Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
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이 작업은 NIH R15-HL135675-01 및 NIH 2 R15-HL135675-02에서 TJL로 지원되었습니다.

1. 완충액 및 시약 준비
<ol><li>포스파타아제와 프로테아제 억제제의 신선한 용액을 준비하십시오.<ol><li>100% 에탄올 1mL에 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF) 17.4mg을 첨가하여 100mM 스톡을 제조하였다. 알림: PMSF를 섭취하거나 흡입하거나 피부나 눈에 닿으면 위험하므로 취급할 때는 보호 장비를 착용하십시오. 눈과 피부에 부식성이 있습니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 시판되는 프로테아?...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

이 방법은 고속 원심분리(11)를 사용하지 않고 세포내 분획화에 대한 이전에 공개된 접근법의 수정된 버전이다. 이 수정된 방법은 최상의 결과를 얻기 위해 보다 전문화된 장비가 필요하지만 더 포괄적이고 일관되게 재현할 수 있습니다.
초기 프로토콜의 개발은 괴사12 동안 단백질 국소화 분석을 위해 미토콘드리아 및 막 샘플을 분리 할 수...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

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Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

세포 내 분획은 세포를 용해시키고 여러 가지 방법을 통해 구성 성분으로 분리하는 절차입니다. 이 기술은 연구원들이 포유류 세포에서 단백질 국소화를 결정하거나 다른 방법으로는 검출할 수 없는 저농도 단백질의 농축에 사용할 수 있습니다. 세포 내 분획 방법이 현재 존재하지만 구입할 수있는 상업용 키트와 마찬가지로이 절차가 극복하려고 시도하는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 대부분의 세포 분획 방법은 독점적으로 세제 기반1,2이며, 다양한 세포 구성 요소를 가용화하기 위해 증가하는 양의 세제를 포함하는 완충액을 사용합니다. 이 방법은 빠르고 편리하지만 불순한 분획을 초래합니다. 이들은 연구자들이 세포의 하나 또는 두 개의 구성 요소를 쉽게 분리 할 수 있도록 설계되었지만 동시에 샘플에서 여러 세포 내 분획을 분리 할만큼 복잡하지는 않습니다. 세제에만 의존하면 일반적으로 막으로 둘러싸인 세포 기관과 원형질막이 무차별적으로 가용화되어 이러한 구성 요소의 분리가 어려워집니다. 이러한 키트의 사용으로 인한 추가적인 복잡성은 대부분의 구성 요소가 독점 제형이기 때문에 연구자가 특정 응용 분야에 맞게 키트를 변경/최적화할 수 없다는 것입니다. 마지막으로, 이러한 키트는 엄청나게 비쌀 수 있으며 사용 횟수에 제한이 있어 더 큰 샘플에 적합하지 않습니다.
세제에 의존하지 않는 미토콘드리아 분리용 키트를 사용할 수 있음에도 불구하고 원형질막을 분리하고 표준 분리 프로토콜 3,4보다 훨씬 적은 양의 샘플을 생성하도록 설계되지 않았습니다. 차등 원심분리 방법은 시간이 더 많이 걸리지만 세제 기반 키트1만으로는 얻을 수 없는 뚜렷한 분획을 생성하는 경우가 많습니다. 가용화 세제만 사용하지 않고 분리하면 초원심분리 및 등압 밀도 구배를 사용하여 추가 정제가 가능하여 교차 오염이 줄어듭니다. 이 분획 프로토콜은 세제 및 고속 원심분리 기반 접근법의 조합을 사용하여 U937 단핵구에서 세포 내 분획을 분리하는 것을 보여줍니다. 이 방법은 포유류 세포의 핵, 세포질, 미토콘드리아 및 원형질막 성분의 분리를 용이하게 할 것이며 분획들 사이의 오염을 최소화 할 것이다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

이 프로토콜은 세제, 기계적 용해 및 등핵 밀도 구배 원심분리의 조합을 사용하여 포유동물 세포로부터 세포내 단백질 분획을 얻는 방법을 설명합니다. 이 절차의 가장 큰 장점은 세포 내 분획을 얻기 위해 가용화 세제의 단독 사용에 의존하지 않는다는 것입니다. 이것은 원형질막을 세포의 다른 막 결합 세포 기관으로부터 분리하는 것을 가능하게한다. 이 절차는 재현 가능하고 확장 가능하며 선택적인 방법으로 세포에서 단백질 국소화의 결정을 용이하게 할 것입니다. 이 방법은 인간 단핵구 세포주 U937에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 원형질막 단백질을 분리하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 세포주에 최적화되어 있지만, 이 절차는 다른 세포주의 세포하 분획을 위한 적합한 시작점으로서 작용할 수 있다. 절차의 잠재적 함정과 이를 피하는 방법은 다른 세포주에 대해 고려해야 할 수 있는 변경 사항과 마찬가지로 논의됩니다.

이 절차의 개략적인 순서도(그림 1)는 현탁액에서 성장한 U9375 세포를 성공적으로 분획하기 위해 취한 단계를 시각적으로 요약합니다. 동일한 부피(1mL)의 등핵 밀도 구배의 상단에서 수집된 분획은 미토콘드리아 및 막 분획의 정제를 보여줍니다(그림 2). 외부 미토콘드리아 막6에 국한된 단백질인 VDAC에 대한 항체를 ?...

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Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

이 분획 프로토콜을 통해 연구자들은 포유류 세포에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 단백질을 분리 할 수 있습니다. 후자의 2 개의 세포 내 분획은 isopycnic 밀도 구배를 통해 추가로 정제됩니다.

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

이 프로토콜은 4개의 세포 구획, 즉 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막을 서로 분리하는 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 뿐만 아니라 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 확장 가능하고 재현 가능한 절차입니다. 이 기술의 주요 장점은 세제를 최소한으로 사용하여 4개의 세포 구획을 분리하여 훨씬 더 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 분별 절차를 가능하게 한다는 것입니다.세포질 단백질 분리를 위해 RPMI 1640에서 U937 세포를 섭씨 37도에서 10% 태아 소 혈청 및 5% 이산화탄소로 성장시켜 최종 총 6x10에서 8번째 세포까지 성장시킵니다. 배양물을 원심분리하고, 세포 펠렛을 실온 PBS에 재현탁시켜 최종 농도인 4 밀리리터당 10 내지 6번째 세포로, 피펫팅하여 덩어리를 분해한다. 2차 원심분리 후, 펠렛을 얼음 냉기 용해 완충액 A에 밀리리터당 2 x 10 내지 7번째 세포 농도로 재현탁시킨다.다운스트림 핵 단백질 추출을 위해 얼음 위의 원뿔형 튜브에 7.5ml의 세포를 추가하고 원심분리로 나머지 세포를 펠릿화합니다. 펠릿을 밀리리터당 7번째 세포에 2x10의 최종 농도로 세포질 분리 완충액에 재현탁하고, 덩어리를 분해하기 위해 부드럽게 피펫팅한 다음, 종단 간 회전과 함께 섭씨 4도에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 세포 현탁액을 원심분리하고 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮깁니다.상청액을 원심분리하여 세포 파편을 침전시킵니다. 원심분리 후, 상청액을 새로운 원심분리 튜브로 옮기고, 펠릿이 관찰되지 않을 때까지 원심분리 순서를 반복한다. 샘플에 파편이 없으면 세포질 분획 함유 상청액을 섭씨 4도에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.이어서 용해 완충액 A에 저장된 세포 펠렛을 밀리리터당 4 x 10 내지 6 세포의 최종 농도가 되도록 재현탁시킨다. 세포 균질화를 위해 세포 현탁액을 원심분리하고 상청액을 폐기하여 과도한 digitonin 및 수축기 오염 물질을 제거합니다. 펠렛을 얼음 위에서 30분 동안 6번째 세포 밀리리터당 10 내지 4의 최종 농도로 빙냉 세포 균질화 완충액에 재현탁시킨다.한편, 비드 기반 기계적 용해의 경우 얼음 위의 50밀리리터 스커트 튜브에 15밀리리터의 용해 완충액 B에 미리 세척된 스테인리스 스틸 3.2mm 비드 30g을 추가하여 냉각합니다. 배양이 끝나면 스커트 튜브의 완충액을 세포 현탁액으로 교체하고 세포를 속도 8로 5 분 동안 혼합합니다. 용해 후, 균질 액을 깨끗한 튜브로 옮긴다.균질 액을 원심 분리한 다음 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 샘플에서 남아 있는 파편을 제거하려면 지시된 대로 균질액을 3회 원심분리하고 각 원심분리 후 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 마지막 원심분리 후, 미토콘드리아 분획을 분리하기 위해, 원심분리를 위해 상청액을 새로운 튜브로 옮긴다.원심분리 후, 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 미토콘드리아 분획 함유 펠렛을 얼음 위에 놓습니다. 막 분획을 분리하기 위해, 수집된 상등액을 원심분리하고, 상층액을 버린 후 막 분획 함유 조질 펠렛을 얼음 위에 놓았다. 등핵 밀도 구배 정제의 경우, 미토콘드리아 및 막 분획 펠릿을 200 마이크로리터의 용해 완충액 B 및 1.8 밀리리터의 요오드산올에 재현탁시킨다.각 샘플에 대해 불연속 요오드 요오드 구배를 생성하려면 먼저 샘플 당 1 개의 8 밀리리터 개방형 얇은 벽의 초 원심 분리 튜브의 바닥에 15 % 요오드 산올 1 밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 각 튜브의 15 % 요오드 산올 층 아래에 20 % 요오드 산올 1 밀리리터, 25 % 요오드 산올 1 밀리리터, 30 % 요오드 산올 1 밀리리터 및 35 % 요오드 잔올 1 밀리리터를 순차적으로 밑받침합니다. 한 그래디언트의 바닥층 아래에 2밀리리터의 미토콘드리아 펠릿 현탁액을 추가하고 두 번째 그래디언트의 바닥층 아래에 2밀리리터의 조막 펠릿 현탁액을 추가합니다.밀도 구배 원심 분리로 미토콘드리아 및 막 분획을 정제하기 전에 각 그래디언트의 상단에 10 % 요오드 산올 1 밀리리터를 조심스럽게 층화하고 필요에 따라 10 % 요오드 사놀을 첨가하여 서로 10 마이크로 그램 내에서 튜브의 균형을 맞 춥니 다. 분리가 끝나면 바늘을 사용하여 얇은 벽 튜브의 측면을 뚫어 각 샘플에서 보이는 밴드를 수집합니다. 핵 단백질 분리를 위해, 용해 완충액 A에 현탁된 세포의 7.5 밀리리터 분취량을 원심분리하고, 피펫팅 및 와동을 사용하여 800 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포 가용화 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다.현탁액을 얼음 위에서 30분 동안 배양하여 혈장과 세포 기관 막을 파괴하고 핵 단백질을 보호합니다. 배양이 끝나면 세포 현탁액을 원심분리하고 벤조나제 마이크로리터당 1단위가 보충된 800마이크로리터의 얼음처럼 차가운 핵용해 완충액에 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다. 혼합물을 섭씨 4도의 끝 대 끝 회전기에서 배양하여 핵막을 파괴합니다.30 분 후, 핵산을 전단하기 위해 펄스 사이에 5 초 동안 일시 중지하면서 20 % 전력에서 5 초 동안 혼합물을 3 번 초음파 처리하십시오. 마지막 초음파 처리 후, 균질 액을 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않고 핵 분획으로 상청액을 수집합니다. 밀도 구배 정제 후 각각의 분획의 웨스턴 블롯은 25 및 30% 요오드산올 층에 대한 미토콘드리아 분획의 국재화, 및 막 분획의 10 및 15% 요오드산올 층에 대한 국재화를 보여줍니다.서양 혈액 분석은 또한 분리 된 각 샘플이 순수하고 세포의 다른 부분의 단백질에 의한 오염이 없음을 확인합니다. 또한, 각 시료의 밴드 강도에 대한 농도계 분석은 데이터의 재현성 및 통계적 유의성을 확인한다. 분획을 부적절하게 실행하면 세포 구성 요소가 교차 오염될 수 있습니다.예를 들어, 세포질 분획에서 히스톤 H3의 농도가 높으면 세포질 분획의 부적절한 정화로 인한 것일 수 있습니다. 등핵 밀도 정제 동안 실패는 막 분획의 오염을 초래할 수 있다. 서양 혈액 분석 전에 단백질 정량 분석을 수행하여 분획에 실제로 단백질이 포함되어 있는지 확인하여 단백질 양을 기반으로 겔 로딩을 허용하고 절차가 적절하게 실행되었는지 확인하는 것이 유용할 수 있습니다.세포질 분획에 펠릿이 포함되어 있지 않은 것이 중요합니다. 웨스턴 블롯 또는 ELISA는 특정 조건에서 다른 단백질의 세포 내 위치를 분석 할 수 있도록이 절차에 따라 수행 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 우리는 고혈당 상태에서 다양한 세포 사멸 요인의 인신 매매를 분석 할 수있었습니다.그래서 우리에게 이것은 세포 사멸에서 괴사로의 고혈당 전환 메커니즘을 밝히는 데 도움이되었습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

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연구

생화학

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; 상피 직감 세포

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제자리에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 발광

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Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

네이티브 오토플루임션을 기반으로 sFLIM에 의한 식물 섹션의 형광 프로브와 리그닌 간의 상호 작용 측정

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...