3.6 локализованы во флоэме и ксилеме соответственно. Растительные GLR имеют сходство с ионотропными глутаматными рецепторами (iGluRs)36 у млекопитающих, которые активируются аминокислотами, такими как глутамат, глицин и D-серин в нервной системе млекопитающих37. Действительно, мы продемонстрировали, что применение глутамата 100 мМ, но не других аминокислот, в месте раны индуцирует быстрый, дальний сигнал Ca2+ у Arabidopsis,что указывает на то, что внеклеточный глутамат, вероятно, действует как раневой сигнал у растений6. Этот ответ отменяется у мутанта glr3.3/glr3.6, предполагая, что глутамат может действовать через один или оба из этих рецептороподобных каналов, и действительно, недавно было показано, что AtGLR3.6 ограничен этими уровнями глутамата38.
В растениях, в дополнение к своей роли в качестве структурной аминокислоты, глутамат также был предложен в качестве ключевого регулятора развития39; однако его пространственная и временная динамика плохо изучена. Так же, как и для Ca2+,было разработано несколько генетически закодированных индикаторов для глутамата для мониторинга динамики этой аминокислоты в живых клетках40,41. iGluSnFR представляет собой биосенсор глутамата на основе GFP, состоящий из cpGFP и глутаматсвязывающего белка (GltI) из Escherichia coli42,43. Конформационное изменение iGluSnFR, которое индуцируется связыванием глутамата с GltI, приводит к усиленному флуоресцентному излучению GFP. Чтобы исследовать, действует ли внеклеточный глутамат как сигнальная молекула в реакции раны растений, мы связали последовательность iGluSnFR с основной последовательностью секреции сигнального пептида хитиназы (CHIB-iGluSnFR) для локализации этого биосенсора в апопластическом пространстве6. Этот подход позволил визуализировать любые изменения концентрации апопластического глутамата ([Glu]apo)с использованием трансгенных растений Arabidopsis, экспрессирующих этот датчик. Мы обнаружили быстрое увеличение сигнала iGluSnFR в месте ранения. Эти данные подтверждают идею о том, что глутамат просачивается из поврежденных клеток / тканей в апопласт при ранении и действует как сигнал повреждения, активирующий GLR и приводящий к сигналу Ca2 + на большом расстоянии у растений6.
Здесь мы описываем общезаводской метод визуализации в режиме реального времени с использованием генетически закодированных биосенсоров для мониторинга и анализа динамики сигналов Ca2+ и внеклеточных сигналов глутамата на большие расстояния в ответ на ранение6. Наличие широкоугольной флуоресцентной микроскопии и трансгенных растений, экспрессирующих генетически закодированные биосенсоры, обеспечивает мощный, но легко реализуемый подход к обнаружению быстро передаваемых сигналов на большие расстояния, таких как волны Ca2+.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>072-00501</td>
			<td>Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) medium</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>392-00591</td>
			<td>composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ25 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR analysis</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plastic Petri dish</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis

Растения реагируют на механические напряжения, такие как раны и травоядные, вызывая защитные реакции как в поврежденных, так и в дистальных неповрежденными частях. При ранении листа на месте раны происходит повышение концентрации цитозольного иона кальция (сигнал Ca2+). Этот сигнал быстро передается в неповрежденные листья, где активируются защитные реакции. Наше недавнее исследование показало, что глутамат, просачивающийся из раненых клеток листа в апопласт вокруг них, служит сигналом раны. Этот глутамат активирует глутамат-рецептороподобные каналы Ca2+, что затем приводит к распространению сигнала Ca2+ на большие расстояния по всему растению. Пространственные и временные характеристики этих событий могут быть получены с помощью визуализации в реальном времени живых растений, экспрессирующих генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры. Здесь мы представляем общезаводской метод визуализации в режиме реального времени для мониторинга динамики как сигналов Ca2+, так и изменений в апопластическом глутамате, которые происходят в ответ на ранение. Этот подход использует широкоугольный флуоресцентный микроскоп и трансгенные растения Arabidopsis, экспрессирующие биосенсоры Ca2+ и глутамата на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP). Кроме того, мы представляем методологию, которая легко вызывает раневое, вызванное глутаматом быстрое и дальнее распространение сигнала Ca2+. Этот протокол также может быть применен к исследованиям других стрессов растений, чтобы помочь выяснить, как системная сигнализация растений может быть вовлечена в их сигнальные и ответные сети.

Распространение сигнала [Ca2+]cyt и [Glu]apo в ответ на ранение представлено на рисунке 3, рисунке 4, фильме S1и фильме S2. Обрезание черешка листа 1 у растений, экспрессировающих GCaMP3 (при 0 с), привело к значительн...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Внеклеточная систематическая передача кальция, вызванная глутаматом, имеет решающее значение для индукции реакций защиты растений на механическое ранение и атаку травоядных животных у растений. В данной статье описан метод визуализации пространственной и временной динамики обоих этих факторов с использованием растений Arabidopsis thaliana, экспрессирующих чувствительные к кальцию и глутамату флуоресцентные биосенсоры.

Широкоугольная визуализация в реальном времени локальных и системных сигналов раны при арабидопсисе

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Этот протокол позволяет в режиме реального времени визуализировать активность системной сигнальной системы растения путем мониторинга динамики кальция и апопластического глутамата в ответ на ранение. Этот общезаводской метод визуализации в режиме реального времени предоставляет надежный инструмент для понимания динамики быстрых и дальних сигналов в растениях, сочетая в себе высокое пространственное временное разрешение и простоту использования. Этот протокол предлагает потенциал для обеспечения нового понимания пространственных и временных характеристик системы передачи сигналов кальция как в биотических, так и в абиотических реакциях на стресс у других видов растений.Продемонстрировать процедуру будет Такуя Уэмура, постдокторант из моей лаборатории. Начните с включения моторизованного флуоресцентного стереомикроскопа, оснащенного объективом 1X и камерой sCMOS. Настройте параметры устройства для облучения светом возбуждения, центрируемым на 470 нанометрах, выбранным с помощью фильтра, который пропускает свет от 450 до 490 нанометров.Получайте излучающий свет с помощью фильтра, который пропускает от 510 до 560 нанометров. Снимите крышку с тарелки, содержащей растение, и поместите ее под объектив. Проверьте флуоресцентный сигнал от растения.Затем подождите примерно 30 минут в темноте, пока растения не адаптируются к новым условиям окружающей среды. Отрегулируйте фокус и увеличение, чтобы увидеть все растение в поле зрения. Затем установите параметры сбора для обнаружения флуоресцентных сигналов с помощью программного обеспечения для визуализации микроскопов.Установите время записи на 11 минут. Снимайте за пять минут до начала эксперимента, чтобы акклиматизировать растение к облучению синим светом из микроскопа, после чего начинают запись. Для определения среднего исходного уровня флуоресценции записывают не менее 10 кадров перед нанесением раны или нанесения глутамата.Для визуализации в режиме реального времени раневых индуцированных цитозольных изменений концентрации ионов кальция и апопластического глутамата ножницами разрезают черешек или среднюю область листа L1. Для визуализации в режиме реального времени вызванных глутаматом цитозольных изменений кальция, ножницами отрежьте ножницами примерно один миллиметр от кончика листа L1 по главной вене. По крайней мере, через 20 минут нанесите 10 микролитров 100 миллимолярного глутамата на поверхность среза листа.Для анализа интенсивности флуоресценции с течением времени определите интересующей область в месте, где должна быть проанализирована интенсивность флуоресценции. Определите два ROI для расчета скорости кальциевой волны. В программном обеспечении для визуализации нажмите на измерение времени, определите и обведите.Измерьте расстояние между двумя областями, щелкнув по аннотациям и измерениям, длине и простой линии. Измерьте необработанные значения цветоскопии в каждом ROI с течением времени, щелкнув по мере, а затем экспортируйте необработанные данные в программное обеспечение для электронных таблиц, чтобы преобразовать флуоресцентный сигнал в числа в каждой точке времени. Определите базовое значение флуоресценции, которое определяется как F ноль, вычисляя среднее значение F за первые 10 кадров в записанных данных, затем нормализуйте данные F, как описано в текстовой рукописи.Для анализа волн скорости кальция определите значительную точку подъема сигнала выше предварительно стимулированных значений как представляющую обнаружение увеличения кальция в каждом ROI. Рассчитайте разницу во времени увеличения кальция между двумя ROI и расстояние между ними, чтобы определить скорости любой кальциевой волны. Здесь показано распространение раневого изменения концентраций цитозольного иона кальция и апопластического глутамата.Обрезка черешка листа у растений, экспрессивных GCaMP-3, привела к значительному увеличению кальция. Он был индуцирован локально, а затем распространился по всей сосудистой области. Сигнал быстро распространялся на соседние листья в течение нескольких минут.При срезке листа и растений, экспрессивляющих основную хитиназу I клея нюхатель, вокруг среза наблюдалось быстрое увеличение апопластического глутамата. В течение нескольких минут сигнал также распространялся через сосудистую азкулятуру. Для визуализации распространения сигнала кальция в режиме реального времени, вызванного применением глутамата, край листа у растений, экспрессирующих CCaMP-3, срезали.Это вызвало местное повышение концентрации цитозольного иона кальция, но сигнал исчез в течение нескольких минут. Примерно через 10 минут глутамат наносили на поверхность разреза, вызывая быстрое местное повышение концентрации цитозольного кальция и последующее распространение этого сигнала на дистальные листья. Для измерения изменений внутри твердой концентрации кальция, вызванной ранением в системном листе, изменение времени интенсивности сигнала GCaMP-3 измерялось в двух областях, представляющих интерес.Также были измерены изменения концентрации апопластического глутамата в ответ на механическое повреждение. Сигнатаматная сигнатная сигната демонстрировала один пик примерно через 100 секунд после ранения. Этот эксперимент должен проводиться в условиях контроля температуры и влажности, поскольку они повышены изменениями в этих условиях окружающей среды.Этот протокол предлагает потенциал для получения информации о молекулярных механизмах, лежащих в основе передачи сигналов на большие расстояния, с помощью мутантов, которые является дефектными и мнимыми элементами лабораторной сигнальной системы.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Unit 1

Principles of Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Долгосрочные изображений клетках млекопитающих использованием широкого поля микроскопии

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Объединение QD-FRET и Microfluidics для мониторинга ДНК Nanocomplex самосборки в режиме реального времени

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Определение генетических профилей выражения в С. Элеганс Использование Microarray и ПЦР в реальном времени

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Измерение пространственных и временных Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Сигналы в Arabidopsis растений

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Изображений Локальный ЦС<sup&gt; 2+</sup&gt; Сигналы в культуре клетках млекопитающих

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

В режиме реального времени изображений растений клеточной поверхности динамика с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Локальное поле флуоресцентной микроскопией: Визуализация клеточных сигналов в интактных сердцах

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

Применение Генетически кодируемые Флуоресцентные окиси азота (NO •) зондов geNOps, в режиме реального времени изображений NO • Сигналы в одиночных камерах

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...