Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da NIH R15-HL135675-01 e NIH 2 R15-HL135675-02 a T.J.L.

1. Preparare tamponi e reagenti
<ol><li>Preparare soluzioni fresche di fosfatasi e inibitori della proteasi.<ol><li>Aggiungere 17,4 mg di fenilmetansulfonil fluoruro (PMSF) a 1 mL di etanolo al 100% per preparare una scorta di 100 mM. NOTA: Indossare dispositivi di protezione quando si maneggia PMSF in quanto è pericoloso se ingerito o inalato e a contatto con la pelle o gli occhi. È corrosivo per gli occhi e la pelle.</li>
		<li>Secondo le istruzioni del produttore, preparare un cocktail inibitore della proteasi ...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Questo metodo è una versione modificata di un approccio precedentemente pubblicato al frazionamento subcellulare senza l'uso della centrifugazione ad alta velocità11. Questo metodo modificato richiede attrezzature più specializzate per ottenere i migliori risultati, ma è più completo e costantemente riproducibile.
Lo sviluppo del protocollo iniziale è stato necessario a causa dell'incapacità di separare campioni mitocondriali e di membrana per l'analisi della loc...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Il frazionamento subcellulare è una procedura in cui le cellule vengono lisate e separate nei loro componenti costitutivi attraverso diversi metodi. Questa tecnica può essere utilizzata dai ricercatori per determinare la localizzazione delle proteine nelle cellule di mammifero o per l'arricchimento di proteine a bassa abbondanza che altrimenti non sarebbero rilevabili. Mentre attualmente esistono metodi per il frazionamento subcellulare, così come i kit commerciali che possono essere acquistati, soffrono di diverse limitazioni che questa procedura tenta di superare. La maggior parte dei metodi di frazionamento cellulare sono esclusivamente a base di detergente1,2, basandosi sull'uso di tamponi contenenti quantità crescenti di detergente per solubilizzare diversi componenti cellulari. Mentre questo metodo è rapido e conveniente, si traduce in frazioni impure. Questi sono progettati per consentire ai ricercatori di isolare facilmente uno o due componenti della cellula, ma non sono abbastanza complessi da isolare più frazioni subcellulari da un campione allo stesso tempo. Affidarsi esclusivamente ai detergenti di solito si traduce in organelli chiusi in membrana e la membrana plasmatica solubilizzata indiscriminatamente, rendendo difficile la separazione di questi componenti. Un'ulteriore complicazione derivante dall'uso di questi kit è l'incapacità dei ricercatori di modificarli / ottimizzarli per applicazioni specifiche, poiché la maggior parte dei componenti sono formulazioni proprietarie. Infine, questi kit possono essere proibitivamente costosi, con limitazioni nel numero di usi che li rendono meno ideali per campioni più grandi.
Nonostante la disponibilità di kit per l'isolamento dei mitocondri che non si basano su detergenti, non sono progettati per isolare la membrana plasmatica e produrre quantità significativamente inferiori di campione rispetto ai protocolli di isolamento standard 3,4. Mentre i metodi di centrifugazione differenziale richiedono più tempo, spesso si traducono in frazioni distinte che non possono essere ottenute con kit esclusivamente a base di detergenti1. La separazione senza il solo uso di detergenti solubilizzanti consente anche un'ulteriore purificazione utilizzando ultracentrifugazione e gradienti di densità isopicnica, con conseguente minore contaminazione incrociata. Questo protocollo di frazionamento dimostra l'isolamento delle frazioni subcellulari dai monociti U937 utilizzando una combinazione di approcci basati su detergenti e centrifugazione ad alta velocità. Questo metodo faciliterà l'isolamento dei componenti nucleari, citoplasmatici, mitocondriali e della membrana plasmatica di una cellula di mammifero con una contaminazione minima tra le frazioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere frazioni proteiche subcellulari da cellule di mammifero utilizzando una combinazione di detergenti, lisi meccanica e centrifugazione a gradiente di densità isopicnica. Il vantaggio principale di questa procedura è che non si basa sul solo uso di detergenti solubilizzanti per ottenere frazioni subcellulari. Ciò consente di separare la membrana plasmatica da altri organelli legati alla membrana della cellula. Questa procedura faciliterà la determinazione della localizzazione delle proteine nelle cellule con un metodo riproducibile, scalabile e selettivo. Questo metodo è stato utilizzato con successo per isolare proteine citosoliche, nucleari, mitocondriali e di membrana plasmatica dalla linea cellulare monocitaria umana, U937. Sebbene ottimizzata per questa linea cellulare, questa procedura può servire come punto di partenza adatto per il frazionamento subcellulare di altre linee cellulari. Le potenziali insidie della procedura e come evitarle sono discusse così come le alterazioni che potrebbero dover essere considerate per altre linee cellulari.

Un diagramma di flusso schematico di questa procedura (Figura 1) riassume visivamente i passi che sono stati intrapresi per frazionare con successo U9375 cellule cresciute in sospensione. Le frazioni raccolte dalla parte superiore del gradiente di densità isopicnica in volumi uguali (1 ml) mostrano la purificazione delle frazioni mitocondriali e di membrana (Figura 2). L'utilizzo di un anticorpo contro VDAC, una proteina localizzata nell...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Questo protocollo di frazionamento consentirà ai ricercatori di isolare proteine citoplasmatiche, nucleari, mitocondriali e di membrana da cellule di mammifero. Le ultime due frazioni subcellulari vengono ulteriormente purificate tramite gradiente di densità isopicnica.

Frazionamento cellulare di cellule U937 mediante purificazione del gradiente di densità isopicnica

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Questo protocollo è significativo, perché fornisce un metodo per separare quattro compartimenti cellulari l'uno dall'altro, il citoplasma, il nucleo, i mitocondri e la membrana. Non solo, ma è una procedura scalabile e riproducibile che ha risultati affidabili. Il vantaggio principale di questa tecnica è la separazione di quattro compartimenti cellulari con un utilizzo minimo di detergenti, che consente una procedura di frazionamento molto più riproducibile e affidabile.Per l'isolamento delle proteine citosoliche, far crescere cellule U937 in RPMI 1640 con il 10% di siero bovino fetale a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per un totale finale di sei per 10 all'ottava cellula. Centrifugare la coltura e risospendere il pellet cellulare in PBS a temperatura ambiente a una concentrazione finale di quattro per 10 alla sesta cellula per millilitro, pipettando delicatamente per rompere i grumi. Dopo una seconda centrifugazione, risospendere il pellet nel tampone di lisi ghiacciato A ad una concentrazione finale di due per 10 alla settima cellula per millilitro.Aggiungere 7,5 millilitri di cellule a un tubo conico sul ghiaccio per l'estrazione di proteine nucleari a valle e pellettare le celle rimanenti mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in tampone di isolamento citoplasmatico ad una concentrazione finale di due per 10 alle settima cellule per millilitro, pipettando delicatamente per rompere i grumi, prima di incubare le cellule per 20 minuti a quattro gradi Celsius con rotazione end-over. Al termine dell'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare e trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga pulita.Centrifugare il surnatante per sedimentare i detriti cellulari. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga e ripetere la sequenza di centrifugazione fino a quando non si osserva alcun pellet. Quando il campione è libero dai detriti, conservare il surnatante contenente la frazione citosolica per un massimo di un mese a quattro gradi Celsius.Quindi risospendere il pellet cellulare immagazzinato nel tampone di lisi A ad una concentrazione finale di quattro per 10 alla sesta cellula per millilitro. Per l'omogeneizzazione cellulare, centrifugare la sospensione cellulare e scartare il surnatante per rimuovere i contaminanti in eccesso di digitonina e sistolica. Risospendere il pellet in tampone di omogeneizzazione di celle ghiacciate ad una concentrazione finale di quattro per 10 alla sesta cellula per millilitro per un'incubazione di 30 minuti sul ghiaccio.Nel frattempo, per la lisi meccanica a base di perline, aggiungere 30 grammi di perline di acciaio inossidabile prelavato da 3,2 millimetri a 15 millilitri di tampone di lisi B in un tubo da 50 millilitri con bordo di ghiaccio per raffreddare. Al termine dell'incubazione, sostituire il tampone nel tubo a scopa con sospensione cellulare e frullare le cellule per cinque minuti alla velocità otto. Dopo la lisi, trasferire l'omogenato in un tubo pulito.Centrifugare l'omogenato, quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Per rimuovere eventuali residui dal campione, centrifugare l'omogenato tre volte come indicato, trasferendo il surnatante in una nuova provetta dopo ogni centrifugazione. Dopo l'ultima centrifugazione, per isolare la frazione mitocondriale grezza, trasferire il surnatante in una nuova provetta per la centrifugazione.Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in un nuovo tubo e posizionare il pellet contenente frazione mitocondriale grezza su ghiaccio. Per isolare la frazione di membrana, centrifugare il surnatante raccolto e, dopo aver scartato il surnatante posizionare il pellet contenente la frazione di membrana grezza su ghiaccio. Per la purificazione del gradiente di densità isopicnica, risospendere i pellet grezzi della frazione mitocondriale e di membrana in 200 microlitri di tampone di lisi B e 1,8 millilitri di iodixanolo.Per creare un gradiente di iodixanolo discontinuo per ciascun campione, in primo luogo, aggiungere un millilitro di iodixanolo al 15% sul fondo di un tubo ultracentrifuga a parete sottile da otto millilitri per campione. Successivamente, sottoporre sequenzialmente un millilitro di 20% iodixanol, un millilitro di 25% iodixanol, un millilitro di 30% iodixanolo e un millilitro di 35% iodixanolo sotto lo strato di 15% iodixanolo in ciascun tubo. Aggiungere due millilitri della sospensione di pellet mitocondriale grezzo sotto lo strato inferiore di un gradiente e due millilitri della sospensione di pellet di membrana grezza sotto lo strato inferiore del secondo gradiente.Posizionare con cura un millilitro di 10% di iodixanolo sulla parte superiore di ciascun gradiente e bilanciare i tubi entro 10 microgrammi l'uno dall'altro aggiungendo il 10% di iodixanolo se necessario prima di purificare le frazioni mitocondriali e di membrana mediante centrifugazione a gradiente di densità. Alla fine della separazione, utilizzare un ago per perforare il lato dei tubi a parete sottile per raccogliere le bande visibili da ciascun campione. Per l'isolamento delle proteine nucleari, centrifugare l'aliquota da 7,5 millilitri di cellule sospese nel tampone di lisi A e risospendere il pellet in 800 microlitri di tampone di solubilizzazione delle celle ghiacciate con pipettaggio e vortexing.Incubare la sospensione sul ghiaccio per 30 minuti per interrompere il plasma e le membrane degli organelli, proteggendo al contempo le proteine nucleari. Al termine dell'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet pipettando delicatamente 800 microlitri di tampone di lisi nucleare ghiacciato integrato con un'unità per microlitro di Benzonase. Incubare la miscela su un rotatore terminale a quattro gradi Celsius per interrompere la membrana nucleare.Dopo 30 minuti, sonicare la miscela tre volte per cinque secondi al 20% di potenza con una pausa di cinque secondi tra gli impulsi per tagliare gli acidi nucleici. Dopo l'ultima sonicazione, centrifugare l'omogenato e raccogliere il surnatante come frazione nucleare senza disturbare il pellet. La macchia occidentale di ciascuna delle frazioni dopo la purificazione del gradiente di densità mostra la localizzazione della frazione mitocondriale negli strati di iodixanolo 25 e 30% e la localizzazione della frazione di membrana negli strati di iodixanolo 10 e 15%.L'analisi del sangue occidentale conferma anche che ogni campione isolato è puro e privo di contaminazione da proteine provenienti da altre parti della cellula. Inoltre, l'analisi densitometrica dell'intensità della banda di ciascun campione conferma la riproducibilità e la significatività statistica dei dati. L'esecuzione impropria del frazionamento può causare la contaminazione incrociata dei componenti cellulari.Un'alta concentrazione di istone H3 nella frazione citosolica, ad esempio, può essere dovuta a chiarificazione impropria della frazione citosolica. Il fallimento durante la purificazione della densità isopicnica può causare la contaminazione della frazione di membrana. Può essere utile eseguire un test di quantificazione delle proteine prima dell'analisi del sangue occidentale per confermare che le frazioni contengono effettivamente proteine per consentire il carico di gel in base alla quantità proteica e per confermare che la procedura è stata eseguita correttamente.È fondamentale che la frazione citoplasmatica non contenga un pellet. Western blots, o ELISA possono essere eseguiti seguendo questa procedura per consentire di analizzare la posizione subcellulare di diverse proteine in determinate condizioni. Questa tecnica ci ha permesso di analizzare il traffico di diversi fattori di morte cellulare in condizioni di iperglicemia.E così, per noi, questo ha contribuito a far luce sul meccanismo del passaggio iperglicemico dall'apoptosi alla necrosi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Ricerca

Biochimica

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificazione delle proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate da<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellule epiteliali delle ghiandole

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Misurazione e la correlazione di densità delle cellule ed emissione di luce di batteri bioluminescenti

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

L'identificazione di feromoni Petromyzon marinus mediante frazionamento analisi biologica-Guida

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Il frazionamento delle cellule delle cellule U937 in assenza di centrifugazione ad alta velocità

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Misurazione delle interazioni tra sonde fluorescenti e lignina nelle sezioni delle piante mediante sFLIM in base all'autofluorescenza nativa

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...