Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von NIH R15-HL135675-01 und NIH 2 R15-HL135675-02 bis T.J.L.

1. Puffer und Reagenzien vorbereiten
<ol><li>Bereiten Sie frische Lösungen von Phosphatase- und Proteaseinhibitoren vor.<ol><li>17,4 mg Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) zu 1 ml 100% Ethanol hinzufügen, um eine 100 mM Brühe herzustellen. HINWEIS: Tragen Sie Schutzausrüstung beim Umgang mit PMSF, da diese bei Einnahme oder Einatmen und bei Kontakt mit Haut oder Augen gefährlich ist. Es ist ätzend für Augen und Haut.</li>
		<li>Bereiten Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers einen handelsüblichen Proteas...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Dieses Verfahren ist eine modifizierte Version eines zuvor veröffentlichten Ansatzes zur subzellulären Fraktionierung ohne den Einsatz von Hochgeschwindigkeitszentrifugation11. Diese modifizierte Methode erfordert mehr spezialisierte Ausrüstung, um die besten Ergebnisse zu erzielen, ist aber umfassender und konsistent reproduzierbar.
Die Entwicklung des ursprünglichen Protokolls war aufgrund der Unfähigkeit erforderlich, mitochondriale und Membranproben für die An...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Subzelluläre Fraktionierung ist ein Verfahren, bei dem Zellen lysiert und durch verschiedene Methoden in ihre Bestandteile getrennt werden. Diese Technik kann von Forschern verwendet werden, um die Proteinlokalisierung in Säugetierzellen zu bestimmen oder Proteine mit geringer Abundanz anzureichern, die sonst nicht nachweisbar wären. Während es derzeit Methoden zur subzellulären Fraktionierung gibt, ebenso wie kommerzielle Kits, die erworben werden können, leiden sie unter mehreren Einschränkungen, die dieses Verfahren zu überwinden versucht. Die meisten Zellfraktionierungsmethoden basieren ausschließlich auf Detergenzien1,2 und basieren auf der Verwendung von Puffern, die zunehmende Mengen an Detergens enthalten, um verschiedene zelluläre Komponenten zu lösen. Während diese Methode schnell und bequem ist, führt sie zu unreinen Fraktionen. Diese sind so konzipiert, dass Forscher eine oder zwei Komponenten der Zelle leicht isolieren können, sind aber nicht komplex genug, um mehrere subzelluläre Fraktionen gleichzeitig aus einer Probe zu isolieren. Sich ausschließlich auf Reinigungsmittel zu verlassen, führt in der Regel dazu, dass membranumschlossene Organellen und die Plasmamembran wahllos gelöst werden, was die Trennung dieser Komponenten erschwert. Eine zusätzliche Komplikation durch die Verwendung dieser Kits ist die Unfähigkeit der Forscher, sie für bestimmte Anwendungen zu ändern / zu optimieren, da die meisten Komponenten proprietäre Formulierungen sind. Schließlich können diese Kits unerschwinglich teuer sein, mit Einschränkungen in der Anzahl der Anwendungen, die sie für größere Proben nicht ideal machen.
Trotz der Verfügbarkeit von Kits für die Isolierung von Mitochondrien, die nicht auf Detergenzien angewiesen sind, sind sie nicht für die Isolierung der Plasmamembran ausgelegt und liefern signifikant geringere Probenmengen als Standard-Isolierungsprotokolle 3,4. Während differentielle Zentrifugationsmethoden zeitaufwendiger sind, führen sie oft zu unterschiedlichen Fraktionen, die mit ausschließlich waschmittelbasierten Kits nicht erhalten werden können1. Die Trennung ohne alleinige Verwendung von Solubilisierungsdetergenzien ermöglicht auch eine weitere Reinigung mittels Ultrazentrifugation und isopyknischen Dichtegradienten, was zu weniger Kreuzkontamination führt. Dieses Fraktionierungsprotokoll demonstriert die Isolierung subzellulärer Fraktionen aus U937-Monozyten unter Verwendung einer Kombination aus Detergenzien- und Hochgeschwindigkeitszentrifugationsansätzen. Diese Methode erleichtert die Isolierung der Kern-, Zytoplasma-, Mitochondrien- und Plasmamembrankomponenten einer Säugetierzelle mit minimaler Kontamination zwischen den Fraktionen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Gewinnung subzellulärer Proteinfraktionen aus Säugetierzellen unter Verwendung einer Kombination aus Detergenzien, mechanischer Lyse und isopyknischer Dichtegradientenzentrifugation. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nicht auf die alleinige Verwendung von Solubilisierungsdetergenzien angewiesen ist, um subzelluläre Fraktionen zu erhalten. Dadurch ist es möglich, die Plasmamembran von anderen membrangebundenen Organellen der Zelle zu trennen. Dieses Verfahren wird die Bestimmung der Proteinlokalisation in Zellen mit einer reproduzierbaren, skalierbaren und selektiven Methode erleichtern. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um zytosolische, nukleare, mitochondriale und Plasmamembranproteine aus der menschlichen Monozytenzelllinie U937 zu isolieren. Obwohl für diese Zelllinie optimiert, kann dieses Verfahren als geeigneter Ausgangspunkt für die subzelluläre Fraktionierung anderer Zelllinien dienen. Mögliche Fallstricke des Verfahrens und wie diese vermieden werden können, werden ebenso diskutiert wie Veränderungen, die möglicherweise für andere Zelllinien berücksichtigt werden müssen.

Ein schematisches Flussdiagramm dieses Verfahrens (Abbildung 1) fasst visuell die Schritte zusammen, die unternommen wurden, um U9375-Zellen erfolgreich zu fraktionieren, die in Suspension gezüchtet wurden. Fraktionen, die von der Oberseite des isopyknischen Dichtegradienten in gleichen Volumina (1 ml) gesammelt wurden, zeigen die Reinigung der mitochondrialen und Membranfraktionen (Abbildung 2). Die Verwendung eines Antikörpers gegen V...

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Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Dieses Fraktionierungsprotokoll wird es Forschern ermöglichen, zytoplasmatische, nukleare, mitochondriale und Membranproteine aus Säugetierzellen zu isolieren. Die beiden letztgenannten subzellulären Fraktionen werden über einen isopyknischen Dichtegradienten weiter gereinigt.

Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Methode bietet, um vier zelluläre Kompartimente voneinander zu trennen, das Zytoplasma, den Zellkern, die Mitochondrien und die Membran. Nicht nur das, sondern es ist ein skalierbares, reproduzierbares Verfahren mit zuverlässigen Ergebnissen. Der große Vorteil dieser Technik ist die Trennung von vier Zellkompartimenten mit minimalem Einsatz von Reinigungsmitteln, was ein viel reproduzierbareres, zuverlässigeres Fraktionierungsverfahren ermöglicht.Für die zytosolische Proteinisolierung züchten U937-Zellen in RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zu einer Endsumme von sechs mal 10 zu den achten Zellen. Zentrifugieren Sie die Kultur und resuspendieren Sie das Zellpellet bei Raumtemperatur PBS auf eine Endkonzentration von vier mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter, wobei Sie vorsichtig pipettieren, um Klumpen aufzubrechen. Nach einer zweiten Zentrifugation wird das Pellet in eiskaltem Lysepuffer A in einer Endkonzentration von zwei mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter resuspendiert.Fügen Sie 7,5 Milliliter Zellen in ein konisches Röhrchen auf Eis für die nachgeschaltete Kernproteinextraktion hinzu und pelletieren Sie die verbleibenden Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet im zytoplasmatischen Isolationspuffer in einer Endkonzentration von zwei mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter und pipettieren Sie vorsichtig, um Klumpen aufzubrechen, bevor die Zellen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit End-über-Ende-Rotation inkubiert werden. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellsuspension und überführen den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie den Überstand, um die Zelltrümmer zu sedimentieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt und die Zentrifugationssequenz wiederholt, bis kein Pellet mehr beobachtet werden kann. Wenn die Probe frei von Ablagerungen ist, lagern Sie den zytosolfraktionshaltigen Überstand bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius.Anschließend wird das eingelagerte Zellpellet im Lysepuffer A auf eine Endkonzentration von vier mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter resuspendiert. Für die Zellhomogenisierung zentrifugieren Sie die Zellsuspension und verwerfen den Überstand, um überschüssiges Digitonin und systolische Verunreinigungen zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in Eiskaltzellen-Homogenisierungspuffer in einer Endkonzentration von vier mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter für eine 30-minütige Inkubation auf Eis.In der Zwischenzeit fügen Sie für die mechanische Lyse auf Perlenbasis 30 Gramm vorgewaschene 3,2-Millimeter-Perlen aus Edelstahl zu 15 Milliliter Lysepuffer B in einem 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis hinzu, um zu kühlen. Am Ende der Inkubation ersetzen Sie den Puffer im Röhrchen durch eine Zellsuspension und mischen die Zellen fünf Minuten lang mit Geschwindigkeit acht. Nach der Lyse wird das Homogenat in ein sauberes Röhrchen überführt.Zentrifugieren Sie das Homogenat und überführen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen. Um verbleibende Ablagerungen aus der Probe zu entfernen, zentrifugieren Sie das Homogenat dreimal wie angegeben und übertragen Sie den Überstand nach jeder Zentrifugation in ein neues Röhrchen. Nach der letzten Zentrifugation wird der Überstand zur Zentrifugation in ein neues Röhrchen überführt, um die rohe mitochondriale Fraktion zu isolieren.Nach der Zentrifugation wird der Überstand in ein neues Röhrchen überführt und das rohe mitochondriale fraktionshaltige Pellet auf Eis gelegt. Um die Membranfraktion zu isolieren, zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand und legen Sie nach dem Verwerfen des Überstands das rohe Membranfraktions-enthaltende Pellet auf Eis. Für die isopyknische Dichtegradientenreinigung resuspendieren Sie die rohen mitochondrialen und Membranfraktionspellets in 200 Mikroliter Lysepuffer B und 1,8 Milliliter Jodixanol.Um einen diskontinuierlichen Iodixanolgradienten für jede Probe zu erzeugen, fügen Sie zunächst einen Milliliter 15% Jodixanol zum Boden eines acht Milliliter offenen, dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchens pro Probe hinzu. Als nächstes legen Sie nacheinander einen Milliliter 20% Iodixanol, einen Milliliter 25% Iodixanol, einen Milliliter 30% Iodixanol und einen Milliliter 35% Jodixanol unter die 15% Iodixanolschicht in jedem Röhrchen. Fügen Sie zwei Milliliter der rohen mitochondrialen Pelletsuspension unter der unteren Schicht eines Gradienten und zwei Milliliter der rohen Membranpelletsuspension unter der unteren Schicht des zweiten Gradienten hinzu.Schichten Sie vorsichtig einen Milliliter 10% iodixanol auf die Oberseite jedes Gradienten und gleichen Sie die Röhrchen innerhalb von 10 Mikrogramm durch Zugabe von 10% Jodixanol nach Bedarf aus, bevor Sie die mitochondrialen und Membranfraktionen durch Dichtegradientenzentrifugation reinigen. Am Ende der Trennung verwenden Sie eine Nadel, um die Seite der dünnwandigen Röhrchen zu punktieren, um die sichtbaren Bänder von jeder Probe zu sammeln. Für die Kernproteinisolierung zentrifugieren Sie das 7,5-Milliliter-Aliquot von Zellen, die im Lysepuffer A suspendiert sind, und resuspendieren Sie das Pellet in 800 Mikrolitern eiskaltem Zell-Solubilisierungspuffer mit Pipettieren und Wirbeln.Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten lang auf Eis, um das Plasma und die Organellenmembranen zu stören und gleichzeitig die Kernproteine zu schützen. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellsuspension und resuspendieren das Pellet durch vorsichtiges Pipettieren in 800 Mikrolitern eiskaltem Kernlysepuffer, ergänzt mit einer Einheit pro Mikroliter Benzonase. Inkubieren Sie die Mischung an einem End-über-Ende-Rotator bei vier Grad Celsius, um die Kernmembran zu stören.Nach 30 Minuten die Mischung dreimal für fünf Sekunden bei 20% Leistung mit einer fünfsekündigen Pause zwischen den Impulsen beschallen, um die Nukleinsäuren zu scheren. Nach der letzten Beschallung zentrifugieren Sie das Homogenat und sammeln Sie den Überstand als Kernfraktion, ohne das Pellet zu stören. Western Blot jeder der Fraktionen nach der Reinigung des Dichtegradienten zeigt die Lokalisation der mitochondrialen Fraktion zu den 25- und 30%iodixanol-Schichten und die Lokalisation der Membranfraktion zu den 10- und 15%iodixanol-Schichten.Die westliche Blutanalyse bestätigt auch, dass jede isolierte Probe rein und frei von Verunreinigungen durch Proteine aus anderen Teilen der Zelle ist. Darüber hinaus bestätigt die densitometrische Analyse der Bandenintensität jeder Probe die Reproduzierbarkeit und statistische Signifikanz der Daten. Eine unsachgemäße Durchführung der Fraktionierung kann zu einer Kreuzkontamination der zellulären Komponenten führen.Eine hohe Konzentration von Histon H3 in der zytosolischen Fraktion kann beispielsweise auf eine unsachgemäße Klärung der zytosolischen Fraktion zurückzuführen sein. Ein Versagen während der isopyknischen Dichtereinigung kann zu einer Kontamination der Membranfraktion führen. Es kann nützlich sein, vor der westlichen Blutanalyse einen Proteinquantifizierungstest durchzuführen, um zu bestätigen, dass die Fraktionen tatsächlich Protein enthalten, um eine Gelbeladung basierend auf der Proteinmenge zu ermöglichen, und um zu bestätigen, dass das Verfahren ordnungsgemäß ausgeführt wurde.Es ist wichtig, dass die zytoplasmatische Fraktion kein Pellet enthält. Western Blots oder ELISAs können nach diesem Verfahren durchgeführt werden, damit Sie die subzelluläre Position verschiedener Proteine unter bestimmten Bedingungen analysieren können. Diese Technik ermöglichte es uns, den Transport verschiedener Zelltodfaktoren unter Bedingungen der Hyperglykämie zu analysieren.Und so half uns dies, den Mechanismus der hyperglykämischen Verschiebung von der Apoptose zur Nekrose zu beleuchten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Forschung

Biochemie

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epithel-Darmzellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

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Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten

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Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation

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