Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH R15-HL135675-01 og NIH 2 R15-HL135675-02 til T.J.L.

1. Forbered buffere og reagenser
<ol><li>Forbered friske opløsninger af fosfatase og proteasehæmmere.<ol><li>Tilsæt 17,4 mg phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) til 1 ml 100% ethanol for at fremstille en 100 mM bestand. BEMÆRK: Brug beskyttelsesudstyr, når du håndterer PMSF, da det er farligt, når det indtages eller indåndes og ved kontakt med hud eller øjne. Det er ætsende for øjne og hud.</li>
		<li>I henhold til producentens anvisninger skal du forberede en kommercielt tilgængelig proteasehæmmercockta...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Denne metode er en modificeret version af en tidligere offentliggjort tilgang til subcellulær fraktionering uden brug af højhastighedscentrifugering11. Denne modificerede metode kræver mere specialiseret udstyr for at opnå de bedste resultater, men er mere omfattende og konsekvent reproducerbar.
Udviklingen af den oprindelige protokol var nødvendig på grund af manglende evne til at adskille mitokondrie- og membranprøver til analyse af proteinlokalisering under ne...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Subcellulær fraktionering er en procedure, hvor celler lyseres og adskilles i deres bestanddele gennem flere metoder. Denne teknik kan bruges af forskere til at bestemme proteinlokalisering i pattedyrceller eller til berigelse af proteiner med lav forekomst, som ellers ikke ville kunne detekteres. Mens der i øjeblikket findes metoder til subcellulær fraktionering, ligesom kommercielle kits, der kan købes, lider de af flere begrænsninger, som denne procedure forsøger at overvinde. De fleste cellefraktioneringsmetoder er udelukkende vaskemiddelbaserede1,2, der er afhængige af brugen af buffere, der indeholder stigende mængder vaskemiddel til at opløse forskellige cellulære komponenter. Selvom denne metode er hurtig og praktisk, resulterer den i urene fraktioner. Disse er designet til at give forskere mulighed for let at isolere en eller to komponenter i cellen, men er ikke komplekse nok til at isolere flere subcellulære fraktioner fra en prøve på samme tid. At stole udelukkende på vaskemidler resulterer normalt i membranlukkede organeller, og plasmamembranen opløses vilkårligt, hvilket gør adskillelse af disse komponenter vanskelig. En yderligere komplikation fra brugen af disse kits er forskernes manglende evne til at ændre / optimere dem til specifikke applikationer, da de fleste af komponenterne er proprietære formuleringer. Endelig kan disse sæt være uoverkommeligt dyre med begrænsninger i antallet af anvendelser, der gør dem mindre end ideelle til større prøver.
På trods af tilgængeligheden af sæt til isolering af mitokondrier, der ikke er afhængige af vaskemidler, er de ikke designet til at isolere plasmamembranen og give betydeligt lavere mængder prøve end standardisoleringsprotokoller 3,4. Mens differentielle centrifugeringsmetoder er mere tidskrævende, resulterer de ofte i forskellige fraktioner, der ikke kan opnås med udelukkende vaskemiddelbaserede sæt1. Separation uden udelukkende brug af opløselige vaskemidler tillader også yderligere rensning ved hjælp af ultracentrifugering og isopycniske densitetsgradienter, hvilket resulterer i mindre krydskontaminering. Denne fraktioneringsprotokol demonstrerer isolering af subcellulære fraktioner fra U937-monocytter ved hjælp af en kombination af vaskemiddel- og højhastighedscentrifugeringsbaserede tilgange. Denne metode vil lette isoleringen af de nukleare, cytoplasmatiske, mitokondrielle og plasmamembrankomponenter i en pattedyrcelle med minimal forurening mellem fraktionerne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Denne protokol beskriver en metode til opnåelse af subcellulære proteinfraktioner fra pattedyrceller ved hjælp af en kombination af vaskemidler, mekanisk lysis og isopycnic densitetsgradientcentrifugering. Den største fordel ved denne procedure er, at den ikke er afhængig af den eneste anvendelse af opløselige vaskemidler for at opnå subcellulære fraktioner. Dette gør det muligt at adskille plasmamembranen fra andre membranbundne organeller i cellen. Denne procedure vil lette bestemmelsen af proteinlokalisering i celler med en reproducerbar, skalerbar og selektiv metode. Denne metode er med succes blevet anvendt til at isolere cytosoliliske, nukleare, mitokondrielle og plasmamembranproteiner fra den humane monocytcellelinje, U937. Selvom den er optimeret til denne cellelinje, kan denne procedure tjene som et passende udgangspunkt for den subcellulære fraktionering af andre cellelinjer. Potentielle faldgruber i proceduren, og hvordan man undgår dem, diskuteres, ligesom ændringer, der muligvis skal overvejes for andre cellelinjer.

Et skematisk rutediagram over denne procedure (figur 1) opsummerer visuelt de trin, der blev taget for at fraktionere U9375-celler dyrket i suspension. Fraktioner indsamlet fra toppen af den isopycnic densitetsgradient i lige store mængder (1 ml) viser rensningen af mitokondrie- og membranfraktionerne (figur 2). Brug af et antistof mod VDAC, et protein lokaliseret til den ydre mitokondriemembran6, viser, at mitoko...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Denne fraktioneringsprotokol giver forskere mulighed for at isolere cytoplasmatiske, nukleare, mitokondrie- og membranproteiner fra pattedyrceller. De to sidstnævnte subcellulære fraktioner renses yderligere via isopycnic densitetsgradient.

Cellefraktionering af U937-celler ved isopycnic densitetsgradientrensning

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Denne protokol er signifikant, fordi den giver en metode til at adskille fire cellulære rum fra hinanden, cytoplasmaet, kernen, mitokondrierne og membranen. Ikke kun det, men det er en skalerbar, reproducerbar procedure, der har pålidelige resultater. Den største fordel ved denne teknik er adskillelsen af fire cellulære rum med minimal brug af vaskemidler, hvilket giver mulighed for en meget mere reproducerbar, pålidelig fraktioneringsprocedure.Til cytosolisk proteinisolering vokser U937-celler i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid til en endelig total på seks gange 10 til de ottende celler. Centrifuger kulturen, og suspenderer cellepelleten i stuetemperatur PBS til en endelig koncentration på fire x 10 til de sjette celler pr. milliliter, pipetterer forsigtigt for at bryde klumper op. Efter en anden centrifugering resuspenderes pelleten i iskold lysisbuffer A ved en slutkoncentration på to gange 10 til de syvende celler pr. milliliter.Tilsæt 7,5 ml celler til et konisk rør på is til nedstrøms nuklear proteinekstraktion, og pellet de resterende celler ved centrifugering. Resuspender pelleten i cytoplasmatisk isolationsbuffer ved en endelig koncentration på to gange 10 til de syvende celler pr. milliliter, pipettering forsigtigt for at bryde klumper op, før cellerne inkuberes i 20 minutter ved fire grader Celsius med ende over ende rotation. Ved afslutningen af inkubationen centrifugeres cellesuspensionen og overfører supernatanten til et rent centrifugerør.Centrifuger supernatanten for at sedimentere det cellulære affald. Efter centrifugering overføres supernatanten til et nyt centrifugerør, og centrifugeringssekvensen gentages, indtil der ikke kan observeres nogen pellet. Når prøven er fri for snavs, opbevares den cytosoliske fraktionsholdige supernatant i op til en måned ved fire grader Celsius.Derefter resuspenderes den lagrede cellepellet i lysisbuffer A til en endelig koncentration på fire x 10 til de sjette celler pr. milliliter. Til cellehomogenisering centrifugeres cellesuspensionen og supernatanten kasseres for at fjerne overskydende digitonin og systoliske forurenende stoffer. Resuspender pelleten i iskolde cellers homogeniseringsbuffer ved en endelig koncentration på fire x 10 til de sjette celler pr. milliliter for en 30-minutters inkubation på is.I mellemtiden tilsættes 30 gram forvaskede rustfrit stål 3,2 millimeter perler i forvasket rustfrit stål til 15 milliliter lysisbuffer B i et 50 milliliter skørtrør på is for at køle. Ved afslutningen af inkubationen udskiftes bufferen i det skørtede rør med cellesuspension og blandes cellerne i fem minutter med hastighed otte. Efter lysis overføres homogenatet til et rent rør.Centrifuger homogenatet, og overfør derefter supernatanten til et nyt rør. For at fjerne eventuelt resterende affald fra prøven centrifugeres homogenatet tre gange som angivet og overfører supernatanten til et nyt rør efter hver centrifugering. Efter den sidste centrifugering, for at isolere den rå mitokondriefraktion, overføres supernatanten til et nyt rør til centrifugering.Efter centrifugering overføres supernatanten til et nyt rør, og den rå mitokondriefraktionsholdige pellet placeres på is. For at isolere membranfraktionen centrifugeres den opsamlede supernatant, og efter kassation af supernatanten placeres den rå membranfraktionsholdige pellet på is. Til isopycnic densitetsgradientrensning resuspenderes de rå mitokondrie- og membranfraktionspiller i 200 mikroliter lysisbuffer B og 1,8 ml iodixanol.For at skabe en diskontinuerlig iodixanolgradient for hver prøve skal du først tilføje en milliliter 15% iodixanol til bunden af et otte milliliter åbent, tyndvægget ultracentrifugerør pr. Prøve. Dernæst sekventielt underlag en milliliter 20% iodixanol, en milliliter 25% iodixanol, en milliliter 30% iodixanol og en milliliter 35% iodixanol under 15% iodixanollaget i hvert rør. Tilsæt to milliliter af den rå mitokondriepelletsuspension under bundlaget af en gradient og to milliliter af råmembranpillesuspensionen under bundlaget af den anden gradient.Læg forsigtigt en milliliter 10% iodixanol på toppen af hver gradient og afbalancer rørene inden for 10 mikrogram af hinanden ved tilsætning af 10% iodixanol efter behov, inden mitokondrie- og membranfraktionerne renses ved densitetsgradientcentrifugering. I slutningen af adskillelsen skal du bruge en nål til at punktere siden af de tyndvæggede rør for at samle de synlige bånd fra hver prøve. Til isolering af nukleart protein centrifugeres 7,5 milliliter aliquot af celler suspenderet i lysisbuffer A, og pelleten resuspenderes i 800 mikroliter iskoldcelleopløsningsbuffer med pipettering og hvirveldannelse.Inkuber suspensionen på is i 30 minutter for at forstyrre plasma- og organellemembranerne, samtidig med at de nukleare proteiner beskyttes. Ved inkubationens afslutning centrifugeres cellesuspensionen, og pelleten resuspenderes ved forsigtigt at pipettere 800 mikroliter iskold nuklear lysisbuffer suppleret med en enhed pr. mikroliter benzonase. Inkuber blandingen på en ende over ende rotator ved fire grader Celsius for at forstyrre atommembranen.Efter 30 minutter sonikeres blandingen tre gange i fem sekunder ved 20% effekt med en fem sekunders pause mellem pulser for at skære nukleinsyrerne. Efter den sidste sonikering centrifugeres homogenatet og opsamles supernatanten som den nukleare fraktion uden at forstyrre pelleten. Western blot af hver af fraktionerne efter densitetsgradientrensning viser lokalisering af mitokondriefraktionen til 25- og 30% iodixanollagene og lokalisering af membranfraktionen til 10- og 15%iodixanollagene.Vestlig blodanalyse bekræfter også, at hver isoleret prøve er ren og fri for forurening med proteiner fra andre dele af cellen. Desuden bekræfter densitometrisk analyse af båndintensiteten af hver prøve dataenes reproducerbarhed og statistiske signifikans. Forkert udførelse af fraktioneringen kan resultere i krydskontaminering af de cellulære komponenter.En høj koncentration af Histone H3 i den cytosoliske fraktion kan for eksempel skyldes forkert afklaring af den cytosoliske fraktion. Svigt under den isopycnic densitet rensning kan resultere i forurening af membranfraktionen. Det kan være nyttigt at udføre et proteinkvantificeringsassay før den vestlige blodanalyse for at bekræfte, at fraktionerne faktisk indeholder protein for at tillade gelbelastning baseret på proteinmængden, og for at bekræfte, at proceduren er korrekt udført.Det er afgørende, at den cytoplasmatiske fraktion ikke indeholder en pellet. Western blots eller ELISA'er kan udføres efter denne procedure for at give dig mulighed for at analysere den subcellulære placering af forskellige proteiner under visse betingelser. Denne teknik gjorde det muligt for os at analysere handel med forskellige celledødsfaktorer under betingelser med hyperglykæmi.Og så for os hjalp dette med at kaste lys over mekanismen for det hyperglykæmiske skift fra apoptose til nekrose.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Oprensning af biotinylerede celleoverfladeproteiner fra<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitelceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rensning af hepatocytter og sinusformet endotelceller fra mus lever Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionering for opløsning af opløselige og uopløselige Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Måling og korrelation af celle tæthed og lys Emission af en bioluminescerende bakterier

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikation af Havlampretten feromoner ved hjælp af Bioassay-styrede fraktionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Celle fraktionering af U937 celler i mangel af højhastighedstog centrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måling af interaktioner mellem fluorescerende sonder og lignin i plante sektioner af sFLIM baseret på naturlig Auto Luorescens

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Tæthedsgradient ultracentrifugering til undersøgelse af endoytisk genanvendelse i pattedyrceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysomprofilering uden gradueringsproducenter eller fraktioneringssystemer

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...