Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
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इस काम को एनआईएच आर 15-एचएल 135675-01 और एनआईएच 2 आर 15-एचएल 135675-02 द्वारा टीजेएल तक समर्थित किया गया था।

1. बफर और अभिकर्मक तैयार करें
<ol><li>फॉस्फेट और प्रोटीज इनहिबिटर के ताजा समाधान तैयार करें।<ol><li>100 एमएम स्टॉक तैयार करने के लिए 100% इथेनॉल के 1 एमएल में 17.4 मिलीग्राम फेनिलमेथेनसल्फोनाइल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) जोड?...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

यह विधि उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन11 के उपयोग के बिना उपकोशिकीय विभाजन के लिए पहले प्रकाशित दृष्टिकोण का एक संशोधित संस्करण है। इस संशोधित विधि को सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए अधिक विश...

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The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

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Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

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Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

उपकोशिकीय विभाजन एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें कोशिकाओं को कई तरीकों से उनके घटक घटकों में अलग किया जाता है और अलग किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग शोधकर्ताओं द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण निर्धारित करने या कम-बहुतायत वाले प्रोटीन के संवर्धन के लिए किया जा सकता है जो अन्यथा अज्ञात होगा। जबकि उपकोशिकीय विभाजन के तरीके वर्तमान में मौजूद हैं, जैसा कि वाणिज्यिक किट खरीद सकते हैं, वे कई सीमाओं से पीड़ित हैं जिन्हें यह प्रक्रिया दूर करने का प्रयास करती है। अधिकांश सेल फ्रैक्शनेशन विधियां विशेष रूप से डिटर्जेंट-आधारित 1,2 हैं, जो विभिन्न सेलुलर घटकों को घुलनशील करने के लिए डिटर्जेंट की बढ़ती मात्रा वाले बफर के उपयोग पर निर्भर करती हैं। जबकि यह विधि तेजी से और सुविधाजनक है, इसके परिणामस्वरूप अशुद्ध अंश होते हैं। ये शोधकर्ताओं को सेल के एक या दो घटकों को आसानी से अलग करने की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, लेकिन एक ही समय में एक नमूने से कई उपकोशिकीय अंशों को अलग करने के लिए पर्याप्त जटिल नहीं हैं। पूरी तरह से डिटर्जेंट पर निर्भर रहने से आमतौर पर झिल्ली-संलग्न अंग होते हैं और प्लाज्मा झिल्ली अंधाधुंध घुलनशील हो जाती है, जिससे इन घटकों का पृथक्करण मुश्किल हो जाता है। इन किटों के उपयोग से एक अतिरिक्त जटिलता शोधकर्ताओं की विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए उन्हें बदलने / अनुकूलित करने में असमर्थता है, क्योंकि अधिकांश घटक मालिकाना फॉर्मूलेशन हैं। अंत में, ये किट निषेधात्मक रूप से महंगे हो सकते हैं, उपयोगों की संख्या में सीमाओं के साथ जो उन्हें बड़े नमूनों के लिए आदर्श से कम बनाते हैं।
माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के लिए किट की उपलब्धता के बावजूद जो डिटर्जेंट पर भरोसा नहीं करते हैं, वे प्लाज्मा झिल्ली को अलग करने और मानक अलगाव प्रोटोकॉल 3,4 की तुलना में काफी कम मात्रा में नमूना देने के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए हैं। जबकि अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन विधियां अधिक समय लेने वाली होती हैं, वे अक्सर अलग-अलग अंशों में परिणाम देते हैं जिन्हें विशेष रूप से डिटर्जेंट-आधारित किट1 के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है। घुलनशील डिटर्जेंट के एकमात्र उपयोग के बिना पृथक्करण भी अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और आइसोपिक्निक घनत्व ग्रेडिएंट का उपयोग करके आगे शुद्धिकरण की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप कम क्रॉस-संदूषण होता है। यह फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल डिटर्जेंट- और हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित दृष्टिकोणों के संयोजन का उपयोग करके यू 9 37 मोनोसाइट्स से उपकोशिकीय अंशों के अलगाव को दर्शाता है। यह विधि अंशों के बीच न्यूनतम संदूषण के साथ स्तनधारी कोशिका के परमाणु, साइटोप्लाज्मिक, माइटोकॉन्ड्रियल और प्लाज्मा झिल्ली घटकों के अलगाव की सुविधा प्रदान करेगी।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

यह प्रोटोकॉल डिटर्जेंट, मैकेनिकल लाइसिस और आइसोपिनिक घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के संयोजन का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं से उपकोशिकीय प्रोटीन अंश प्राप्त करने की एक विधि का वर्णन करता है। इस प्रक्रिया का प्रमुख लाभ यह है कि यह उपकोशिकीय अंशों को प्राप्त करने के लिए डिटर्जेंट को घुलनशील बनाने के एकमात्र उपयोग पर निर्भर नहीं करता है। इससे प्लाज्मा झिल्ली को कोशिका के अन्य झिल्ली-बाध्य अंगों से अलग करना संभव हो जाता है। यह प्रक्रिया एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्केलेबल और चयनात्मक विधि के साथ कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण के निर्धारण की सुविधा प्रदान करेगी। इस विधि का उपयोग मानव मोनोसाइट सेल लाइन, यू 9 37 से साइटोसोलिक, परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल और प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन को अलग करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। यद्यपि इस सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया गया है, यह प्रक्रिया अन्य सेल लाइनों के उपकोशिकीय विभाजन के लिए एक उपयुक्त प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम कर सकती है। प्रक्रिया के संभावित नुकसान और उनसे बचने के तरीके पर चर्चा की जाती है क्योंकि परिवर्तन हैं जिन्हें अन्य सेल लाइनों के लिए विचार करने की आवश्यकता हो सकती है।

इस प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रवाह चार्ट (चित्रा 1) उन चरणों को नेत्रहीन रूप से सारांशित करता है जो निलंबन में उगाए गए यू 9375 कोशिकाओं को सफलतापूर्वक विभाजित करने के लिए उठाए गए थे। स?...

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Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

यह फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को स्तनधारी कोशिकाओं से साइटोप्लाज्मिक, परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली प्रोटीन को अलग करने की अनुमति देगा। बाद के दो उपकोशिकीय अंशों को आइसोपिनिक घनत्व ढाल के माध्यम से और शुद्ध किया जाता है।

आइसोपिनिक घनत्व ढाल शुद्धिकरण द्वारा यू 937 कोशिकाओं का सेल फ्रैक्शनेशन

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह चार सेलुलर डिब्बों को एक दूसरे, साइटोप्लाज्म, नाभिक, माइटोकॉन्ड्रिया और झिल्ली से अलग करने की एक विधि प्रदान करता है। इतना ही नहीं, लेकिन यह एक स्केलेबल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रिया है जिसके विश्वसनीय परिणाम हैं। इस तकनीक का प्रमुख लाभ डिटर्जेंट के न्यूनतम उपयोग के साथ चार सेलुलर डिब्बों को अलग करना है, जो एक अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, विश्वसनीय विभाजन प्रक्रिया की अनुमति देता है।साइटोसोलिक प्रोटीन अलगाव के लिए, आरपीएमआई 1640 में यू 937 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 10 से आठवीं कोशिकाओं के अंतिम कुल छह तक बढ़ाएं। संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें, और कमरे के तापमान पीबीएस में सेल पेलेट को प्रति मिलीलीटर छठी कोशिकाओं तक चार बाय 10 की अंतिम एकाग्रता तक पुन: निलंबित करें, झुरमुट को तोड़ने के लिए धीरे-धीरे पाइप करें। दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, बर्फ कोल्ड लाइसिस बफर ए में पेलेट को दो बाई 10 की अंतिम सांद्रता पर प्रति मिलीलीटर सातवीं कोशिकाओं पर पुन: निलंबित करें।डाउनस्ट्रीम परमाणु प्रोटीन निष्कर्षण के लिए बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूब में 7.5 मिलीलीटर कोशिकाओं को जोड़ें, और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शेष कोशिकाओं को गोली मार दें। साइटोप्लाज्मिक आइसोलेशन बफर में गोली को दो बाई 10 की अंतिम सांद्रता पर प्रति मिलीलीटर सातवीं कोशिकाओं तक पुन: निलंबित करें, झुरमुट को तोड़ने के लिए धीरे-धीरे पाइप करें, फिर कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अंत से अंत रोटेशन के साथ इंजेक्ट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को एक साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।सेलुलर मलबे को तलछट करने के लिए सतह पर तैरने वाले तत्व को सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरने वाले को एक नए सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और सेंट्रीफ्यूजेशन अनुक्रम को तब तक दोहराएं जब तक कि कोई गोली नहीं देखी जा सके। जब नमूना मलबे से साफ हो जाता है, तो साइटोसोलिक अंश युक्त सुपरनैटेंट को चार डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक स्टोर करें।फिर लाइसिस बफर ए में संग्रहीत सेल पेलेट को प्रति मिलीलीटर छठी कोशिकाओं के लिए चार बाय 10 की अंतिम एकाग्रता में पुन: निलंबित करें। सेल होमोजेनाइजेशन के लिए, सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और अतिरिक्त डिजिटोनिन और सिस्टोलिक दूषित पदार्थों को हटाने के लिए सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। बर्फ पर 30 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए प्रति मिलीलीटर छठी कोशिकाओं के लिए चार बाई 10 की अंतिम सांद्रता पर बर्फ कोल्ड सेल होमोजेनाइजेशन बफर में गोली को फिर से निलंबित किया गया।इस बीच, मोती-आधारित यांत्रिक लाइसिस के लिए, बर्फ पर 50 मिलीलीटर स्कर्ट वाली ट्यूब में 15 मिलीलीटर लाइसिस बफर बी में 30 ग्राम प्री-धुले स्टेनलेस स्टील 3.2 मिलीमीटर मोती डालें। इनक्यूबेशन के अंत में, स्कर्ट ट्यूब में बफर को सेल सस्पेंशन के साथ बदलें और कोशिकाओं को आठ की गति से पांच मिनट के लिए ब्लेंड करें। लाइसिस के बाद, होमोजेनेट को एक साफ ट्यूब में स्थानांतरित करें।होमोजेनेट को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर सुपरनैटेंट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। नमूने से किसी भी शेष मलबे को हटाने के लिए, होमोजेनेट को तीन बार सेंट्रीफ्यूज करें, प्रत्येक सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सुपरनैटेंट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश को अलग करने के लिए, सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए सुपरनैटेंट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरने वाले को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश युक्त गोली को बर्फ पर रखें। झिल्ली अंश को अलग करने के लिए, एकत्रित सुपरनैटेंट को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाले को त्यागने के बाद कच्चे झिल्ली अंश युक्त गोली को बर्फ पर रखें। आइसोपिक्निक घनत्व ढाल शुद्धिकरण के लिए, लाइसिस बफर बी के 200 माइक्रोलीटर और आयोडिक्सानोल के 1.8 मिलीलीटर में कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंश छर्रों को फिर से निलंबित करें।प्रत्येक नमूने के लिए एक असंतुलित आयोडिक्सानोल ढाल बनाने के लिए, सबसे पहले, प्रति नमूना एक आठ मिलीलीटर ओपन-टॉप, पतली दीवार वाले अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब के निचले भाग में 15% आयोडिक्सानोल का एक मिलीलीटर जोड़ें। इसके बाद, क्रमिक रूप से प्रत्येक ट्यूब में 15% आयोडिक्सानोल परत के नीचे 20% आयोडिक्सैनोल का एक मिलीलीटर, 25% आयोडिक्सानोल का एक मिलीलीटर, 30% आयोडिक्सानोल का एक मिलीलीटर और 35% आयोडिक्सैनोल का एक मिलीलीटर कम करें। एक ढाल की निचली परत के नीचे कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल पेलेट निलंबन के दो मिलीलीटर जोड़ें, और दूसरी ढाल की निचली परत के नीचे कच्चे झिल्ली गोली निलंबन के दो मिलीलीटर जोड़ें।घनत्व प्रवणता सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों को शुद्ध करने से पहले 10% आयोडिक्सैनोल के एक मिलीलीटर को सावधानीपूर्वक प्रत्येक ढाल के शीर्ष पर परत करें और माइटोकॉन्ड्रियल और झिल्ली अंशों को शुद्ध करने से पहले 10% आयोडिक्सैनोल को जोड़कर एक दूसरे के 10 माइक्रोग्राम के भीतर ट्यूबों को संतुलित करें। पृथक्करण के अंत में, प्रत्येक नमूने से दृश्यमान बैंड एकत्र करने के लिए पतली दीवार वाली ट्यूबों के किनारे को पंचर करने के लिए एक सुई का उपयोग करें। परमाणु प्रोटीन अलगाव के लिए, लाइसिस बफर ए में निलंबित कोशिकाओं के 7.5 मिलीलीटर एलिकोट को सेंट्रीफ्यूज करें, और पेलेट को पाइपिंग और भंवर के साथ बर्फ कोल्ड सेल घुलनशीलीकरण बफर के 800 माइक्रोलीटर में फिर से निलंबित करें।परमाणु प्रोटीन की रक्षा करते हुए प्लाज्मा और ऑर्गेनेल झिल्ली को बाधित करने के लिए बर्फ पर निलंबन को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और बेंजोनेस के प्रति माइक्रोलीटर एक इकाई के साथ पूरक बर्फ के ठंडे परमाणु लाइसिस बफर के 800 माइक्रोलीटर में धीरे से पाइप करके गोली को फिर से निलंबित करें। परमाणु झिल्ली को बाधित करने के लिए मिश्रण को चार डिग्री सेल्सियस पर अंत में घुमाएं।30 मिनट के बाद, मिश्रण को 20% शक्ति पर पांच सेकंड के लिए तीन बार सोनिकेट करें, जिसमें न्यूक्लिक एसिड को कतरने के लिए दालों के बीच पांच सेकंड का ठहराव होता है। अंतिम सोनिकेशन के बाद, होमोजेनेट को सेंट्रीफ्यूज करें और पेलेट को परेशान किए बिना परमाणु अंश के रूप में सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें। घनत्व ढाल शुद्धिकरण के बाद प्रत्येक अंश का पश्चिमी धब्बा माइटोकॉन्ड्रियल अंश का 25 और 30% आयोडिक्सानोल परतों में स्थानीयकरण और झिल्ली अंश का 10 और 15% आयोडिक्सानोल परतों में स्थानीयकरण दिखाता है।पश्चिमी रक्त विश्लेषण यह भी पुष्टि करता है कि प्रत्येक पृथक नमूना शुद्ध है और कोशिका के अन्य हिस्सों से प्रोटीन द्वारा संदूषण से मुक्त है। इसके अलावा, प्रत्येक नमूने की बैंड तीव्रता का डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण डेटा की प्रजनन क्षमता और सांख्यिकीय महत्व की पुष्टि करता है। फ्रैक्शनेशन के अनुचित निष्पादन के परिणामस्वरूप सेलुलर घटकों का क्रॉस-संदूषण हो सकता है।उदाहरण के लिए, साइटोसोलिक अंश में हिस्टोन एच 3 की उच्च सांद्रता, साइटोसोलिक अंश के अनुचित स्पष्टीकरण के कारण हो सकती है। आइसोपिनिक घनत्व शुद्धिकरण के दौरान विफलता के परिणामस्वरूप झिल्ली अंश का संदूषण हो सकता है। पश्चिमी रक्त विश्लेषण से पहले प्रोटीन परिमाणीकरण परख करना उपयोगी हो सकता है ताकि यह पुष्टि की जा सके कि अंशों में वास्तव में प्रोटीन की मात्रा के आधार पर जेल लोडिंग की अनुमति देने के लिए प्रोटीन होता है, और यह पुष्टि करने के लिए कि प्रक्रिया ठीक से निष्पादित की गई है।यह महत्वपूर्ण है कि साइटोप्लाज्मिक अंश में एक गोली नहीं होती है। पश्चिमी धब्बा, या ईएलआईएसए इस प्रक्रिया के बाद किया जा सकता है ताकि आप कुछ शर्तों के तहत विभिन्न प्रोटीनों के उपकोशिकीय स्थान का विश्लेषण कर सकें। इस तकनीक ने हमें हाइपरग्लेसेमिया की स्थितियों के तहत विभिन्न कोशिका मृत्यु कारकों की तस्करी का विश्लेषण करने की अनुमति दी।और इसलिए, हमारे लिए, इसने एपोप्टोसिस से नेक्रोसिस में हाइपरग्लाइसेमिक शिफ्ट के तंत्र पर प्रकाश डालने में मदद की।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

बायोटिनिलाटेड सेल सतह प्रोटीन की शुद्धि<em&gt; राइप्सीफलस माइक्रोप्रलस</em&gt; एपिथेलियल पेट कोशिकाओं

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

माउस से हेपैटोसाइट्स और Sinusoidal Endothelial कोशिकाओं का शुद्धि जिगर छिड़काव

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

घुलनशील और अघुलनशील Huntingtin प्रजातियों के समाधान के लिए भिन्नीकरण

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

सीटू में माप और कोशिका घनत्व और Bioluminescent बैक्टीरिया के प्रकाश उत्सर्जन के सहसंबंध

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

समुद्र Lamprey Pheromones की पहचान परख का उपयोग-निर्देशित भिंन

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

उच्च गति के केंद्रापसारक के अभाव में U937 कोशिकाओं के सेल अंश

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

देशी ऑटोफ्लोरेसेंस के आधार पर एसएफआईएम द्वारा संयंत्र अनुभागों में फ्लोरोसेंट जांच और लिग्निन के बीच बातचीत को मापना

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग की जांच के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

ग्रेडिएंट मेकर्स या फ्रैक्शनेशन सिस्टम के बिना पॉलीसोम प्रोफाइलिंग

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...