Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por NIH R15-HL135675-01 y NIH 2 R15-HL135675-02 a T.J.L.

1. Preparar tampones y reactivos
<ol><li>Prepare soluciones frescas de inhibidores de la fosfatasa y la proteasa.<ol><li>Agregue 17.4 mg de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 ml de etanol al 100% para preparar un stock de 100 mM. NOTA: Use equipo de protección cuando manipule PMSF, ya que es peligroso cuando se ingiere o inhala y al entrar en contacto con la piel o los ojos. Es corrosivo para los ojos y la piel.</li>
		<li>De acuerdo con las instrucciones del fabricante, prepare un cóctel de inhibidores d...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Este método es una versión modificada de un enfoque previamente publicado para el fraccionamiento subcelular sin el uso de centrifugación de alta velocidad11. Este método modificado requiere un equipo más especializado para lograr los mejores resultados, pero es más completo y consistentemente reproducible.
El desarrollo del protocolo inicial fue necesario debido a la incapacidad de separar muestras mitocondriales y de membrana para el análisis de la localizació...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

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Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
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William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

El fraccionamiento subcelular es un procedimiento en el que las células se lisan y se separan en sus componentes constituyentes a través de varios métodos. Esta técnica puede ser utilizada por los investigadores para determinar la localización de proteínas en células de mamíferos o para el enriquecimiento de proteínas de baja abundancia que de otro modo serían indetectables. Si bien actualmente existen métodos para el fraccionamiento subcelular, al igual que los kits comerciales que se pueden comprar, sufren de varias limitaciones que este procedimiento intenta superar. La mayoría de los métodos de fraccionamiento celular son exclusivamente a base de detergente1,2, basándose en el uso de tampones que contienen cantidades crecientes de detergente para solubilizar diferentes componentes celulares. Si bien este método es rápido y conveniente, da como resultado fracciones impuras. Estos están diseñados para permitir a los investigadores aislar fácilmente uno o dos componentes de la célula, pero no son lo suficientemente complejos como para aislar múltiples fracciones subcelulares de una muestra al mismo tiempo. Depender únicamente de detergentes generalmente da como resultado orgánulos encerrados en la membrana y la membrana plasmática se solubiliza indiscriminadamente, lo que dificulta la separación de estos componentes. Una complicación adicional del uso de estos kits es la incapacidad de los investigadores para alterarlos / optimizarlos para aplicaciones específicas, ya que la mayoría de los componentes son formulaciones patentadas. Finalmente, estos kits pueden ser prohibitivamente caros, con limitaciones en el número de usos que los hacen menos que ideales para muestras más grandes.
A pesar de la disponibilidad de kits para el aislamiento de mitocondrias que no dependen de detergentes, no están diseñados para aislar la membrana plasmática y producir cantidades significativamente menores de muestra que los protocolos de aislamiento estándar 3,4. Si bien los métodos de centrifugación diferencial requieren más tiempo, a menudo dan lugar a distintas fracciones que no se pueden obtener con kits exclusivamente a base de detergente1. La separación sin el uso exclusivo de detergentes solubilizantes también permite una purificación adicional mediante ultracentrifugación y gradientes de densidad isopícnica, lo que resulta en una menor contaminación cruzada. Este protocolo de fraccionamiento demuestra el aislamiento de fracciones subcelulares de monocitos U937 utilizando una combinación de detergente y enfoques basados en centrifugación de alta velocidad. Este método facilitará el aislamiento de los componentes nucleares, citoplasmáticos, mitocondriales y de membrana plasmática de una célula de mamífero con una contaminación mínima entre las fracciones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Este protocolo describe un método para obtener fracciones de proteínas subcelulares de células de mamíferos utilizando una combinación de detergentes, lisis mecánica y centrifugación de gradiente de densidad isopícnica. La principal ventaja de este procedimiento es que no se basa únicamente en el uso de detergentes solubilizantes para obtener fracciones subcelulares. Esto hace posible separar la membrana plasmática de otros orgánulos unidos a la membrana de la célula. Este procedimiento facilitará la determinación de la localización de proteínas en las células con un método reproducible, escalable y selectivo. Este método se ha utilizado con éxito para aislar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriales y de membrana plasmática de la línea celular de monocitos humanos, U937. Aunque optimizado para esta línea celular, este procedimiento puede servir como un punto de partida adecuado para el fraccionamiento subcelular de otras líneas celulares. Se discuten las posibles dificultades del procedimiento y cómo evitarlas, al igual que las alteraciones que pueden necesitar ser consideradas para otras líneas celulares.

Un diagrama de flujo esquemático de este procedimiento (Figura 1) resume visualmente los pasos que se tomaron para fraccionar con éxito las células U9375 cultivadas en suspensión. Las fracciones recogidas de la parte superior del gradiente de densidad isopícnica en volúmenes iguales (1 mL) muestran la purificación de las fracciones mitocondrial y de membrana (Figura 2). La utilización de un anticuerpo contra VDAC, una proteína lo...

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Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Este protocolo de fraccionamiento permitirá a los investigadores aislar proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriales y de membrana de células de mamíferos. Las dos últimas fracciones subcelulares se purifican aún más a través del gradiente de densidad isopícnica.

Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Este protocolo es significativo, porque proporciona un método para separar cuatro compartimentos celulares entre sí, el citoplasma, el núcleo, las mitocondrias y la membrana. No solo eso, sino que es un procedimiento escalable y reproducible que tiene resultados confiables. La principal ventaja de esta técnica es la separación de cuatro compartimentos celulares con un uso mínimo de detergentes, lo que permite un procedimiento de fraccionamiento mucho más reproducible y confiable.Para el aislamiento de proteínas citosólicas, cultive células U937 en RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta un total final de seis por 10 a octava células. Centrifugar el cultivo y resuspender el pellet celular a temperatura ambiente PBS a una concentración final de cuatro por 10 a la sexta células por mililitro, pipeteando suavemente para romper los grumos. Después de una segunda centrifugación, resuspender el pellet en tampón de lisis A helado a una concentración final de dos por 10 a la séptima celda por mililitro.Agregue 7,5 mililitros de células a un tubo cónico sobre hielo para la extracción de proteínas nucleares aguas abajo, y granule las células restantes por centrifugación. Resuspender el pellet en tampón de aislamiento citoplasmático a una concentración final de dos por 10 a la séptima célula por mililitro, pipeteando suavemente para romper los grumos, antes de incubar las células durante 20 minutos a cuatro grados centígrados con rotación de extremo a extremo. Al final de la incubación, centrifugar la suspensión celular y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio.Centrifugar el sobrenadante para sedimentar los restos celulares. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga y repita la secuencia de centrifugación hasta que no se pueda observar ningún pellet. Cuando la muestra esté libre de residuos, almacene el sobrenadante que contiene fracción citosólica durante un máximo de un mes a cuatro grados centígrados.Luego resuspenda el pellet de celda almacenado en el tampón de lisis A a una concentración final de cuatro por 10 a la sexta celda por mililitro. Para la homogeneización celular, centrifugar la suspensión celular y desechar el sobrenadante para eliminar el exceso de digitonina y contaminantes sistólicos. Resuspender el pellet en tampón de homogeneización de celdas heladas a una concentración final de cuatro por 10 a la sexta celda por mililitro para una incubación de 30 minutos en hielo.Mientras tanto, para la lisis mecánica basada en cuentas, agregue 30 gramos de perlas prelavadas de acero inoxidable de 3.2 milímetros a 15 mililitros de tampón de lisis B en un tubo con faldón de 50 mililitros sobre hielo para enfriar. Al final de la incubación, reemplace el tampón en el tubo con faldón con suspensión celular y mezcle las celdas durante cinco minutos a velocidad ocho. Después de la lisis, transfiera el homogeneizado a un tubo limpio.Centrifugar el homogeneizado, luego transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Para eliminar cualquier residuo restante de la muestra, centrifugar el homogeneizado tres veces como se indica, transfiriendo el sobrenadante a un nuevo tubo después de cada centrifugación. Después de la última centrifugación, para aislar la fracción mitocondrial cruda, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo para la centrifugación.Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y coloque el pellet crudo que contiene fracción mitocondrial en hielo. Para aislar la fracción de membrana, centrifugar el sobrenadante recolectado y, después de desecharlo, coloque el pellet crudo que contiene la fracción de membrana en hielo. Para la purificación del gradiente de densidad isopícnica, resuspenda los gránulos de fracción mitocondrial y de membrana crudos en 200 microlitros de tampón B de lisis y 1.8 mililitros de iodixanol.Para crear un gradiente de iodixanol discontinuo para cada muestra, primero, agregue un mililitro de 15% de iodixanol al fondo de un tubo de ultracentrífuga de pared delgada y tapa abierta de ocho mililitros por muestra. A continuación, subyace secuencialmente un mililitro de 20% de iodixanol, un mililitro de 25% de iodixanol, un mililitro de 30% de iodixanol y un mililitro de 35% de iodixanol por debajo de la capa de 15% de iodixanol en cada tubo. Agregue dos mililitros de la suspensión de pellets mitocondriales crudos debajo de la capa inferior de un gradiente, y dos mililitros de la suspensión de pellets de membrana cruda debajo de la capa inferior del segundo gradiente.Coloque cuidadosamente un mililitro de 10% de iodixanol en la parte superior de cada gradiente y equilibre los tubos dentro de 10 microgramos entre sí mediante la adición de 10% de iodixanol según sea necesario antes de purificar las fracciones mitocondriales y de membrana por centrifugación de gradiente de densidad. Al final de la separación, use una aguja para perforar el lado de los tubos de paredes delgadas para recoger las bandas visibles de cada muestra. Para el aislamiento de proteínas nucleares, centrifugar la alícuota de 7,5 mililitros de células suspendidas en el tampón de lisis A y resuspender el pellet en 800 microlitros de tampón de solubilización de células heladas con pipeteo y vórtice.Incubar la suspensión en hielo durante 30 minutos para interrumpir las membranas plasmáticas y de orgánulos, mientras protege las proteínas nucleares. Al final de la incubación, centrifugar la suspensión celular y resuspender el pellet pipeteando suavemente en 800 microlitros de tampón de lisis nuclear helado complementado con una unidad por microlitro de Benzonasa. Incubar la mezcla en un rotador de extremo a extremo a cuatro grados centígrados para interrumpir la membrana nuclear.Después de 30 minutos, sonicar la mezcla tres veces durante cinco segundos al 20% de potencia con una pausa de cinco segundos entre pulsos para cortar los ácidos nucleicos. Después de la última sonicación, centrifugar el homogeneizado y recoger el sobrenadante como la fracción nuclear sin perturbar el pellet. Western blot de cada una de las fracciones después de la purificación del gradiente de densidad muestra la localización de la fracción mitocondrial a las capas de 25 y 30% de iodixanol, y la localización de la fracción de membrana a las capas de 10 y 15% de iodixanol.El análisis de sangre occidental también confirma que cada muestra aislada es pura y libre de contaminación por proteínas de otras partes de la célula. Además, el análisis densitométrico de la intensidad de banda de cada muestra confirma la reproducibilidad y significación estadística de los datos. La ejecución incorrecta del fraccionamiento puede resultar en la contaminación cruzada de los componentes celulares.Una alta concentración de histona H3 en la fracción citosólica, por ejemplo, puede deberse a una clarificación inadecuada de la fracción citosólica. La falla durante la purificación de la densidad isopícnica puede resultar en la contaminación de la fracción de membrana. Puede ser útil realizar un ensayo de cuantificación de proteínas antes del análisis de sangre occidental para confirmar que las fracciones contienen proteínas para permitir la carga de gel en función de la cantidad de proteína y para confirmar que el procedimiento se ha ejecutado correctamente.Es crítico que la fracción citoplasmática no contenga un pellet. Las manchas occidentales o ELISA se pueden realizar después de este procedimiento para permitirle analizar la ubicación subcelular de diferentes proteínas bajo ciertas condiciones. Esta técnica nos permitió analizar el tráfico de diferentes factores de muerte celular en condiciones de hiperglucemia.Y así, para nosotros, esto ayudó a arrojar luz sobre el mecanismo del cambio hiperglucémico de la apoptosis a la necrosis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Investigación

Bioquímica

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células epiteliales intestinales

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

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Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón de perfusión

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