Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo NIH R15-HL135675-01 e NIH 2 R15-HL135675-02 para T.J.L.

1. Prepare tampões e reagentes
<ol><li>Prepare soluções frescas de fosfatase e inibidores da protease.<ol><li>Adicione 17,4 mg de fluoreto de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 mL de etanol a 100% para preparar um estoque de 100 mM. NOTA: Use equipamento de proteção ao manusear o PMSF, pois é perigoso quando ingerido ou inalado e em contato com a pele ou os olhos. É corrosivo para os olhos e pele.</li>
		<li>De acordo com as instruções do fabricante, prepare um coquetel inibidor de protease comercialmente disp...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Este método é uma versão modificada de uma abordagem previamente publicada para o fracionamento subcelular sem o uso de centrifugação de alta velocidade11. Este método modificado requer equipamentos mais especializados para alcançar os melhores resultados, mas é mais abrangente e consistentemente reprodutível.
O desenvolvimento do protocolo inicial foi necessário devido à incapacidade de separar amostras mitocondriais e de membrana para a análise da localiza...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

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Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
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William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

O fracionamento subcelular é um procedimento no qual as células são lisadas e separadas em seus componentes constituintes através de vários métodos. Esta técnica pode ser usada por pesquisadores para determinar a localização de proteínas em células de mamíferos ou para o enriquecimento de proteínas de baixa abundância que, de outra forma, seriam indetectáveis. Embora existam atualmente métodos de fracionamento subcelular, assim como os kits comerciais que podem ser adquiridos, eles sofrem de várias limitações que esse procedimento tenta superar. A maioria dos métodos de fracionamento celular é exclusivamente à base de detergente1,2, contando com o uso de tampões contendo quantidades crescentes de detergente para solubilizar diferentes componentes celulares. Embora este método seja rápido e conveniente, resulta em frações impuras. Estes são projetados para permitir que os pesquisadores isolem facilmente um ou dois componentes da célula, mas não são complexos o suficiente para isolar múltiplas frações subcelulares de uma amostra ao mesmo tempo. Depender apenas de detergentes geralmente resulta em organelas fechadas por membrana e a membrana plasmática sendo indiscriminadamente solubilizada, dificultando a separação desses componentes. Uma complicação adicional do uso desses kits é a incapacidade dos pesquisadores de alterá-los / otimizá-los para aplicações específicas, já que a maioria dos componentes são formulações proprietárias. Finalmente, esses kits podem ser proibitivamente caros, com limitações no número de usos que os tornam menos do que ideais para amostras maiores.
Apesar da disponibilidade de kits para o isolamento de mitocôndrias que não dependem de detergentes, eles não são projetados para isolar a membrana plasmática e produzir quantidades significativamente menores de amostra do que os protocolos de isolamento padrão 3,4. Embora os métodos de centrifugação diferenciais sejam mais demorados, eles geralmente resultam em frações distintas que não podem ser obtidas com kits exclusivamente à base de detergente1. A separação sem o uso exclusivo de detergentes solubilizantes também permite uma purificação adicional usando ultracentrifugação e gradientes de densidade isopícnica, resultando em menos contaminação cruzada. Este protocolo de fracionamento demonstra o isolamento de frações subcelulares dos monócitos U937 usando uma combinação de abordagens baseadas em detergente e centrífuga de alta velocidade. Este método facilitará o isolamento dos componentes nucleares, citoplasmáticos, mitocondriais e da membrana plasmática de uma célula de mamíferos com contaminação mínima entre as frações.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Este protocolo descreve um método para obter frações proteicas subcelulares de células de mamíferos usando uma combinação de detergentes, lise mecânica e centrifugação de gradiente de densidade isopícnica. A principal vantagem deste procedimento é que ele não depende do uso exclusivo de detergentes solubilizantes para obter frações subcelulares. Isso torna possível separar a membrana plasmática de outras organelas ligadas à membrana da célula. Este procedimento facilitará a determinação da localização de proteínas em células com um método reprodutível, escalável e seletivo. Este método tem sido usado com sucesso para isolar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriais e da membrana plasmática da linhagem celular de monócitos humanos, U937. Embora otimizado para esta linhagem celular, este procedimento pode servir como um ponto de partida adequado para o fracionamento subcelular de outras linhagens celulares. Possíveis armadilhas do procedimento e como evitá-las são discutidas, assim como alterações que podem precisar ser consideradas para outras linhagens celulares.

Um fluxograma esquemático deste procedimento (Figura 1) resume visualmente as etapas que foram tomadas para fracionar com sucesso as células U9375 cultivadas em suspensão. As frações coletadas do topo do gradiente de densidade isopícnico em volumes iguais (1 mL) mostram a purificação das frações mitocondrial e de membrana (Figura 2). A utilização de um anticorpo contra VDAC, uma proteína localizada na membrana mitocondrial ex...

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Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Este protocolo de fracionamento permitirá que os pesquisadores isolem proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriais e de membrana de células de mamíferos. As duas últimas frações subcelulares são ainda purificadas através do gradiente de densidade isopícnico.

Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Este protocolo é significativo, porque fornece um método para separar quatro compartimentos celulares um do outro, o citoplasma, o núcleo, as mitocôndrias e a membrana. Não só isso, mas é um procedimento escalável e reprodutível que tem resultados confiáveis. A grande vantagem desta técnica é a separação de quatro compartimentos celulares com o uso mínimo de detergentes, o que permite um procedimento de fracionamento muito mais reprodutível e confiável.Para o isolamento de proteínas citosólicas, cultive células U937 em RPMI 1640 com soro bovino fetal a 10% a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para um total final de seis por 10 até a oitava célula. Centrifugar a cultura e ressuspender o pellet celular em PBS à temperatura ambiente para uma concentração final de quatro por 10 para a sexta célula por mililitro, pipetando suavemente para quebrar aglomerados. Após uma segunda centrifugação, ressuscite o pellet em tampão de lise gelado A a uma concentração final de dois por 10 para a sétima célula por mililitro.Adicione 7,5 mililitros de células a um tubo cônico no gelo para extração de proteína nuclear a jusante e elimine as células restantes por centrifugação. Ressuspeite o pellet em tampão de isolamento citoplasmático a uma concentração final de dois por 10 até a sétima célula por mililitro, pipetando suavemente para quebrar aglomerados, antes de incubar as células por 20 minutos a quatro graus Celsius com rotação de ponta a ponta. No final da incubação, centrifugar a suspensão celular e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo.Centrifugar o sobrenadante para sedimentar os detritos celulares. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga e repita a sequência de centrifugação até que nenhuma pelota possa ser observada. Quando a amostra estiver livre de detritos, armazene o sobrenadante contendo fração citosólica por até um mês a quatro graus Celsius.Em seguida, ressuspenda o pellet celular armazenado no tampão de lise A para uma concentração final de quatro por 10 para a sexta célula por mililitro. Para homogeneização celular, centrifugar a suspensão celular e descartar o sobrenadante para remover o excesso de digitonina e contaminantes sistólicos. Ressuspeite o pellet em tampão de homogeneização de células geladas a uma concentração final de quatro por 10 para a sexta célula por mililitro para uma incubação de 30 minutos no gelo.Enquanto isso, para lise mecânica à base de contas, adicione 30 gramas de contas de aço inoxidável pré-lavadas de 3,2 milímetros a 15 mililitros de tampão de lise B em um tubo de contorno de 50 mililitros no gelo para esfriar. No final da incubação, substitua o tampão no tubo de rodapé por suspensão celular e misture as células por cinco minutos na velocidade oito. Após a lise, transfira o homogeneizado para um tubo limpo.Centrifugar o homogeneizado e, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo. Para remover quaisquer detritos remanescentes da amostra, centrifugar o homogeneizado três vezes conforme indicado, transferindo o sobrenadante para um novo tubo após cada centrifugação. Após a última centrifugação, para isolar a fração mitocondrial bruta, transfira o sobrenadante para um novo tubo para centrifugação.Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo e coloque o pellet contendo fração mitocondrial bruta no gelo. Para isolar a fração de membrana, centrifugar o sobrenadante coletado e, após descartá-lo, colocar o pellet contendo fração de membrana bruta no gelo. Para purificação do gradiente de densidade isopícnica, ressuscite os pellets brutos mitocondriais e de fração de membrana em 200 microlitros de tampão de lise B e 1,8 mililitros de iodixanol.Para criar um gradiente de iodixanol descontínuo para cada amostra, primeiro, adicione um mililitro de iodixanol a 15% ao fundo de um tubo ultracentrífugo de oito mililitros de parede fina de topo aberto por amostra. Em seguida, subjaz sequencialmente a um mililitro de 20% iodixanol, um mililitro de 25% iodixanol, um mililitro de 30% iodixanol e um mililitro de 35% iodixanol abaixo da camada de 15% iodixanol em cada tubo. Adicione dois mililitros da suspensão bruta de pellets mitocondriais sob a camada inferior de um gradiente e dois mililitros da suspensão de pellets de membrana bruta sob a camada inferior do segundo gradiente.Colocar cuidadosamente um mililitro de iodixanol a 10% no topo de cada gradiente e equilibrar os tubos dentro de 10 microgramas um do outro pela adição de 10% de iodixanol, conforme necessário, antes de purificar as frações mitocondrial e de membrana por centrifugação por gradiente de densidade. No final da separação, use uma agulha para perfurar o lado dos tubos de paredes finas para coletar as bandas visíveis de cada amostra. Para o isolamento de proteínas nucleares, centrifugar a alíquota de 7,5 mililitros de células suspensas em tampão de lise A e ressuspender o pellet em 800 microlitros de tampão de solubilização de células geladas com pipetagem e vórtice.Incube a suspensão no gelo por 30 minutos para romper as membranas plasmáticas e organelas, protegendo as proteínas nucleares. No final da incubação, centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet pipetando suavemente em 800 microlitros de tampão de lise nuclear gelado suplementado com uma unidade por microlitro de Benzonase. Incubar a mistura em um rotador de extremidade sobre extremidade a quatro graus Celsius para romper a membrana nuclear.Após 30 minutos, sonicate a mistura três vezes por cinco segundos a 20% de potência com uma pausa de cinco segundos entre os pulsos para cisalhar os ácidos nucleicos. Após a última sonicação, centrifugar o homogeneizado e coletar o sobrenadante como a fração nuclear sem perturbar o pellet. O western blot de cada uma das frações após a purificação do gradiente de densidade mostra a localização da fração mitocondrial para as camadas de 25 e 30% de iodixanol e a localização da fração de membrana para as camadas de 10 e 15% de iodixanol.A análise ocidental do sangue também confirma que cada amostra isolada é pura e livre de contaminação por proteínas de outras partes da célula. Além disso, a análise densitométrica da intensidade da banda de cada amostra confirma a reprodutibilidade e a significância estatística dos dados. A execução inadequada do fracionamento pode resultar em contaminação cruzada dos componentes celulares.Uma alta concentração de histona H3 na fração citosólica, por exemplo, pode ser devida ao esclarecimento inadequado da fração citosólica. A falha durante a purificação da densidade isopicnica pode resultar em contaminação da fração de membrana. Pode ser útil realizar um ensaio de quantificação de proteínas antes da análise de sangue ocidental para confirmar que as frações realmente contêm proteína para permitir o carregamento de gel com base na quantidade de proteína e para confirmar que o procedimento foi executado corretamente.É fundamental que a fração citoplasmática não contenha um pellet. Western blots, ou ELISAs podem ser realizados seguindo este procedimento para permitir que você analise a localização subcelular de diferentes proteínas sob certas condições. Essa técnica permitiu analisar o tráfico de diferentes fatores de morte celular em condições de hiperglicemia.E assim, para nós, isso ajudou a lançar luz sobre o mecanismo da mudança hiperglicêmica da apoptose para a necrose.

Research

JoVE Journal

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Bioquímica

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células intestinais epiteliais

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