Name: wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 och 18H05491) till MT, National Science Foundation (IOS1557899 och MCB2016177) och National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G och 80NSSC19K0126) till SG.

1. Förberedelse av växtmaterial
<ol><li>I en 1,5 ml mikrotube steriliserar ytan fröna från Arabidopsis thaliana (Col-0 anslutning) växt som uttrycker antingen GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR genom att skaka med 20% (v/v) NaClO i 3 min och sedan tvätta 5 gånger med sterilt destillerat vatten. OBS: De transgena linjerna i Arabidopsis som uttrycker GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR har beskrivits tidigare6.</li>
	<li>I en steril huva sår du 13 ytsteriliserade frön på en 10 cm fyr...

Systemisk signalering är viktigt för växter att reagera på lokaliserade externa miljöstimulanser och sedan behålla sin homeostas på en hel anläggningsnivå. Även om de inte är utrustade med ett avancerat nervsystem som djur, använder de snabb kommunikation både inom och mellan organ baserat på faktorer som mobila elektriska (och eventuellt hydrauliska) signaler och förökningsvågor av ROS och Ca2 + 46,47. Protokollet som beskrivs ovan t...

Växter kan inte fly från biotiska påfrestningar, t.ex. insekter som matar på dem, så de har utvecklat sofistikerade stressavkänning och signaltransduktionssystem för att upptäcka och sedan skydda sig mot utmaningar som växtätande1. Vid sår eller växtätare attack initierar växter snabba försvarssvar inklusive ackumulering av fytohormone jasmonic syra (JA) inte bara på den skadade platsen utan också i oskadade distala organ2. Denna JA utlöser sedan båda försvarssvaren i de direkt skadade vävnaderna och inducerar förebyggande försvar i de oskadade delarna av växten. I Arabidopsisupptäcktes ackumuleringen av JA som inducerats genom sårning i distala, intakta löv inom bara några minuter efter skador någon annanstans i växten vilket tyder på att en snabb och långdistanssignal överförs från det såradebladet 3. Flera kandidater, såsom Ca2+, reaktiva syrearter (ROS) och elektriska signaler, har föreslagits att fungera som dessa långdistanssårsignaler i växter4,5.
Ca2+ är ett av de mest mångsidiga och allestädes närvarande andra budbärarelementen i eukaryota organismer. I växter orsakar larvtuggning och mekanisk sårning drastiska ökningar av cytosolic Ca2 + koncentrationen ([Ca2 +]cyt) både i det sårade bladet och i ovävda avlägsna blad6,7. Denna systemiska Ca2 + signal tas emot av intracellulära Ca2 +-avkänningsproteiner, vilket leder till aktivering av nedströms försvarssignaleringsvägar, inklusive JA biosyntes8,9. Trots många sådana rapporter som stöder vikten av Ca2 + signaler i växt sår svar, information om rumsliga och tidsmässiga egenskaper hos Ca2 + signaler framkallas genom sårning är begränsad.
Realtidsavbildning med genetiskt kodade Ca2+-indikatorer är ett kraftfullt verktyg för att övervaka och kvantifiera den rumsliga och tidsmässiga dynamiken hos Ca2+-signaler. Hittills har versioner av sådana sensorer utvecklats som möjliggör visualisering av Ca2 + signaler på nivån för en enda cell, till vävnader, organ och till och med hela växter10. Den första genetiskt kodade biosensorn för Ca2+ som används i växter var det bioluminescerande proteinet aequorin som härrör från maneterna Aequorea victoria11. Även om detta chemiluminescent protein har använts för att upptäcka Ca2 + förändringar som svar på olika påfrestningar iväxter 12,13,14,15,16,17,18, det är inte väl lämpat för realtidsavbildning på grund av den extremt låga luminescent signalen den producerar. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserade Ca2+ indikatorer, såsom gula kamelonerna, har också framgångsrikt använts för att undersöka dynamiken i en rad Ca2 + signaleringshändelser i växter19,20,21,22,23,24. Dessa sensorer är kompatibla med bildframställningsmetoder och består oftast av Ca2 + bindande proteinkalmodulin (CaM) och en CaM-bindande peptid (M13) från en myosin ljuskedjekinas, alla smälta mellan två fluorforproteiner, i allmänhet ett cyanfluorescerande protein (CFP) och en gul fluorescerande proteinvariant (YFP)10. Ca2+ bindning till CaM främjar interaktionen mellan CaM och M13 vilket leder till en konformationsförändring av sensorn. Denna förändring främjar energiöverföring mellan den gemensamma fiskeripolitiken och YFP, vilket ökar YFP:s fluorescensintensitet samtidigt som fluorescensutsläppen från den gemensamma fiskeripolitiken minskar. Övervakningen av denna övergång från den gemensamma fiskeripolitiken till YFP-fluorescensen ger sedan ett mått på ökningen på Ca2+-nivå. Förutom dessa FRET-sensorer är en fluorescerande protein (FP)-baserade Ca2 + biosensorer, såsom GCaMP och R-GECO, också kompatibla med växtavbildningsmetoder och används ofta för att studera [Ca2 +]cytförändringar på grund av deras höga känslighet och användarvänlighet25,26,27,28,29,30. GCaMPs innehåller en enda cirkulärt permuterad (cp) GFP, återigen smält till CaM och M13-peptiden. Den Ca2+beroende interaktionen mellan CaM och M13 orsakar en konformationell förändring i sensorn som främjar en förändring i protoneringstillståndet för cpGFP, vilket förbättrar dess fluorescerande signal. Således, när Ca2 + nivåer stiger, ökar cpGFP-signalen.
För att undersökadynamiken hos Ca 2 + signaler som genereras som svar på mekanisk sårning eller växtätare utfodring, har vi använt transgena Arabidopsis thaliana växter som uttrycker en GCaMP variant, GCaMP3, och ett brett fält fluorescensmikroskop6. Detta tillvägagångssätt har lyckats visualisera snabb överföring av en långdistans Ca2 + signal från sårplatsen på ett blad till hela växten. Således upptäcktes en ökning av [Ca2 +]cyt omedelbart på sårplatsen men denna Ca2 + signal spreds sedan till de närliggande bladen genom vaskulaturen inom några minuter efter sådd. Dessutom fann vi att överföringen av denna snabba systemiska sårsignal avskaffas i Arabidopsis växter med mutationer i två glutamat receptor-liknande gener, glutamat receptorn som (GLR), GLR3.3 och GLR3.66. GLR verkar fungera som aminosyra gated Ca2 + kanaler involverade i olika fysiologiska processer, inklusivesårrespons 3,pollenrör tillväxt31,rotutveckling32,kallrespons 33, och medfödd immunitet34. Trots denna välförståeliga, breda fysiologiska funktion hos GLR, är information om deras funktionella egenskaper, såsom deras ligand specificitet, jon selektivitet och subcellulär lokalisering, begränsade35. Nyligen genomförda studier rapporterade dock att GLR3.3 och GLR3.6 är lokaliserade i phloem respektive xylem. Växt GLR har likheter med jonotropa glutamatreceptorer (iGluR)36 hos däggdjur, som aktiveras av aminosyror, såsom glutamat, glycin och D-serin i däggdjurens nervsystem37. Vi visade faktiskt att tillämpningen av 100 mM glutamat, men inte andra aminosyror, på sårplatsen inducerar en snabb, långdistans Ca2 + signal i Arabidopsis, vilket indikerar att extracellulär glutamat sannolikt fungerar som en sårsignal i växter6. Detta svar avskaffas i glr3.3/glr3.6 mutant tyder på att glutamat kan agera genom en eller båda av dessa receptorliknande kanaler och faktiskt, AtGLR3.6 visade sig nyligen vara gated av dessa nivåer av glutamat38.
I växter, förutom dess roll som en strukturell aminosyra, glutamat har också föreslagits som en viktig utvecklingsregulator39; dess rumsliga och tidsmässiga dynamik är dock dåligt förstådd. Precis som för Ca2 +har flera genetiskt kodade indikatorer för glutamat utvecklats för att övervaka dynamiken hos denna aminosyra i levande celler40,41. iGluSnFR är en GFP-baserad glutamatbiosensor med en enda FP bestående av cpGFP och ett glutamatbindande protein (GltI) från Escherichia coli42,43. Den konformationsmässiga förändringen av iGluSnFR, som induceras av glutamatbindning till GltI, resulterar i ett förbättrat GFP-fluorescensutsläpp. För att undersöka om extracellulär glutamat fungerar som en signalmolekyl i växtsårsrespons, kopplade vi iGluSnFR-sekvensen med den grundläggande chitinassignalpeptidutsöndringssekvensen (CHIB-iGluSnFR) för att lokalisera denna biosensor i det apoplastiska utrymmet6. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde avbildning av eventuella förändringar i den apoplastiska glutamatkoncentrationen ([Glu]apo) med hjälp av transgena Arabidopsis-växter som uttrycker denna sensor. Vi upptäckte snabba ökningar i iGluSnFR signalen på sårplatsen. Dessa data stöder tanken att glutamat läcker ut ur de skadade cellerna /vävnaderna till apoplasten vid sårning och fungerar som en skadesignal som aktiverar GLR och leder till långdistans Ca 2 + -signalen i växter6.
Här beskriver vi en växtomfattande realtidsavbildningsmetod med genetiskt kodade biosensorer för att övervaka och analyseradynamiken hos långdistans Ca 2 + och extracellulära glutamatsignaler som svar på sår6. Tillgången till fluorescensmikroskopi och transgena växter som uttrycker genetiskt kodade biosensorer ger ett kraftfullt, men ändå lätt implementerat tillvägagångssätt för att upptäcka snabbt överförda långdistanssignaler, såsom Ca2 + vågor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>072-00501</td>
			<td>Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) medium</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>392-00591</td>
			<td>composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ25 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR analysis</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plastic Petri dish</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis

Växter reagerar på mekaniska påfrestningar som sår och växtätande genom att inducera försvarssvar både i de skadade och i de distala oskadade delarna. Vid sårning av ett blad sker en ökning av cytosolisk kalciumjonkoncentration (Ca2 + signal) på sårplatsen. Denna signal överförs snabbt till oskadade löv, där försvarssvar aktiveras. Vår senaste forskning visade att glutamat som läcker från de sårade cellerna i bladet till apoplasten runt dem fungerar som en sårsignal. Detta glutamat aktiverar glutamatreceptorliknande Ca2 + genomsläppliga kanaler, vilket sedan leder till långdistans Ca2 + signalutbredning i hela växten. De rumsliga och tidsmässiga egenskaperna hos dessa händelser kan fångas med realtidsavbildning av levande växter som uttrycker genetiskt kodade fluorescerande biosensorer. Här introducerar vi en växtomfattande avbildningsmetod i realtid för att övervaka dynamiken hos både Ca2+ -signalerna och förändringar i apoplastiskt glutamat som uppstår som svar på sårning. Detta tillvägagångssätt använder ett brett fält fluorescensmikroskop och transgena Arabidopsis växter som uttrycker gröna fluorescerande protein (GFP) -baserade Ca2 + och glutamat biosensorer. Dessutom presenterar vi metodik för att enkelt framkalla sårinducerad, glutamat-utlöst snabb och långdistans Ca2 + signalutbredning. Detta protokoll kan också tillämpas på studier om andra växtspänningar för att hjälpa till att undersöka hur systemisk signalering av anläggningar kan vara involverade i deras signal- och svarsnätverk.

Signalspridning av [Ca2+]cyt och [Glu]apo som svar på sårning presenteras i figur 3, figur 4, film S1och film S2. Styckning av bladbladets petiole 1 i växter som uttrycker GCaMP3 (vid 0 s) ledde till en betydande ökning av [Ca2 +]cyt som snabbt inducerades lokalt genom vaskulaturen (vid 40-talet) (Figur 3 och...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis at JoVE.com

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Extracellulära glutamat-utlöst systemisk kalcium signalering är avgörande för induktion av växt försvar svar på mekanisk sårning och växtätande attack i växter. Denna artikel beskriver en metod för att visualisera den rumsliga och tidsmässiga dynamiken hos båda dessa faktorer med Arabidopsis thaliana växter som uttrycker kalcium- och glutamatkänsliga fluorescerande biosensorer.

Wide-Field, Realtidsavbildning av lokala och systemiska sårsignaler i Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Detta protokoll tillåter växtomfattande realtidsavbildning av aktiviteten i anläggningens systemiska signalsystem genom övervakning av dynamiken i kalcium och apoplastiskt glutamat som svar på sårning. Denna växtomfattande realtidsavbildningsmetod ger ett robust verktyg för att förstå dynamiken hos snabb- och långdistanssignalerna i växter, som kombinerar en hög rumslig temporal upplösning och användarvänlighet. Detta protokoll erbjuder potential att ge en ny inblick i de rumsliga och tidsmässiga egenskaperna hos systemet kalcium signalering i både biotiska och abiotiska stress svar i andra växter arter.Takuya Uemura, postdoktor från mitt laboratorium, visar att ingreppet kommer att visa att det blir Takuya Uemura. Börja med att slå på det motoriserade fluorescerande stereomikroskopet, utrustat med en 1X objektiv och en sCMOS-kamera. Konfigurera enhetsinställningarna så att de bestrålas med excitationslampa centrerad på 470 nanometer, vald med ett filter som överför ljus mellan 450 och 490 nanometer.Inhämtar emissionsljus med hjälp av ett filter som sänder mellan 510 och 560 nanometer. Ta bort locket från skålen som innehåller växten och placera det under objektivet. Kontrollera lysrörssignalen från växten.Vänta sedan i cirka 30 minuter i mörkret tills växterna är anpassade till de nya miljöförhållandena. Justera fokus och förstoring för att se hela anläggningen inom synfältet. Ställ sedan in förvärvsparametrarna för att upptäcka fluorescerande signaler med hjälp av mikroskopens bildframställningsprogram.Ställ in inspelningstiden på 11 minuter. Bild i fem minuter innan experimentet påbörjas för att acklimatisera växten till blåljusbestrålningen från mikroskopet och börja sedan spela in. För att bestämma den genomsnittliga baslinjen fluorescens registrera minst 10 ramar före sårning eller glutamat tillämpning.För realtidsavbildning av sårinducerad cytosolisk kalciumjon och apoplastiska glutamatkoncentrationsförändringar, skär petiolen eller mitten av blad L1 med sax. För realtidsavbildning av glutamat utlöste cytosoliska kalciumförändringar, skär ungefär en millimeter från spetsen av blad L1 över huvud venen med sax. Efter minst 20 minuter applicera 10 mikroliter på 100 millimolar glutamat på bladets skurna yta.För fluorescensintensitetsanalys över tid, definiera en region av intresse på den plats där fluorescensintensitet ska analyseras. Definiera två ROI för hastighetsberäkningen av kalciumvågen. I bildframställningsprogrammet klickar du på tidsmätning, definierar och cirklar.Mät avståndet mellan de två regionerna genom att klicka på anteckningar och mätning, längd och enkel linje. Mät de råa florescence-värdena i varje ROI över tid genom att klicka på måttet och exportera sedan rådata till kalkylbladsprogram för att konvertera fluorescerande signalen till tal vid varje tidpunkt. Bestäm det ursprungliga fluorescensvärdet, som är gudomligt som F-noll, genom att beräkna medelvärdet F över de första 10 bildrutorna i de registrerade data och normalisera sedan F-data enligt beskrivningen i textmanuskriptet.För analys av kalciumhastighetsvågor, definiera en signifikant signalhöjningspunkt över de förstimulerade värdena som representerar detektion av en kalciumökning i varje ROI. Beräkna tidsskillnaden i kalciumökningen mellan de två ROIs och avståndet mellan dem för att bestämma hastigheterna för någon kalciumvåg. Förökning av en sårutlöst förändring i koncentrationerna av cytosolisk kalciumjon och apoplastiskt glutamat visas här.Att skära petiole av ett blad i växter som uttrycker GCaMP-3 ledde till en betydande ökning av kalcium. Det inducerades lokalt och spreds sedan över hela vaskulaturen. Signalen spreds snabbt till närliggande löv inom några minuter.Vid skärning av ett blad och växter som uttrycker grundläggande chitinas jag lim sniffer observerades en snabb apoplastisk glutamat ökning runt den skurna regionen. Inom några minuter spreds signalen också genom vaskulaturen. För realtidsavbildning av kalciumsignalutbredning som utlöses av applicering av glutamat, skars kanten av ett blad i växter som uttrycker CCaMP-3.Detta orsakade en lokal cytosolic kalciumjonkoncentration ökning, men signalen försvann inom några minuter. Efter cirka 10 minuter applicerades glutamat på den skurna ytan, vilket orsakade en snabb lokal ökning av koncentrationen av cytosolliskt kalcium och sedan förökning av denna signal till distala löv. För att mäta förändringarna i en fast kalciumkoncentration som induceras genom sårning i det systemiska bladet mättes tidsförändringen av GCaMP-3 signalintensitet i två intresseområden.Apoplastic glutamat koncentration förändringar som svar på mekaniska skador mättes också. Glutamatsignaturen uppvisade en enda topp på cirka 100 sekunder efter sårningen. Detta experiment bör utföras under temperatur- och fuktighetskontrollerade förhållanden eftersom det är förhöjt av förändringar i dessa miljöförhållanden.Detta protokoll erbjuder en potential att ge insikter om de molekylära mekanismer som ligger till grund för långdistanssignalering genom att använda mutanter att de defekta och förmodade elementen i labbsignalsystemet.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Unit 1

Principles of Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Långsiktiga Imaging däggdjursceller med Wide-området mikroskopi

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Kombinera QD-bandet och Mikrofluidik till Monitor DNA Nanocomplex självorganisering i realtid

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Fastställande genuttryck profiler i C. elegans Använda Microarray och Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Mätning rumsliga och tids Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaler i Arabidopsis växter

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Lokala Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i odlade däggdjursceller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baserade Real-time PCR Approaches för kvantitativ mätning av mikroRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Realtid avbildning av växtcellytan Dynamisk med variabel vinkel epifluorescensmikroskopi

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Lokal Field fluorescensmikroskopi: Imaging mobilsignalerna i intakta hjärtan

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

Tillämpning av genetiskt kodade fluorescerande kväveoxid (NO •) sonder, de geNOps, i realtid avbildning av NO • Signaler i enskilda celler

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...