Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل NIH R15-HL135675-01 و NIH 2 R15-HL135675-02 إلى T.J.L.

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف
<ol><li>إعداد حلول جديدة من مثبطات الفوسفاتيز والبروتيازي.<ol><li>أضف 17.4 مجم من فلوريد فينيل ميثان سلفونيل (PMSF) إلى 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لتحضير مخزون 100 مللي مم. ملاحظة: ارتد معدات واقية عند التعامل مع PMSF لأنها خطرة عند تناولها أو استنشاقها وعند ملامستها ل?...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

هذه الطريقة هي نسخة معدلة من نهج منشور مسبقا للتجزئة تحت الخلوية دون استخدام الطرد المركزي عالي السرعة11. تتطلب هذه الطريقة المعدلة معدات أكثر تخصصا لتحقيق أفضل النتائج ، ولكنها أكثر شمولا وقابلة للتكرار باستمرار.
كان تطوير البروتوكول الأولي ضروريا بسبب عدم ال...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

التجزئة تحت الخلوية هي إجراء يتم فيه تحليل الخلايا وفصلها إلى مكوناتها المكونة من خلال عدة طرق. يمكن استخدام هذه التقنية من قبل الباحثين لتحديد توطين البروتين في خلايا الثدييات أو لإثراء البروتينات منخفضة الوفرة التي لا يمكن اكتشافها بخلاف ذلك. في حين أن طرق التجزئة تحت الخلوية موجودة حاليا ، وكذلك المجموعات التجارية التي يمكن شراؤها ، فإنها تعاني من العديد من القيود التي يحاول هذا الإجراء التغلب عليها. تعتمد معظم طرق تجزئة الخلايا حصريا على المنظفات 1,2 ، وتعتمد على استخدام مخازن مؤقتة تحتوي على كميات متزايدة من المنظفات لإذابة المكونات الخلوية المختلفة. في حين أن هذه الطريقة سريعة ومريحة ، إلا أنها تنتج كسورا غير نقية. تم تصميم هذه للسماح للباحثين بعزل واحد أو اثنين من مكونات الخلية بسهولة ، ولكنها ليست معقدة بما يكفي لعزل أجزاء متعددة تحت الخلوية من عينة في نفس الوقت. عادة ما يؤدي الاعتماد فقط على المنظفات إلى إذابة عضيات مغلقة بالغشاء وغشاء البلازما بشكل عشوائي ، مما يجعل فصل هذه المكونات أمرا صعبا. ومن المضاعفات الإضافية الناجمة عن استخدام هذه المجموعات عدم قدرة الباحثين على تغييرها / تحسينها لتطبيقات محددة ، حيث أن معظم المكونات عبارة عن تركيبات مسجلة الملكية. أخيرا ، يمكن أن تكون هذه المجموعات باهظة الثمن ، مع وجود قيود في عدد الاستخدامات تجعلها أقل من مثالية للعينات الأكبر.
على الرغم من توفر مجموعات لعزل الميتوكوندريا التي لا تعتمد على المنظفات ، إلا أنها ليست مصممة لعزل غشاء البلازما وإنتاج كميات أقل بكثير من العينة من بروتوكولات العزل القياسية 3,4. في حين أن طرق الطرد المركزي التفاضلية تستغرق وقتا أطول ، فإنها غالبا ما تؤدي إلى كسور مميزة لا يمكن الحصول عليها باستخدام مجموعات قائمة على المنظفاتحصريا 1. يسمح الفصل دون الاستخدام الوحيد للمنظفات القابلة للذوبان أيضا بمزيد من التنقية باستخدام الطرد المركزي الفائق وتدرجات كثافة isopycnic ، مما يؤدي إلى تلوث أقل تبادليا. يوضح بروتوكول التجزئة هذا عزل الأجزاء تحت الخلوية من وحيدات U937 باستخدام مزيج من الأساليب القائمة على المنظفات والطرد المركزي عالي السرعة. ستسهل هذه الطريقة عزل مكونات الغشاء النووي والسيتوبلازمي والميتوكوندريا والبلازما لخلية الثدييات مع الحد الأدنى من التلوث بين الكسور.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

يصف هذا البروتوكول طريقة للحصول على أجزاء البروتين تحت الخلوي من خلايا الثدييات باستخدام مزيج من المنظفات والتحلل الميكانيكي والطرد المركزي المتدرج لكثافة isopycnic. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه لا يعتمد على الاستخدام الوحيد للمنظفات الذائبة للحصول على كسور تحت خلوية. هذا يجعل من الممكن فصل غشاء البلازما عن عضيات الخلية الأخرى المرتبطة بالغشاء. سيسهل هذا الإجراء تحديد توطين البروتين في الخلايا بطريقة قابلة للتكرار وقابلة للتطوير وانتقائية. تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لعزل بروتينات الغشاء الخلوي والنووي والميتوكوندريا والبلازما من خط الخلايا الأحادية البشرية ، U937. على الرغم من أنه تم تحسينه لخط الخلية هذا ، إلا أن هذا الإجراء قد يكون بمثابة نقطة انطلاق مناسبة للتجزئة تحت الخلوية لخطوط الخلايا الأخرى. تتم مناقشة المزالق المحتملة للإجراء وكيفية تجنبها وكذلك التعديلات التي قد تحتاج إلى النظر في خطوط الخلايا الأخرى.

يلخص مخطط انسيابي تخطيطي لهذا الإجراء (الشكل 1) بصريا الخطوات التي تم اتخاذها لتجزئة خلايا U9375 المزروعة في التعليق بنجاح. تظهر الكسور التي تم جمعها من الجزء العلوي من تدرج كثافة isopycnic بأحجام متساوية (1 مل) تنقية كسور الميتوكوندريا والأغشية (الشكل 2</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

سيسمح بروتوكول التجزئة هذا للباحثين بعزل البروتينات السيتوبلازمية والنووية والميتوكوندريا والأغشية من خلايا الثدييات. يتم تنقية الجزأين الأخيرين تحت الخليتين بشكل أكبر عبر تدرج كثافة isopycnic.

تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

هذا البروتوكول مهم ، لأنه يوفر طريقة لفصل أربع حجرات خلوية عن بعضها البعض ، السيتوبلازم ، النواة ، الميتوكوندريا ، والغشاء. ليس ذلك فحسب ، بل إنه إجراء قابل للتطوير والتكرار وله نتائج موثوقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي فصل أربع حجرات خلوية مع الحد الأدنى من استخدام المنظفات ، مما يسمح بإجراء تجزئة أكثر قابلية للتكرار وموثوقية.لعزل البروتين الخلوي ، تنمو خلايا U937 في RPMI 1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون إلى إجمالي نهائي من ستة في 10 إلى الخلايا الثامنة. قم بالطرد المركزي للثقافة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في درجة حرارة الغرفة PBS إلى تركيز نهائي من أربعة في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر ، مع سحب بلطف لتفتيت الكتل. بعد الطرد المركزي الثاني ، أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت للتحلل البارد بالجليد A بتركيز نهائي من اثنين في 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر.أضف 7.5 ملليلتر من الخلايا إلى أنبوب مخروطي على الجليد لاستخراج البروتين النووي في نهاية المطاف ، وقم بتكوير الخلايا المتبقية عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في مخزن العزل السيتوبلازمي بتركيز نهائي قدره اثنان × 10 إلى الخلية السابعة لكل ملليلتر ، مع سحب بلطف لتفتيت الكتل ، قبل احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع دوران الطرف على النهاية. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف.جهاز طرد مركزي للطافي لترسيب الحطام الخلوي. بعد الطرد المركزي ، انقل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي جديد ، وكرر تسلسل الطرد المركزي حتى لا يمكن ملاحظة أي حبيبة. عندما تكون العينة خالية من الحطام، قم بتخزين المادة الطافية المحتوية على الكسر الخلوي لمدة تصل إلى شهر واحد عند أربع درجات مئوية.ثم أعد تعليق حبيبات الخلية المخزنة في محلول التحلل A إلى تركيز نهائي من أربعة في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. لتجانس الخلايا ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية وتخلص من المادة الطافية لإزالة الديجيتونين الزائد والملوثات الانقباضي. أعد تعليق الحبيبات في مخزن تجانس الخلايا الباردة الجليدية بتركيز نهائي من أربعة × 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر لحضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد.في هذه الأثناء ، بالنسبة للتحلل الميكانيكي القائم على الخرز ، أضف 30 جراما من حبات الفولاذ المقاوم للصدأ المغسولة مسبقا مقاس 3.2 ملم إلى 15 ملليلترا من محلول التحلل B في أنبوب ملتف سعة 50 ملليلتر على الثلج ليبرد. في نهاية الحضانة ، استبدل المخزن المؤقت في الأنبوب المغطى بتعليق خلوي وامزج الخلايا لمدة خمس دقائق بسرعة ثمانية. بعد التحلل ، انقل التجانس إلى أنبوب نظيف.جهاز طرد مركزي للتجانس ، ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. لإزالة أي حطام متبقي من العينة ، قم بجهاز الطرد المركزي للتجانس ثلاث مرات كما هو موضح ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد بعد كل طرد مركزي. بعد الطرد المركزي الأخير ، لعزل جزء الميتوكوندريا الخام ، انقل الطافي إلى أنبوب جديد للطرد المركزي.بعد الطرد المركزي ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وضع الحبيبات المحتوية على جزء الميتوكوندريا الخام على الجليد. لعزل جزء الغشاء ، قم بجهاز طرد مركزي للطافي الذي تم جمعه ، وبعد التخلص من المادة الطافية ، ضع الحبيبات المحتوية على جزء الغشاء الخام على الجليد. لتنقية تدرج كثافة isopycnic ، أعد تعليق كريات جزء الميتوكوندريا والغشاء الخام في 200 ميكرولتر من محلول التحلل B ، و 1.8 ملليلتر من اليوديكسانول.لإنشاء تدرج يوديكسانول متقطع لكل عينة ، أولا ، أضف ملليلترا واحدا من 15٪ يوديكسانول إلى قاع أنبوب طرد مركزي فائق رفيع الجدران مفتوح من الأعلى سعة ثمانية ملليلتر لكل عينة. بعد ذلك ، قم بالتتابع على أساس ملليلتر واحد من 20٪ يوديكسانول ، ملليلتر واحد من 25٪ يوديكسانول ، ملليلتر واحد من 30٪ يوديكسانول ، ومليلتر واحد من 35٪ يوديكسانول تحت طبقة 15٪ يوديكسانول في كل أنبوب. أضف ملليلتر من معلق حبيبات الميتوكوندريا الخام تحت الطبقة السفلية من تدرج واحد ، واثنين ملليلتر من معلق الحبيبات الغشائي الخام أسفل الطبقة السفلية من التدرج الثاني.ضع بعناية ملليلتر واحد من 10٪ يوديكسانول على الجزء العلوي من كل تدرج وقم بموازنة الأنابيب في حدود 10 ميكروغرام من بعضها البعض عن طريق إضافة 10٪ يوديكسانول حسب الضرورة قبل تنقية أجزاء الميتوكوندريا والأغشية عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. في نهاية الفصل ، استخدم إبرة لثقب جانب الأنابيب رقيقة الجدران لجمع الأشرطة المرئية من كل عينة. لعزل البروتين النووي ، قم بالطرد المركزي لحصة 7.5 ملليلتر من الخلايا المعلقة في محلول التحلل A ، وأعد تعليق الحبيبات في 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإذابة الخلايا الباردة الجليدية مع السحب والدوامة.احتضان التعليق على الجليد لمدة 30 دقيقة لتعطيل أغشية البلازما والعضيات ، مع حماية البروتينات النووية. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية وإعادة تعليق الحبيبات عن طريق سحب 800 ميكرولتر من محلول التحلل النووي البارد برفق مع وحدة واحدة لكل ميكرولتر من البنزوناز. احتضان الخليط على دوار من طرف إلى طرف عند أربع درجات مئوية لتعطيل الغشاء النووي.بعد 30 دقيقة ، صوتنة الخليط ثلاث مرات لمدة خمس ثوان بقوة 20٪ مع توقف لمدة خمس ثوان بين النبضات لقص الأحماض النووية. بعد الصوتنة الأخيرة ، قم بالطرد المركزي للتجانس وجمع المادة الطافية كجزء نووي دون إزعاج الحبيبات. تظهر اللطخة الغربية لكل من الكسور بعد تنقية تدرج الكثافة توطين جزء الميتوكوندريا إلى طبقات 25 و 30٪ من اليوديكسانول ، وتوطين جزء الغشاء إلى طبقات اليوديكسانول 10 و 15٪.يؤكد تحليل الدم الغربي أيضا أن كل عينة معزولة نقية وخالية من التلوث بالبروتينات من أجزاء أخرى من الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يؤكد تحليل قياس الكثافة لشدة النطاق لكل عينة قابلية التكرار والأهمية الإحصائية للبيانات. يمكن أن يؤدي التنفيذ غير السليم للتجزئة إلى انتقال تلوث المكونات الخلوية.يمكن أن يكون التركيز العالي من Histone H3 في الجزء الخلوي ، على سبيل المثال ، بسبب التوضيح غير الصحيح للجزء الخلوي. يمكن أن يؤدي الفشل أثناء تنقية كثافة isopycnic إلى تلوث جزء الغشاء. قد يكون من المفيد إجراء فحص كمي للبروتين قبل تحليل الدم الغربي للتأكد من أن الكسور تحتوي بالفعل على بروتين للسماح بتحميل الجل بناء على كمية البروتين ، وللتأكد من أن الإجراء قد تم تنفيذه بشكل صحيح.من الأهمية بمكان ألا يحتوي الجزء السيتوبلازمي على حبيبات. يمكن إجراء البقع الغربية ، أو ELISAs باتباع هذا الإجراء للسماح لك بتحليل الموقع تحت الخلوي للبروتينات المختلفة في ظل ظروف معينة. سمحت لنا هذه التقنية بتحليل الاتجار بعوامل موت الخلايا المختلفة في ظل ظروف ارتفاع السكر في الدم.وهكذا ، بالنسبة لنا ، ساعد هذا في إلقاء الضوء على آلية التحول ارتفاع السكر في الدم من موت الخلايا المبرمج إلى نخر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

تنقية البروتينات السطحية للبروتينات الخلية من<em&gt; ريبيسفالوس ميكروبلوس</em&gt; الخلايا الظهارية الظهارية

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

تنقية خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد الماوس التروية

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

تجزئة للقرار من الأنواع هونتينجتين القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

في الموقع القياس والعلاقة بين كثافة الخلية وانبعاث الضوء من البكتيريا طرحه

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

تحديد الفيرومونات لامبرى البحر باستخدام تجزئة تسترشد الحشري

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

وجود خلية من خلايا U937 في غياب الطرد المركزي عالية السرعة

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

قياس التفاعلات بين مجسات الفلورسنت والليغسين في أقسام النبات بواسطة sFLIM استنادا إلى الفلورية الاصليه

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

كثافة التدرج الطرد الفائق للتحقيق في إعادة تدوير الغدد الصماء في خلايا الثدييات

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

التنميط المتعدد بدون صانعي التدرج أو أنظمة التجزئة

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...