Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
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この作業は、NIH R15-HL135675-01およびNIH 2 R15-HL135675-02からT.J.L.へのサポートを受けました。

1. バッファーと試薬の調製
<ol><li>ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤の新鮮な溶液を調製する。<ol><li>17.4 mgのフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)を1 mLの100%エタノールに加え、100 mMストックを調製します。 注意: PMSFを取り扱うときは、摂取または吸入したり、皮膚や目に触れたりすると危険であるため、保護具を着用してください。目や皮膚に腐食性があります。</li>
		<li>?...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

この方法は、高速遠心分離を使用せずに細胞内分画を行う以前に発表されたアプローチの修正版です11。この変更された方法は、最良の結果を達成するためにより特殊な機器を必要としますが、より包括的で一貫して再現性があります。
ネクロトーシス中のタンパク質局在の分析のためにミトコンドリアサンプルと膜サンプルを分離することができない...

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The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

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Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
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William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

細胞内分画は、細胞を溶解し、いくつかの方法でそれらの構成成分に分離する手順です。この技術は、哺乳類細胞におけるタンパク質局在を決定したり、他の方法では検出できない低存在量のタンパク質の濃縮に研究者が使用できます。細胞内分画の方法は現在存在しますが、購入可能な市販のキットと同様に、この手順で克服しようとするいくつかの制限があります。ほとんどの細胞分画法はもっぱら界面活性剤ベースであり1,2、さまざまな細胞成分を可溶化するために、ますます多くの界面活性剤を含むバッファーの使用に依存しています。この方法は迅速で便利ですが、不純な分数になります。これらは、研究者が細胞の1つまたは2つの成分を簡単に分離できるように設計されていますが、サンプルから複数の細胞内画分を同時に分離するほど複雑ではありません。界面活性剤のみに依存すると、通常、膜に囲まれた細胞小器官と原形質膜が無差別に可溶化され、これらの成分の分離が困難になります。これらのキットの使用による追加の複雑さは、ほとんどのコンポーネントが独自の製剤であるため、研究者が特定のアプリケーション向けにそれらを変更/最適化できないことです。最後に、これらのキットは法外に高価になる可能性があり、使用回数に制限があるため、より大きなサンプルには理想的ではありません。
界面活性剤に依存しないミトコンドリアの単離のためのキットが利用可能であるにもかかわらず、それらは原形質膜を単離するようには設計されておらず、標準的な単離プロトコルよりも有意に少ない量のサンプルを生成する3,4。差動遠心分離法はより時間がかかりますが、多くの場合、洗剤ベースのキットだけでは得られない明確な画分が得られます1。可溶化界面活性剤を単独で使用せずに分離することで、超遠心分離と等密度密度勾配を使用したさらなる精製も可能になり、交差汚染が少なくなります。この分画プロトコルは、界面活性剤ベースのアプローチと高速遠心分離ベースのアプローチの組み合わせを使用して、U937単球から細胞内画分を分離することを実証しています。この方法は、画分間の汚染を最小限に抑えながら、哺乳類細胞の核、細胞質、ミトコンドリア、および原形質膜成分の単離を容易にします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

このプロトコルは、界面活性剤、機械的溶解、および等密度勾配遠心分離の組み合わせを使用して哺乳類細胞から細胞内タンパク質画分を得る方法を記載しています。この手順の主な利点は、細胞内画分を得るために可溶化洗剤の単独使用に依存しないことです。これにより、原形質膜を細胞の他の膜結合オルガネラから分離することができる。この手順は、再現性があり、スケーラブルで、選択的な方法で細胞内のタンパク質局在の決定を容易にします。この方法は、ヒト単球細胞株U937から細胞質、核、ミトコンドリア、および原形質膜タンパク質を単離するために首尾よく使用されています。この手順は、この細胞株用に最適化されているが、他の細胞株の細胞内分画の適切な出発点として役立ち得る。手順の潜在的な落とし穴とそれらを回避する方法、および他の細胞株について考慮する必要があるかもしれない変更について説明します。

この手順の概略フローチャート(図1)は、懸濁液中で増殖したU9375細胞を首尾よく分画するために取られたステップを視覚的に要約する。等量(1mL)の等密度勾配の上部から採取した画分は、ミトコンドリア画分および膜画分の精製を示す(図2)。ミトコンドリア外膜に局在するタンパク質であるVDACに対する抗体を利用する<sup class="xref"...

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Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

この分画プロトコルにより、研究者は哺乳類細胞から細胞質、核、ミトコンドリア、および膜タンパク質を単離することができます。後者の2つの細胞内画分は、等密度密度勾配を介してさらに精製される。

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

このプロトコルは、細胞質、核、ミトコンドリア、および膜の4つの細胞コンパートメントを互いに分離する方法を提供するため、重要です。それだけでなく、信頼できる結果が得られるスケーラブルで再現可能な手順です。この技術の主な利点は、洗剤の使用を最小限に抑えて4つの細胞コンパートメントを分離できることであり、これにより、はるかに再現性が高く信頼性の高い分画手順が可能になります。細胞質タンパク質を単離するには、RPMI 1640中のU937細胞を摂氏37度のウシ胎児血清と5%二酸化炭素で増殖させ、最終的に合計6 x 10から8番目の細胞に増殖させます。培養物を遠心分離し、細胞ペレットを室温PBSに再懸濁して、1ミリリットル当たり4×10の最終濃度まで6細胞、穏やかにピペッティングして凝集塊を分割する。2回目の遠心分離の後、ペレットを1ミリリットル当たり10個ずつ7個目の細胞で終濃度の氷冷溶解緩衝液Aに再懸濁する。下流の核タンパク質抽出のために7.5ミリリットルの細胞を氷上の円錐形のチューブに加え、遠心分離によって残りの細胞をペレット化します。ペレットを細胞質単離バッファーに最終濃度2 x 10で7番目の細胞/ミリリットルに再懸濁し、穏やかにピペッティングして塊を分解してから、細胞を摂氏4度で20分間インキュベートし、エンドオーバーエンド回転させます。インキュベーションの最後に、細胞懸濁液を遠心分離し、上清をきれいな遠沈管に移します。上清を遠心分離して細胞残渣を沈降させる。遠心分離後、上清を新しい遠沈管に移し、ペレットが観察されなくなるまで遠心分離シーケンスを繰り返します。サンプルに破片がなくなったら、細胞質ゾル画分を含む上清を摂氏4度で最大1か月間保管します。次いで、保存した細胞ペレットを溶解緩衝液Aに、1ミリリットル当たり6個ずつ4個ずつ10個の最終濃度まで再懸濁する。細胞ホモジナイゼーションのために、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄して、過剰なジギトニンおよび収縮期汚染物質を除去します。ペレットを氷冷セルホモジナイゼーションバッファーに最終濃度4×10で再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。一方、ビーズベースの機械的溶解の場合は、氷上で50ミリリットルのスカート付きチューブ内の15ミリリットルの溶解バッファーBに、30グラムの事前に洗浄したステンレス鋼3.2ミリメートルビーズを加えて冷却します。インキュベーションの最後に、スカートチューブ内のバッファーを細胞懸濁液と交換し、細胞を速度8で5分間ブレンドします。溶解後、ホモジネートをきれいなチューブに移します。ホモジネートを遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。サンプルから残っている破片を取り除くには、示されているようにホモジネートを3回遠心分離し、各遠心分離後に上清を新しいチューブに移します。最後の遠心分離の後、粗ミトコンドリア画分を単離するために、上清を遠心分離用の新しいチューブに移す。遠心分離後、上清を新しいチューブに移し、粗ミトコンドリア画分含有ペレットを氷上に置きます。膜画分を単離するには、回収した上清を遠心分離し、上清を捨てた後、粗膜画分含有ペレットを氷上に置く。等密度勾配精製のために、粗ミトコンドリアおよび膜画分ペレットを200マイクロリットルの溶解バッファーBおよび1.8ミリリットルのヨージキサノールに再懸濁します。各サンプルの不連続ヨージキサノール勾配を作成するには、まず、サンプルごとに1つの8ミリリットルのオープントップの薄肉超遠心チューブの底に1ミリリットルの15%ヨージキサノールを追加します。次に、各チューブの15%ヨージキサノール層の下に、20%ヨージキサノール1ミリリットル、25%ヨージキサノール1ミリリットル、30%ヨージキサノール1ミリリットル、35%ヨージキサノール1ミリリットルを順次下敷きにする。1つの勾配の最下層の下に2ミリリットルの粗ミトコンドリアペレット懸濁液を加え、第2の勾配の最下層の下に2ミリリットルの粗膜ペレット懸濁液を加える。各グラジエントの上部に1ミリリットルの10%ヨージキサノールを慎重に重ね、必要に応じて10%ヨージキサノールを添加してチューブを互いに10マイクログラム以内にバランスさせた後、密度勾配遠心分離によってミトコンドリア画分と膜画分を精製します。分離の最後に、針を使用して薄肉チューブの側面に穴を開け、各サンプルから目に見えるバンドを収集します。核タンパク質単離のために、溶解バッファーAに懸濁された7.5ミリリットルの細胞アリコートを遠心分離し、ピペッティングとボルテックスを使用してペレットを800マイクロリットルの氷冷細胞可溶化バッファーに再懸濁します。懸濁液を氷上で30分間インキュベートして、核タンパク質を保護しながら、血漿膜と細胞小器官を破壊します。インキュベーションの最後に、細胞懸濁液を遠心分離し、ベンゾナーゼ1マイクロリットルあたり1単位を添加した800マイクロリットルの氷冷核溶解バッファーに穏やかにピペッティングしてペレットを再懸濁します。混合物を摂氏4度のエンドオーバーエンドローテーターでインキュベートして、核膜を破壊します。30分後、核酸を剪断するためにパルスの間に5秒間休止して、20%パワーで5秒間混合物を3回超音波処理する。最後の超音波処理の後、ホモジネートを遠心分離し、ペレットを乱すことなく核画分として上清を収集する。密度勾配精製後の各画分のウェスタンブロットは、ミトコンドリア画分の25%および30%ヨージキサノール層への局在化、および10%および15%のヨージキサノール層への膜画分の局在を示す。西洋の血液分析では、単離された各サンプルが純粋であり、細胞の他の部分からのタンパク質による汚染がないことも確認されています。さらに、各サンプルのバンド強度の濃度測定分析により、データの再現性と統計的有意性が確認されます。分画の不適切な実行は、細胞成分の相互汚染を引き起こす可能性があります。例えば、細胞質画分中の高濃度のヒストンH3は、細胞質画分の不適切な清澄化が原因である可能性があります。等密度密度精製中に失敗すると、膜画分が汚染される可能性があります。西洋血液分析の前にタンパク質定量アッセイを実行して、タンパク質量に基づいてゲルローディングを可能にするために画分に実際にタンパク質が含まれていることを確認し、手順が適切に実行されたことを確認すると便利です。細胞質画分がペレットを含まないことが重要です。ウェスタンブロットまたはELISAは、特定の条件下で異なるタンパク質の細胞内位置を解析できるように、この手順に従って実行できます。この技術により、高血糖条件下でのさまざまな細胞死因子の輸送を分析することができました。そして、私たちにとって、これはアポトーシスから壊死への高血糖シフトのメカニズムに光を当てるのに役立ちました。

Research

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