Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH R15-HL135675-01 en NIH 2 R15-HL135675-02 aan T.J.L.

1. Bereid buffers en reagentia voor
<ol><li>Bereid verse oplossingen van fosfatase en proteaseremmers.<ol><li>Voeg 17,4 mg fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) toe aan 1 ml 100% ethanol om een voorraad van 100 mM te bereiden. OPMERKING: Draag beschermende uitrusting bij het hanteren van PMSF, omdat het gevaarlijk is bij inname of inademing en bij contact met huid of ogen. Het is corrosief voor ogen en huid.</li>
		<li>Volgens de instructies van de fabrikant, bereid een in de handel verkrijgbare proteaseremmer cocktai...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Deze methode is een aangepaste versie van een eerder gepubliceerde benadering van subcellulaire fractionering zonder het gebruik van snelle centrifugatie11. Deze aangepaste methode vereist meer gespecialiseerde apparatuur om de beste resultaten te bereiken, maar is uitgebreider en consistent reproduceerbaar.
De ontwikkeling van het initiële protocol was noodzakelijk vanwege het onvermogen om mitochondriale en membraanmonsters te scheiden voor de analyse van eiwitlokali...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Subcellulaire fractionering is een procedure waarbij cellen worden gelyseerd en gescheiden in hun samenstellende componenten door middel van verschillende methoden. Deze techniek kan door onderzoekers worden gebruikt om eiwitlokalisatie in zoogdiercellen te bepalen of voor verrijking van eiwitten met een lage abundantie die anders niet detecteerbaar zouden zijn. Hoewel er momenteel methoden voor subcellulaire fractionering bestaan, net als commerciële kits die kunnen worden gekocht, lijden ze aan verschillende beperkingen die deze procedure probeert te overwinnen. De meeste celfractioneringsmethoden zijn uitsluitend op detergent gebaseerd 1,2, afhankelijk van het gebruik van buffers met toenemende hoeveelheden wasmiddel om verschillende cellulaire componenten op te lossen. Hoewel deze methode snel en handig is, resulteert het in onzuivere fracties. Deze zijn ontworpen om onderzoekers in staat te stellen gemakkelijk een of twee componenten van de cel te isoleren, maar zijn niet complex genoeg om meerdere subcellulaire fracties tegelijkertijd uit een monster te isoleren. Alleen vertrouwen op detergentia resulteert meestal in membraan-ingesloten organellen en het plasmamembraan worden willekeurig opgelost, waardoor scheiding van deze componenten moeilijk wordt. Een extra complicatie van het gebruik van deze kits is het onvermogen van onderzoekers om ze te wijzigen / optimaliseren voor specifieke toepassingen, omdat de meeste componenten gepatenteerde formuleringen zijn. Ten slotte kunnen deze kits onbetaalbaar zijn, met beperkingen in het aantal toepassingen waardoor ze minder dan ideaal zijn voor grotere monsters.
Ondanks de beschikbaarheid van kits voor de isolatie van mitochondriën die niet afhankelijk zijn van detergentia, zijn ze niet ontworpen om het plasmamembraan te isoleren en leveren ze aanzienlijk lagere hoeveelheden monster op dan standaard isolatieprotocollen 3,4. Hoewel differentiële centrifugatiemethoden tijdrovender zijn, resulteren ze vaak in verschillende fracties die niet kunnen worden verkregen met uitsluitend op detergenten gebaseerde kits1. Scheiding zonder het enige gebruik van oplosbare reinigingsmiddelen maakt ook verdere zuivering mogelijk met behulp van ultracentrifugatie en isolynische dichtheidsgradiënten, wat resulteert in minder kruisbesmetting. Dit fractioneringsprotocol demonstreert de isolatie van subcellulaire fracties uit U937-monocyten met behulp van een combinatie van op detergentie en hoge snelheid gebaseerde centrifugatiebenaderingen. Deze methode zal de isolatie van de nucleaire, cytoplasmatische, mitochondriale en plasmamembraancomponenten van een zoogdiercel vergemakkelijken met minimale besmetting tussen de fracties.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Dit protocol beschrijft een methode om subcellulaire eiwitfracties uit zoogdiercellen te verkrijgen met behulp van een combinatie van detergentia, mechanische lysis en isopycnic density gradient centrifugation. Het grote voordeel van deze procedure is dat het niet afhankelijk is van het enige gebruik van oplosbare reinigingsmiddelen om subcellulaire fracties te verkrijgen. Dit maakt het mogelijk om het plasmamembraan te scheiden van andere membraangebonden organellen van de cel. Deze procedure zal de bepaling van eiwitlokalisatie in cellen vergemakkelijken met een reproduceerbare, schaalbare en selectieve methode. Deze methode is met succes gebruikt om cytosolische, nucleaire, mitochondriale en plasmamembraaneiwitten te isoleren uit de menselijke monocytencellijn, U937. Hoewel geoptimaliseerd voor deze cellijn, kan deze procedure dienen als een geschikt startpunt voor de subcellulaire fractionering van andere cellijnen. Mogelijke valkuilen van de procedure en hoe ze te vermijden worden besproken, evenals veranderingen die mogelijk moeten worden overwogen voor andere cellijnen.

Een schematisch stroomdiagram van deze procedure (figuur 1) geeft een visuele samenvatting van de stappen die zijn genomen om U9375-cellen die in suspensie zijn gekweekt met succes te fractioneren. Fracties verzameld vanaf de bovenkant van de isolycische dichtheidsgradiënt in gelijke volumes (1 ml) tonen de zuivering van de mitochondriale en membraanfracties (figuur 2). Het gebruik van een antilichaam tegen VDAC, een eiwit gelokaliseerd ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Dit fractioneringsprotocol stelt onderzoekers in staat om cytoplasmatische, nucleaire, mitochondriale en membraaneiwitten uit zoogdiercellen te isoleren. De laatste twee subcellulaire fracties worden verder gezuiverd via isopycnic dichtheidsgradiënt.

Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Dit protocol is belangrijk, omdat het een methode biedt om vier cellulaire compartimenten van elkaar te scheiden, het cytoplasma, de kern, de mitochondriën en het membraan. Niet alleen dat, maar het is een schaalbare, reproduceerbare procedure met betrouwbare resultaten. Het grote voordeel van deze techniek is de scheiding van vier cellulaire compartimenten met minimaal gebruik van detergentia, wat een veel reproduceerbaarder, betrouwbaarder fractioneringsproces mogelijk maakt.Voor cytosolische eiwitisolatie kweekt u U937-cellen in RPMI 1640 met 10% foetaal runderserum bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot een eindtotaal van zes bij 10 tot de achtste cellen. Centrifugeer de cultuur en resuspenseer de celpellet in PBS op kamertemperatuur tot een eindconcentratie van vier bij 10 tot de zesde cellen per milliliter, waarbij zachtjes wordt gepipetteerd om klonten op te breken. Resuspensie na een tweede centrifugatie de pellet in ijskoude lysisbuffer A in een eindconcentratie van twee bij 10 tot de zevende cellen per milliliter.Voeg 7,5 milliliter cellen toe aan een conische buis op ijs voor downstream nucleaire eiwitextractie en pelleteer de resterende cellen door centrifugatie. Resuspendeer de pellet in cytoplasmatische isolatiebuffer in een eindconcentratie van twee bij 10 tot de zevende cellen per milliliter, pipetteer voorzichtig om klonten op te breken, voordat de cellen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius worden geïncubeerd met einde over eindrotatie. Aan het einde van de incubatie centrifugeert u de celsuspensie en brengt u het supernatant over naar een schone centrifugebuis.Centrifugeer het supernatant om het cellulaire puin te bezinken. Breng na centrifugatie het supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis en herhaal de centrifugatiesequentie totdat er geen pellet kan worden waargenomen. Wanneer het monster vrij is van puin, bewaart u het cytosolische fractie-bevattende supernatant gedurende maximaal één maand bij vier graden Celsius.Resuspenseer vervolgens de opgeslagen celpellet in lysisbuffer A tot een eindconcentratie van vier bij 10 tot de zesde cellen per milliliter. Voor celhomogenisatie, centrifugeer de celsuspensie en gooi het supernatant weg om overtollige digitonine en systolische verontreinigingen te verwijderen. Resuspensie de pellet in ijskoude celhomogenisatiebuffer in een eindconcentratie van vier bij 10 tot de zesde cellen per milliliter gedurende een incubatie van 30 minuten op ijs.Ondertussen, voor op kralen gebaseerde mechanische lysis, voeg 30 gram voorgewassen roestvrijstalen 3,2 millimeter kralen toe aan 15 milliliter lysisbuffer B in een 50 milliliter omzoomde buis op ijs om te koelen. Vervang aan het einde van de incubatie de buffer in de omzoomde buis door celsuspensie en meng de cellen gedurende vijf minuten op snelheid acht. Breng na lysis het homogenaat over in een schone buis.Centrifugeer het homogenaat en breng het supernatant over in een nieuwe buis. Om eventueel achtergebleven vuil uit het monster te verwijderen, moet u het homogenaat driemaal centrifugeren zoals aangegeven, waarbij het supernatant na elke centrifugatie in een nieuwe buis wordt overgebracht. Na de laatste centrifugatie, om de ruwe mitochondriale fractie te isoleren, brengt u het supernatant over naar een nieuwe buis voor centrifugatie.Breng na centrifugatie het supernatant over naar een nieuwe buis en plaats de ruwe mitochondriale fractie-bevattende pellet op ijs. Om de membraanfractie te isoleren, centrifugeert u het verzamelde supernatant en plaatst u na het weggooien van het supernatant de ruwe membraanfractie-bevattende pellet op ijs. Voor isopycische dichtheid gradiënt zuivering, resuspensie de ruwe mitochondriale en membraanfractie pellets in 200 microliter lysis buffer B, en 1,8 milliliter van iodixanol.Om een discontinue iodixanolgradiënt voor elk monster te maken, voegt u eerst een milliliter van 15% iodixanol toe aan de onderkant van een acht milliliter open, dunwandige ultracentrifugebuis per monster. Leg vervolgens achtereenvolgens één milliliter 20%iodixanol, één milliliter 25%iodixanol, één milliliter 30%iodixanol en één milliliter 35%iodixanol onder de 15%iodixanollaag in elke buis. Voeg twee milliliter van de ruwe mitochondriale pelletsuspensie toe onder de onderste laag van één gradiënt en twee milliliter van de ruwe membraankorrelsuspensie onder de onderste laag van de tweede gradiënt.Leg voorzichtig een milliliter van 10% jodidinenol op de bovenkant van elke gradiënt en balanceer de buizen binnen 10 microgram van elkaar door de toevoeging van 10% jodidinenol indien nodig voordat de mitochondriale en membraanfracties worden gezuiverd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Gebruik aan het einde van de scheiding een naald om de zijkant van de dunwandige buizen te doorboren om de zichtbare banden van elk monster te verzamelen. Voor nucleaire eiwitisolatie centrifugeer je de 7,5 milliliter aliquot cellen gesuspendeerd in lysisbuffer A en resuspensieer je de pellet in 800 microliter ijskoude celoplosbaarheidsbuffer met pipetteren en vortexen.Incubeer de suspensie op ijs gedurende 30 minuten om het plasma en de organelmembranen te verstoren, terwijl de nucleaire eiwitten worden beschermd. Aan het einde van de incubatie centrifugeert u de celsuspensie en resuspendeert u de pellet door voorzichtig te pipetteren in 800 microliter ijskoude nucleaire lysisbuffer aangevuld met één eenheid benzonase per microliter. Incubeer het mengsel op een uiteinde over de eindrotator bij vier graden Celsius om het kernmembraan te verstoren.Soniceer het mengsel na 30 minuten drie keer gedurende vijf seconden met 20% vermogen met een pauze van vijf seconden tussen de pulsen om de nucleïnezuren te scheren. Na de laatste ultrasoonapparaat, centrifugeer het homogenaat en verzamel het supernatant als de nucleaire fractie zonder de pellet te verstoren. Western blot van elk van de fracties na dichtheidsgradiëntzuivering toont lokalisatie van de mitochondriale fractie naar de 25 en 30% iodixanollagen en lokalisatie van de membraanfractie naar de 10 en 15% jodidinezuurlagen.Westerse bloedanalyse bevestigt ook dat elk geïsoleerd monster zuiver is en vrij van besmetting door eiwitten uit andere delen van de cel. Bovendien bevestigt densitometrische analyse van de bandintensiteit van elk monster de reproduceerbaarheid en statistische significantie van de gegevens. Onjuiste uitvoering van de fractionering kan leiden tot kruisbesmetting van de cellulaire componenten.Een hoge concentratie Histon H3 in de cytosolische fractie kan bijvoorbeeld te wijten zijn aan onjuiste klaring van de cytosolische fractie. Falen tijdens de isolycische dichtheidszuivering kan leiden tot verontreiniging van de membraanfractie. Het kan nuttig zijn om vóór de westerse bloedanalyse een eiwitkwantificeringstest uit te voeren om te bevestigen dat de fracties inderdaad eiwit bevatten om gelbelasting op basis van de eiwithoeveelheid mogelijk te maken en om te bevestigen dat de procedure correct is uitgevoerd.Het is van cruciaal belang dat de cytoplasmatische fractie geen pellet bevat. Western blots of ELISA's kunnen na deze procedure worden uitgevoerd om u in staat te stellen de subcellulaire locatie van verschillende eiwitten onder bepaalde omstandigheden te analyseren. Deze techniek stelde ons in staat om de handel in verschillende celdoodfactoren onder omstandigheden van hyperglycemie te analyseren.En dus hielp dit voor ons om licht te werpen op het mechanisme van de hyperglycemische verschuiving van apoptose naar necrose.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Zuivering van Biotinylated Cell Surface Proteins uit<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitheliale darmcellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Meting en de correlatie van de celdichtheid en lichte emissie van bioluminescente bacterie

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

De identificatie van de Zeeprik feromonen met behulp van de Bioassay-geleide fractionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Cel fractionering van U937 cellen in het ontbreken van snelle centrifugeren

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Meten van interacties tussen fluorescentie sondes en lignine in plantendelen door sFLIM op basis van inheemse Autofluorescentie

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...