Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH R15-HL135675-01 и NIH 2 R15-HL135675-02 для T.J.L.

1. Подготовьте буферы и реагенты
<ol><li>Готовят свежие растворы фосфатазы и ингибиторов протеазы.<ol><li>Добавьте 17,4 мг фенилметансульфонилфторида (PMSF) к 1 мл 100% этанола для получения запаса 100 мМ. ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитное снаряжение при обращении с PMSF, так как это опасно при проглатывани...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Данный способ является модифицированной версией ранее опубликованного подхода к субклеточному фракционированию без использования высокоскоростного центрифугирования11. Этот модифицированный метод требует более специализированного оборудования для достижения наилуч?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Субклеточное фракционирование представляет собой процедуру, при которой клетки лизируются и разделяются на составляющие их компоненты с помощью нескольких методов. Этот метод может быть использован исследователями для определения локализации белка в клетках млекопитающих или для обогащения белков с низким содержанием, которые в противном случае не были бы обнаружены. Хотя методы субклеточного фракционирования в настоящее время существуют, как и коммерческие наборы, которые можно приобрести, они страдают от нескольких ограничений, которые эта процедура пытается преодолеть. Большинство методов фракционирования клеток основаны исключительно на моющих средствах 1,2, основанных на использовании буферов, содержащих все большее количество моющего средства для солюбилизации различных клеточных компонентов. Хотя этот метод быстрый и удобный, он приводит к нечистым фракциям. Они предназначены для того, чтобы позволить исследователям легко выделить один или два компонента клетки, но недостаточно сложны, чтобы выделить несколько субклеточных фракций из образца одновременно. Опора исключительно на моющие средства обычно приводит к тому, что мембранно-закрытые органеллы и плазматическая мембрана без разбора солюбилизируются, что затрудняет разделение этих компонентов. Дополнительным осложнением от использования этих наборов является неспособность исследователей изменять / оптимизировать их для конкретных применений, поскольку большинство компонентов являются запатентованными составами. Наконец, эти наборы могут быть непомерно дорогими, с ограничениями в количестве применений, которые делают их менее идеальными для больших образцов.
Несмотря на наличие наборов для выделения митохондрий, которые не полагаются на моющие средства, они не предназначены для изоляции плазматической мембраны и дают значительно меньшее количество образца, чем стандартные протоколы изоляции 3,4. Хотя методы дифференциального центрифугирования являются более трудоемкими, они часто приводят к образованию различных фракций, которые не могут быть получены с помощью наборов1 исключительно на основе моющих средств. Сепарация без исключительного использования солюбилизирующих моющих средств также позволяет проводить дальнейшую очистку с использованием ультрацентрифугирования и изопикнических градиентов плотности, что приводит к меньшему перекрестному загрязнению. Этот протокол фракционирования демонстрирует выделение субклеточных фракций из моноцитов U937 с использованием комбинации подходов на основе детергентов и высокоскоростного центрифугирования. Этот метод облегчит выделение ядерного, цитоплазматического, митохондриального и плазматического мембранных компонентов клетки млекопитающих с минимальным загрязнением между фракциями.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Этот протокол описывает способ получения субклеточных белковых фракций из клеток млекопитающих с использованием комбинации детергентов, механического лизиса и центрифугирования градиента изопикновой плотности. Основным преимуществом этой процедуры является то, что она не полагается на исключительное использование солюбилизирующих моющих средств для получения субклеточных фракций. Это дает возможность отделить плазматическую мембрану от других мембранно-связанных органелл клетки. Эта процедура облегчит определение локализации белка в клетках воспроизводимым, масштабируемым и селективным методом. Этот метод был успешно использован для выделения цитозольных, ядерных, митохондриальных и плазматических мембранных белков из клеточной линии моноцитов человека U937. Хотя эта процедура оптимизирована для этой клеточной линии, она может служить подходящей отправной точкой для субклеточного фракционирования других клеточных линий. Обсуждаются потенциальные подводные камни процедуры и способы их избежания, а также изменения, которые, возможно, потребуется рассмотреть для других клеточных линий.

Схематическая блок-схема этой процедуры (рисунок 1) визуально суммирует шаги, которые были предприняты для успешного фракционирования клеток U9375, выращенных в суспензии. Фракции, собранные с верхней части изопикнового градиента плотности в равных объемах (1...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Этот протокол фракционирования позволит исследователям выделить цитоплазматические, ядерные, митохондриальные и мембранные белки из клеток млекопитающих. Последние две субклеточные фракции дополнительно очищаются с помощью изопикнового градиента плотности.

Фракционирование клеток U937 методом изопикновой очистки градиента плотности

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Этот протокол важен, потому что он обеспечивает метод отделения четырех клеточных компартментов друг от друга: цитоплазмы, ядра, митохондрий и мембраны. Не только это, но это масштабируемая, воспроизводимая процедура, которая имеет надежные результаты. Основным преимуществом этой методики является разделение четырех клеточных компартментов с минимальным использованием моющих средств, что позволяет проводить гораздо более воспроизводимую, надежную процедуру фракционирования.Для выделения цитозольного белка вырастите клетки U937 в RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой при 37 градусах Цельсия и 5% углекислым газом до конечного общего числа шесть на 10 к восьмым клеткам. Центрифугируют культуру и повторно суспендируют ячейку гранулы при комнатной температуре PBS до конечной концентрации от четырех на 10 до шестой клетки на миллилитр, мягко пипетируя, чтобы разбить сгустки. После второй центрифугирования повторно суспендируют гранулу в буфере ледяного холодного лизиса А в конечной концентрации от двух на 10 до седьмых клеток на миллилитр.Добавьте 7,5 миллилитров клеток в коническую трубку на льду для последующей экстракции ядерного белка и гранулируйте оставшиеся клетки центрифугированием. Повторно суспендируют гранулу в буфере цитоплазматической изоляции в конечной концентрации от двух на 10 до седьмых клеток на миллилитр, осторожно пипетируя, чтобы разбить сгустки, прежде чем инкубировать клетки в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия с конечным вращением. В конце инкубации центрифугируют клеточную суспензию и переносят супернатант в чистую центрифужную трубку.Центрифугировать супернатант для осаждения клеточного мусора. После центрифугирования перенесите супернатант в новую центрифужную трубку и повторяйте последовательность центрифугирования до тех пор, пока не будет наблюдаться гранула. Когда образец будет очищен от мусора, храните цитозольную фракцию, содержащий супернатант, до одного месяца при четырех градусах Цельсия.Затем повторно суспендируют хранящуюся клеточную гранулу в буфере лизиса А до конечной концентрации четыре на 10 до шестой клетки на миллилитр. Для гомогенизации клеток центрифугируют клеточную суспензию и выбрасывают надосадочную часть для удаления избытка дигитонина и систолических загрязнений. Повторно суспендируют гранулу в буфере гомогенизации ледяных клеток в конечной концентрации от четырех на 10 до шестой клетки на миллилитр для 30-минутной инкубации на льду.Между тем, для механического лизиса на основе бисера добавьте 30 граммов предварительно промытых шариков из нержавеющей стали 3,2 миллиметра к 15 миллилитрам лизисного буфера B в 50-миллилитровой окантовке на льду для охлаждения. В конце инкубации замените буфер в плинтусной трубке клеточной суспензией и смешивайте клетки в течение пяти минут со скоростью восемь. После лизиса перенесите гомогенат в чистую трубку.Центрифугируйте гомогенат, затем перенесите супернатант в новую трубку. Чтобы удалить оставшийся мусор из образца, центрифугируют гомогенат три раза, как указано, перенося супернатант в новую трубку после каждой центрифугирования. После последнего центрифугирования, чтобы выделить сырую митохондриальную фракцию, перенесите супернатант в новую трубку для центрифугирования.После центрифугирования перенесите супернатант в новую трубку и поместите на лед сырую гранулу, содержащую митохондриальную фракцию. Чтобы изолировать мембранную фракцию, центрифугируют собранный супернатант, а после выброса супернатанта помещают на лед сырую мембранную фракционную фракционную гранулу. Для очистки градиента изопикновой плотности повторно суспендируют сырые гранулы митохондриальной и мембранной фракций в 200 микролитрах лизисного буфера В и 1,8 миллилитра йодиксанола.Чтобы создать прерывистый градиент йодиксанола для каждого образца, сначала добавьте один миллилитр 15% йодиксанола к нижней части одной восьмимиллилитрной тонкостенной ультрацентрифужной трубки на образец. Затем последовательно подложите один миллилитр 20% йодиксанола, один миллилитр 25% йодиксанола, один миллилитр 30% йодиксанола и один миллилитр 35% йодиксанола ниже слоя 15% йодиксанола в каждой трубке. Добавьте два миллилитра сырой митохондриальной суспензии гранул под нижний слой одного градиента и два миллилитра грубой мембранной суспензии гранул под нижний слой второго градиента.Осторожно нанесите один миллилитр 10% йодиксанола на верхнюю часть каждого градиента и сбалансируйте пробирки в пределах 10 микрограммов друг от друга путем добавления 10% йодиксанола по мере необходимости перед очисткой митохондриальной и мембранной фракций центрифугированием градиента плотности. В конце разделения используйте иглу, чтобы проколоть сторону тонкостенных трубок, чтобы собрать видимые полосы с каждого образца. Для выделения ядерного белка центрифугируют 7,5-миллилитровую аликвоту клеток, взвешенных в буфере лизиса А, и повторно суспендируют гранулу в 800 микролитрах буфера солюбилизации ледяных холодных клеток с пипеткой и вихрем.Инкубируйте суспензию на льду в течение 30 минут, чтобы разрушить мембраны плазмы и органелл, защищая при этом ядерные белки. В конце инкубации центрифугируют клеточную суспензию и повторно суспендируют гранулу путем осторожного пипетирования в 800 микролитров ледяного буфера ядерного лизиса, дополненного одной единицей на микролитр бензоназы. Инкубируйте смесь на торцевом ротаторе при четырех градусах Цельсия, чтобы разрушить ядерную мембрану.Через 30 минут обжайте смесь ультразвуком три раза в течение пяти секунд с мощностью 20% с пятисекундной паузой между импульсами, чтобы срезать нуклеиновые кислоты. После последней обработки ультразвуком центрифугируют гомогенат и собирают супернатант в виде ядерной фракции, не нарушая гранулу. Вестерн-блоттинг каждой из фракций после очистки градиента плотности показывает локализацию митохондриальной фракции на 25 и 30% йодиксаноловых слоях, а локализацию мембранной фракции на 10 и 15% йодиксаноловых слоев.Западный анализ крови также подтверждает, что каждый изолированный образец является чистым и свободным от загрязнения белками из других частей клетки. Кроме того, денситометрический анализ интенсивности полосы каждой выборки подтверждает воспроизводимость и статистическую значимость данных. Неправильное выполнение фракционирования может привести к перекрестному загрязнению клеточных компонентов.Высокая концентрация гистона Н3 в цитозольной фракции, например, может быть обусловлена неправильным осветлением цитозольной фракции. Отказ при очистке изопикновой плотности может привести к загрязнению мембранной фракции. Может быть полезно выполнить количественный анализ белка перед западным анализом крови, чтобы подтвердить, что фракции действительно содержат белок, чтобы обеспечить загрузку геля на основе количества белка, и подтвердить, что процедура была выполнена должным образом.Очень важно, чтобы цитоплазматическая фракция не содержала гранул. Вестерн-блоттинги или ИФА могут быть выполнены после этой процедуры, чтобы позволить вам проанализировать субклеточное расположение различных белков при определенных условиях. Данная методика позволила проанализировать торговлю различными факторами гибели клеток в условиях гипергликемии.И вот, для нас это помогло пролить свет на механизм гипергликемического перехода от апоптоза к некрозу.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Очистка биотинилированных клеточных поверхностных белков от<em&gt; Ripicephalus microplus</em&gt; Эпителиальные кишечные клетки

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Очистка гепатоцитов и синусоидальных эндотелиальных клеток от мыши печени перфузии

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Фракционирование резолюции растворимых и нерастворимых гентингтина видов

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

На месте Измерение и корреляции плотность клеток и светового излучения биолюминесцентных бактерий

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Идентификация Морская минога феромоны, используя Bioassay руководствуясь фракционирования

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Фракционирование клеток U937 клеток в отсутствие высокоскоростной центрифуги

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Измерение взаимодействия между флуоресцентными зондами и лигнином в секциях растений sFLIM на основе автофлюоресценции коренных народов

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Ультрацентрифугирование градиента плотности для исследования эндоцитарной рециркуляции в клетках млекопитающих

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Полисомное профилирование без градиентных строителей или систем фракционирования

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...