Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par NIH R15-HL135675-01 et NIH 2 R15-HL135675-02 à T.J.L.

1. Préparer des tampons et des réactifs
<ol><li>Préparer des solutions fraîches d’inhibiteurs de phosphatase et de protéase.<ol><li>Ajouter 17,4 mg de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) à 1 mL d’éthanol à 100 % pour préparer un stock de 100 mM. NOTA : Porter un équipement de protection lors de la manipulation du PMSF, car il est dangereux lorsqu’il est ingéré ou inhalé et lorsqu’il est en contact avec la peau ou les yeux. Il est corrosif pour les yeux et la peau.</li>
		<li>Selon les in...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Cette méthode est une version modifiée d’une approche précédemment publiée du fractionnement subcellulaire sans l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse11. Cette méthode modifiée nécessite un équipement plus spécialisé pour obtenir les meilleurs résultats, mais elle est plus complète et reproductible de façon cohérente.
Le développement du protocole initial était nécessaire en raison de l’incapacité de séparer les échantillons mito...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Le fractionnement subcellulaire est une procédure dans laquelle les cellules sont lysées et séparées en leurs composants constitutifs par plusieurs méthodes. Cette technique peut être utilisée par les chercheurs pour déterminer la localisation des protéines dans les cellules de mammifères ou pour enrichir des protéines de faible abondance qui seraient autrement indétectables. Bien qu’il existe actuellement des méthodes de fractionnement subcellulaire, tout comme les kits commerciaux qui peuvent être achetés, ils souffrent de plusieurs limitations que cette procédure tente de surmonter. La plupart des méthodes de fractionnement cellulaire sont exclusivement à base de détergent1,2, reposant sur l’utilisation de tampons contenant des quantités croissantes de détergent pour solubiliser différents composants cellulaires. Bien que cette méthode soit rapide et pratique, elle aboutit à des fractions impures. Ceux-ci sont conçus pour permettre aux chercheurs d’isoler facilement un ou deux composants de la cellule, mais ne sont pas assez complexes pour isoler plusieurs fractions subcellulaires d’un échantillon en même temps. Se fier uniquement aux détergents entraîne généralement une solubilisation indiscriminée des organites enfermés dans la membrane et de la membrane plasmique, ce qui rend la séparation de ces composants difficile. Une complication supplémentaire de l’utilisation de ces kits est l’incapacité des chercheurs à les modifier/optimiser pour des applications spécifiques, car la plupart des composants sont des formulations exclusives. Enfin, ces kits peuvent être d’un coût prohibitif, avec des limites dans le nombre d’utilisations qui les rendent moins qu’idéaux pour des échantillons plus volumineux.
Malgré la disponibilité de kits pour l’isolement des mitochondries qui ne dépendent pas de détergents, ils ne sont pas conçus pour isoler la membrane plasmique et produire des quantités d’échantillon significativement inférieures aux protocoles d’isolement standard 3,4. Bien que les méthodes de centrifugation différentielle prennent plus de temps, elles aboutissent souvent à des fractions distinctes qui ne peuvent pas être obtenues avec des kits exclusivement à base de détergent1. La séparation sans utilisation exclusive de détergents solubilisants permet également une purification supplémentaire à l’aide d’ultracentrifugation et de gradients de densité isopycnique, ce qui réduit la contamination croisée. Ce protocole de fractionnement démontre l’isolement de fractions subcellulaires à partir de monocytes U937 en utilisant une combinaison d’approches basées sur la centrifugation à haute vitesse et les détergents. Cette méthode facilitera l’isolement des composants nucléaires, cytoplasmiques, mitochondriaux et plasmiques d’une cellule de mammifère avec une contamination minimale entre les fractions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Ce protocole décrit une méthode pour obtenir des fractions protéiques subcellulaires à partir de cellules de mammifères en utilisant une combinaison de détergents, de lyse mécanique et de centrifugation à gradient de densité isopycnique. L’avantage majeur de cette procédure est qu’elle ne repose pas sur l’utilisation exclusive de détergents solubilisants pour obtenir des fractions subcellulaires. Cela permet de séparer la membrane plasmique des autres organites liés à la membrane de la cellule. Cette procédure facilitera la détermination de la localisation des protéines dans les cellules avec une méthode reproductible, évolutive et sélective. Cette méthode a été utilisée avec succès pour isoler les protéines cytosoliques, nucléaires, mitochondriales et plasmiques de la lignée cellulaire monocytaire humaine, U937. Bien qu’optimisée pour cette lignée cellulaire, cette procédure peut servir de point de départ approprié pour le fractionnement subcellulaire d’autres lignées cellulaires. Les pièges potentiels de la procédure et la façon de les éviter sont discutés, tout comme les modifications qui peuvent devoir être envisagées pour d’autres lignées cellulaires.

Un organigramme schématique de cette procédure (Figure 1) résume visuellement les étapes qui ont été suivies pour fractionner avec succès les cellules U9375 cultivées en suspension. Les fractions recueillies au sommet du gradient de densité isopycnique en volumes égaux (1 mL) montrent la purification des fractions mitochondriale et membranaire (Figure 2). L’utilisation d’un anticorps contre VDAC, une protéine localisée à ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Ce protocole de fractionnement permettra aux chercheurs d’isoler des protéines cytoplasmiques, nucléaires, mitochondriales et membranaires à partir de cellules de mammifères. Les deux dernières fractions subcellulaires sont purifiées par gradient de densité isopycnique.

Fractionnement cellulaire de cellules U937 par purification par gradient de densité isopycnique

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Ce protocole est important, car il fournit une méthode pour séparer quatre compartiments cellulaires les uns des autres, le cytoplasme, le noyau, les mitochondries et la membrane. Non seulement cela, mais c’est une procédure évolutive et reproductible qui a des résultats fiables. Le principal avantage de cette technique est la séparation de quatre compartiments cellulaires avec une utilisation minimale de détergents, ce qui permet une procédure de fractionnement beaucoup plus reproductible et fiable.Pour l’isolement des protéines cytosoliques, cultiver des cellules U937 dans RPMI 1640 avec 10% de sérum bovin fœtal à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à un total final de six par 10 aux cellules huitièmes. Centrifuger la culture et remettre en suspension la pastille cellulaire dans du PBS à température ambiante jusqu’à une concentration finale de quatre par 10 à la sixième cellule par millilitre, en pipetant doucement pour briser les touffes. Après une deuxième centrifugation, remettre en suspension la pastille dans un tampon de lyse glacée A à une concentration finale de deux par 10 à la septième cellule par millilitre.Ajouter 7,5 millilitres de cellules dans un tube conique sur de la glace pour l’extraction des protéines nucléaires en aval, et enduire les cellules restantes par centrifugation. Resuspendre la pastille dans un tampon d’isolement cytoplasmique à une concentration finale de deux par 10 à la septième cellule par millilitre, en pipetant doucement pour briser les touffes, avant d’incuber les cellules pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius avec rotation bout à bout. À la fin de l’incubation, centrifuger la suspension cellulaire et transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre.Centrifuger le surnageant pour sédimenter les débris cellulaires. Après la centrifugation, transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger et répéter la séquence de centrifugation jusqu’à ce qu’aucune pastille ne puisse être observée. Lorsque l’échantillon est exempt de débris, conservez le surnageant contenant une fraction cytosolique jusqu’à un mois à quatre degrés Celsius.Ensuite, remettre en suspension la pastille de cellule stockée dans le tampon de lyse A à une concentration finale de quatre par 10 à la sixième cellule par millilitre. Pour l’homogénéisation cellulaire, centrifuger la suspension cellulaire et jeter le surnageant pour éliminer l’excès de digitonine et de contaminants systoliques. Remettez en suspension la pastille dans un tampon d’homogénéisation des cellules glacées à une concentration finale de quatre par 10 à la sixième cellule par millilitre pour une incubation de 30 minutes sur de la glace.Pendant ce temps, pour la lyse mécanique à base de billes, ajoutez 30 grammes de perles de 3,2 millimètres en acier inoxydable prélavées à 15 millilitres de tampon de lyse B dans un tube à jupe de 50 millilitres sur glace pour refroidir. À la fin de l’incubation, remplacez le tampon dans le tube jupe par une suspension cellulaire et mélangez les cellules pendant cinq minutes à la vitesse huit. Après lyse, transférer l’homogénat dans un tube propre.Centrifuger l’homogénat, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube. Pour éliminer les débris restants de l’échantillon, centrifuger l’homogénat trois fois comme indiqué, en transférant le surnageant dans un nouveau tube après chaque centrifugation. Après la dernière centrifugation, pour isoler la fraction mitochondriale brute, transférer le surnageant dans un nouveau tube pour centrifugation.Après centrifugation, transférer le surnageant dans un nouveau tube et placer la pastille brute contenant des fractions mitochondriales sur de la glace. Pour isoler la fraction membranaire, centrifuger le surnageant collecté et, après avoir jeté le surnageant, placer la pastille contenant la fraction membranaire brute sur de la glace. Pour la purification du gradient de densité isopycnique, remettre en suspension les pastilles brutes de fraction mitochondriale et membranaire dans 200 microlitres de tampon de lyse B et 1,8 millilitre d’iodixanol.Pour créer un gradient discontinu d’iodixanol pour chaque échantillon, ajoutez d’abord un millilitre d’iodixanol à 15% au fond d’un tube ultracentrifuge à paroi mince à toit ouvert de huit millilitres par échantillon. Ensuite, sous-tendez séquentiellement un millilitre de 20% iodixanol, un millilitre de 25% iodixanol, un millilitre de 30% iodixanol et un millilitre de 35% iodixanol sous la couche 15% iodixanol dans chaque tube. Ajouter deux millilitres de la suspension de granulés mitochondriaux bruts sous la couche inférieure d’un gradient, et deux millilitres de la suspension de granulés de membrane brute sous la couche inférieure du deuxième gradient.Déposer soigneusement un millilitre de 10% iodixanol sur le dessus de chaque gradient et équilibrer les tubes à moins de 10 microgrammes les uns des autres en ajoutant 10% d’iodixanol si nécessaire avant de purifier les fractions mitochondriales et membranaires par centrifugation du gradient de densité. À la fin de la séparation, utilisez une aiguille pour percer le côté des tubes à paroi mince afin de recueillir les bandes visibles de chaque échantillon. Pour l’isolement des protéines nucléaires, centrifuger l’aliquote de 7,5 millilitres des cellules en suspension dans le tampon de lyse A et remettre la pastille en suspension dans 800 microlitres de tampon de solubilisation des cellules glacées avec pipetage et vortex.Incuber la suspension sur de la glace pendant 30 minutes pour perturber les membranes plasmatiques et organitiques, tout en protégeant les protéines nucléaires. À la fin de l’incubation, centrifuger la suspension cellulaire et remettre en suspension la pastille en pipetant doucement dans 800 microlitres de tampon de lyse nucléaire glacée complétée par une unité par microlitre de benzonase. Incuber le mélange sur un rotateur bout à bout à quatre degrés Celsius pour perturber la membrane nucléaire.Après 30 minutes, sonifier le mélange trois fois pendant cinq secondes à 20% de puissance avec une pause de cinq secondes entre les impulsions pour cisailler les acides nucléiques. Après la dernière sonication, centrifuger l’homogénat et recueillir le surnageant comme fraction nucléaire sans perturber la pastille. Le transfert Western de chacune des fractions après purification du gradient de densité montre la localisation de la fraction mitochondriale aux couches de 25 et 30% d’iodixanol, et la localisation de la fraction membranaire aux couches d’iodixanol à 10 et 15%.L’analyse sanguine Western confirme également que chaque échantillon isolé est pur et exempt de contamination par des protéines provenant d’autres parties de la cellule. De plus, l’analyse densitométrique de l’intensité de la bande de chaque échantillon confirme la reproductibilité et la signification statistique des données. Une mauvaise exécution du fractionnement peut entraîner une contamination croisée des composants cellulaires.Une concentration élevée d’histone H3 dans la fraction cytosolique, par exemple, peut être due à une mauvaise clarification de la fraction cytosolique. Une défaillance lors de la purification de la densité isopycnique peut entraîner une contamination de la fraction membranaire. Il peut être utile d’effectuer un test de quantification des protéines avant l’analyse sanguine occidentale pour confirmer que les fractions contiennent bien des protéines afin de permettre la charge du gel en fonction de la quantité de protéines et pour confirmer que la procédure a été correctement exécutée.Il est essentiel que la fraction cytoplasmique ne contienne pas de pastille. Des Western blots, ou ELISA, peuvent être effectués en suivant cette procédure pour vous permettre d’analyser l’emplacement subcellulaire de différentes protéines dans certaines conditions. Cette technique nous a permis d’analyser le trafic de différents facteurs de mort cellulaire dans des conditions d’hyperglycémie.Et donc, pour nous, cela a aidé à faire la lumière sur le mécanisme du passage hyperglycémique de l’apoptose à la nécrose.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

La purification d&#39;affinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Recherche

Biochimie

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification des protéines de surface cellulaire biotinylées de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellules intestinales épithéliales

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Purification des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales foie de souris Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fractionnement pour la résolution des espèces de la huntingtine solubles et insolubles

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

L’Identification des phéromones de la lamproie marine à l’aide de fractionnement Bioassay-guidé

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Fractionnement de cellules des cellules U937 en l’Absence de Centrifugation à haute vitesse

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Mesurer les interactions entre les sondes fluorescentes et la lignine dans les sections végétales par sFLIM Basé sur l'autofluorescence indigène

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Ultracentrifugation à gradient de densité pour l’étude du recyclage endocytaire dans les cellules de mammifères

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...