Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH R15-HL135675-01 og NIH 2 R15-HL135675-02 til T.J.L.

1. Forbered buffere og reagenser
<ol><li>Forbered friske løsninger av fosfatase og proteasehemmere.<ol><li>Tilsett 17,4 mg fenylmetansulfonylfluorid (PMSF)til 1 ml 100% etanol for å fremstille et lager på 100 mM. MERK: Bruk verneutstyr ved håndtering av PMSF, da det er farlig ved inntak eller innånding og ved kontakt med hud eller øyne. Det er etsende for øyne og hud.</li>
		<li>I henhold til produsentens instruksjoner, lag en kommersielt tilgjengelig proteasehemmercocktail (100x).</li>
		<li>Tilsett 91,9 mg ...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Denne metoden er en modifisert versjon av en tidligere publisert tilnærming til subcellulær fraksjonering uten bruk av høyhastighets sentrifugering11. Denne modifiserte metoden krever mer spesialisert utstyr for å oppnå de beste resultatene, men er mer omfattende og konsekvent reproduserbar.
Utviklingen av den opprinnelige protokollen var nødvendig på grunn av manglende evne til å skille mitokondrielle og membranprøver for analyse av proteinlokalisering under n...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Subcellulær fraksjonering er en prosedyre der celler lyses og separeres i deres bestanddeler gjennom flere metoder. Denne teknikken kan brukes av forskere til å bestemme proteinlokalisering i pattedyrceller eller for anrikning av proteiner med lav overflod som ellers ikke ville kunne oppdages. Mens metoder for subcellulær fraksjonering for tiden eksisterer, som kommersielle sett som kan kjøpes, lider de av flere begrensninger som denne prosedyren forsøker å overvinne. De fleste cellefraksjoneringsmetoder er utelukkende vaskemiddelbaserte1,2, avhengig av bruk av buffere som inneholder økende mengder vaskemiddel for å oppløse forskjellige cellulære komponenter. Selv om denne metoden er rask og praktisk, resulterer den i urene fraksjoner. Disse er designet for å tillate forskere å enkelt isolere en eller to komponenter i cellen, men er ikke komplekse nok til å isolere flere subcellulære fraksjoner fra en prøve samtidig. Å stole utelukkende på vaskemidler resulterer vanligvis i membranlukkede organeller og plasmamembranen blir ukritisk oppløselig, noe som gjør separasjon av disse komponentene vanskelig. En ekstra komplikasjon ved bruk av disse settene er manglende evne til forskere å endre / optimalisere dem for spesifikke applikasjoner, da de fleste komponentene er proprietære formuleringer. Endelig kan disse settene være uoverkommelig dyre, med begrensninger i antall bruksområder som gjør dem mindre enn ideelle for større prøver.
Til tross for tilgjengeligheten av sett for isolering av mitokondrier som ikke er avhengige av vaskemidler, er de ikke designet for å isolere plasmamembranen og gi betydelig lavere mengder prøve enn standard isolasjonsprotokoller 3,4. Mens differensielle sentrifugeringsmetoder er mer tidkrevende, resulterer de ofte i forskjellige fraksjoner som ikke kan oppnås med utelukkende vaskemiddelbaserte sett1. Separasjon uten bruk av løselige vaskemidler tillater også ytterligere rensing ved bruk av ultracentrifugation og isopycnic tetthetsgradienter, noe som resulterer i mindre krysskontaminering. Denne fraksjoneringsprotokollen demonstrerer isoleringen av subcellulære fraksjoner fra U937-monocytter ved bruk av en kombinasjon av vaskemiddel- og høyhastighets sentrifugeringsbaserte tilnærminger. Denne metoden vil lette isoleringen av kjernefysiske, cytoplasmatiske, mitokondrielle og plasmamembrankomponenter i en pattedyrcelle med minimal forurensning mellom fraksjonene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Denne protokollen beskriver en metode for å oppnå subcellulære proteinfraksjoner fra pattedyrceller ved bruk av en kombinasjon av vaskemidler, mekanisk lysis og isopynisk tetthetsgradient sentrifugering. Den største fordelen med denne prosedyren er at den ikke er avhengig av eneste bruk av oppløsende vaskemidler for å oppnå subcellulære fraksjoner. Dette gjør det mulig å skille plasmamembranen fra andre membranbundne organeller i cellen. Denne prosedyren vil lette bestemmelsen av proteinlokalisering i celler med en reproduserbar, skalerbar og selektiv metode. Denne metoden har blitt brukt til å isolere cytosoliske, kjernefysiske, mitokondrielle og plasmamembranproteiner fra den humane monocytcellelinjen, U937. Selv om den er optimalisert for denne cellelinjen, kan denne prosedyren tjene som et passende utgangspunkt for subcellulær fraksjonering av andre cellelinjer. Potensielle fallgruver i prosedyren og hvordan du kan unngå dem diskuteres, og det samme er endringer som kanskje må vurderes for andre cellelinjer.

Et skjematisk flytskjema for denne prosedyren (figur 1) oppsummerer visuelt trinnene som ble tatt for å fraksjonere U9375-celler dyrket i suspensjon. Fraksjoner samlet fra toppen av isopycnic tetthetsgradienten i like store mengder (1 ml) viser rensing av mitokondrielle og membranfraksjoner (figur 2). Ved bruk av et antistoff mot VDAC, et protein lokalisert til den ytre mitokondrielle membranen6, viser at mitokond...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Denne fraksjoneringsprotokollen vil tillate forskere å isolere cytoplasmatiske, kjernefysiske, mitokondrielle og membranproteiner fra pattedyrceller. De to sistnevnte subcellulære fraksjonene blir videre renset via isopycnic tetthetsgradient.

Cellefraksjonering av U937-celler ved isopycnic tetthetsgradientrensing

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Denne protokollen er viktig, fordi den gir en metode for å skille fire cellulære rom fra hverandre, cytoplasma, kjernen, mitokondriene og membranen. Ikke bare det, men det er en skalerbar, reproduserbar prosedyre som har pålitelige resultater. Den største fordelen med denne teknikken er separasjonen av fire cellulære rom med minimal bruk av vaskemidler, noe som muliggjør en mye mer reproduserbar, pålitelig fraksjoneringsprosedyre.For cytosolisk proteinisolasjon, vokse U937-celler i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid til en endelig total på seks x 10 til de åttende cellene. Sentrifuger kulturen, og resuspenderer cellepelleten i romtemperatur PBS til en endelig konsentrasjon på fire x 10 til de sjette cellene per milliliter, pipettering forsiktig for å bryte opp klumper. Etter en andre sentrifugering, resuspend pelleten i iskald lysisbuffer A ved en endelig konsentrasjon på to til 10 til de syvende cellene per milliliter.Tilsett 7,5 milliliter celler til et konisk rør på is for nedstrøms nukleær proteinekstraksjon, og pellet de resterende cellene ved sentrifugering. Resuspend pelleten i cytoplasmatisk isolasjonsbuffer ved en endelig konsentrasjon på to x 10 til de syvende cellene per milliliter, pipettering forsiktig for å bryte opp klumper, før du inkuberer cellene i 20 minutter ved fire grader Celsius med ende over ende rotasjon. På slutten av inkubasjonen sentrifugerer cellesuspensjonen og overfører supernatanten til et rent sentrifugerør.Sentrifuge supernatanten for å sedimentere det cellulære rusk. Etter sentrifugering, overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør, og gjenta sentrifugeringssekvensen til ingen pellet kan observeres. Når prøven er fri for rusk, oppbevar den cytosoliske fraksjonsholdige supernatanten i opptil en måned ved fire grader Celsius.Resuspend deretter den lagrede cellepelleten i lysisbuffer A til en endelig konsentrasjon på fire x 10 til de sjette cellene per milliliter. For cellehomogenisering, sentrifuger cellesuspensjonen og kast supernatanten for å fjerne overflødig digitonin og systoliske forurensninger. Resuspend pelleten i iskald celle homogeniseringsbuffer ved en endelig konsentrasjon på fire x 10 til de sjette cellene per milliliter for en 30-minutters inkubasjon på is.I mellomtiden, for perlebasert mekanisk lysis, tilsett 30 gram forvasket rustfritt stål 3,2 millimeter perler til 15 milliliter lysisbuffer B i et 50 milliliter skjørtrør på is for å kjøle seg ned. På slutten av inkubasjonen, erstatt bufferen i skjørtrøret med cellesuspensjon og bland cellene i fem minutter med hastighet åtte. Etter lysis, overfør homogenatet til et rent rør.Sentrifuger homogenatet, og overfør deretter supernatanten til et nytt rør. For å fjerne gjenværende rusk fra prøven, sentrifuger homogenatet tre ganger som angitt, og overfør supernatanten til et nytt rør etter hver sentrifugering. Etter den siste sentrifugeringen, for å isolere den rå mitokondrielle fraksjonen, overfør supernatanten til et nytt rør for sentrifugering.Etter sentrifugering, overfør supernatanten til et nytt rør og legg den rå mitokondrielle fraksjonsholdige pelleten på is. For å isolere membranfraksjonen, sentrifuger den oppsamlede supernatanten, og etter å ha kastet supernatanten, plasser den rå membranfraksjonsholdige pelleten på is. For isopycnic tetthet gradient rensing, resuspend rå mitokondrielle og membranfraksjon pellets i 200 mikroliter lysis buffer B, og 1,8 milliliter iodixanol.For å lage en diskontinuerlig jodxanolgradient for hver prøve, legg først til en milliliter 15% iodixanol til bunnen av et åtte milliliter åpent, tynnvegget ultracentrifugerør per prøve. Deretter legger du sekvensielt en milliliter 20% iodixanol, en milliliter 25% iodixanol, en milliliter 30% iodixanol og en milliliter 35% iodixanol under 15% iodixanollaget i hvert rør. Tilsett to milliliter av den rå mitokondrielle pelletssuspensjonen under bunnlaget av en gradient, og to milliliter av den rå membranpelletssuspensjonen under bunnlaget av den andre gradienten.Legg forsiktig en milliliter 10% iodixanol på toppen av hver gradient og balanser rørene innen 10 mikrogram av hverandre ved tilsetning av 10% jodixanol etter behov før du renser mitokondrielle og membranfraksjoner ved tetthetsgradient sentrifugering. På slutten av separasjonen, bruk en nål for å punktere siden av de tynnveggede rørene for å samle de synlige båndene fra hver prøve. For nukleær proteinisolasjon, sentrifuger 7,5 milliliter aliquot av celler suspendert i lysisbuffer A, og resuspenderer pelleten i 800 mikroliter iskald celleoppløselighetsbuffer med pipettering og vortexing.Inkuber suspensjonen på is i 30 minutter for å forstyrre plasma- og organellemembranene, samtidig som de beskytter atomproteinene. På slutten av inkubasjonen sentrifugerer cellesuspensjonen og resuspenderer pelleten ved forsiktig pipettering i 800 mikroliter iskald nukleær lysebuffer supplert med en enhet per mikroliter Benzonase. Inkuber blandingen på en ende over ende-rotator ved fire grader Celsius for å forstyrre kjernemembranen.Etter 30 minutter, sonikere blandingen tre ganger i fem sekunder ved 20% effekt med en fem sekunders pause mellom pulser for å skjære nukleinsyrene. Etter den siste sonikeringen, sentrifuger homogenatet og samler supernatanten som atomfraksjonen uten å forstyrre pelleten. Western blot av hver av fraksjonene etter tetthetsgradientrensing viser lokalisering av mitokondriell fraksjon til 25 og 30% jodxanollagene, og lokalisering av membranfraksjonen til 10 og 15% jodixanollagene.Vestlig blodanalyse bekrefter også at hver isolert prøve er ren og fri for forurensning av proteiner fra andre deler av cellen. I tillegg bekrefter densitometrisk analyse av båndintensiteten til hver prøve reproduserbarheten og statistisk signifikans av dataene. Feil utførelse av fraksjoneringen kan føre til krysskontaminering av cellekomponentene.En høy konsentrasjon av histon H3 i cytosolisk fraksjon, for eksempel, kan skyldes feil avklaring av cytosolisk fraksjon. Feil under isopycnic tetthetsrensing kan føre til forurensning av membranfraksjonen. Det kan være nyttig å utføre en proteinkvantifiseringsanalyse før den vestlige blodanalysen for å bekrefte at fraksjonene faktisk inneholder protein for å tillate gelbelastning basert på proteinmengden, og for å bekrefte at prosedyren er riktig utført.Det er kritisk at cytoplasmatisk fraksjon ikke inneholder en pellet. Western blots, eller ELISAs kan utføres etter denne prosedyren for å tillate deg å analysere den subcellulære plasseringen av forskjellige proteiner under visse forhold. Denne teknikken tillot oss å analysere handelen med forskjellige celledødsfaktorer under forhold med hyperglykemi.Og så, for oss, bidro dette til å kaste lys over mekanismen for det hyperglykemiske skiftet fra apoptose til nekrose.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rensing av biotinylerte celleoverflateproteiner fra<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epiteliale gutceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rensing av hepatocytter og sinusformet endotelceller fra musen leveren perfusjon

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraksjoneres for løsning av løselig og uløselig Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Måling og korrelasjon av cellen og lys utslipp av Bioluminescent bakterier

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikasjon av havet Lamprey feromoner bruker Bioassay-guidede fraksjoneres

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Celle fraksjoneres av U937 celler i fravær av høyhastighets sentrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måle interaksjoner mellom fluorescerende sonder og lignin i Plant seksjoner av sFLIM basert på Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Tetthet gradient ultracentrifugation for å undersøke endokytisk resirkulering i pattedyrceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysomprofilering uten gradientopprettere eller fraksjoneringssystemer

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...