Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH R15-HL135675-01 och NIH 2 R15-HL135675-02 till T.J.L.

1. Förbered buffertar och reagenser
<ol><li>Förbered färska lösningar av fosfatas och proteashämmare.<ol><li>Tillsätt 17,4 mg fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) till 1 ml 100 % etanol för att bereda en 100 mM stam. OBS: Använd skyddsutrustning vid hantering av PMSF eftersom det är farligt vid förtäring eller inandning och vid kontakt med hud eller ögon. Det är frätande för ögon och hud.</li>
		<li>Enligt tillverkarens instruktioner, förbered en kommersiellt tillgänglig proteashämmare cocktail (100x)...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Denna metod är en modifierad version av ett tidigare publicerat tillvägagångssätt för subcellulär fraktionering utan användning av höghastighetscentrifugering11. Denna modifierade metod kräver mer specialutrustning för att uppnå bästa resultat, men är mer omfattande och konsekvent reproducerbar.
Utvecklingen av det ursprungliga protokollet var nödvändigt på grund av en oförmåga att separera mitokondriella och membranprover för analys av proteinlokalis...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Subcellulär fraktionering är ett förfarande där celler lyseras och separeras i sina beståndsdelar genom flera metoder. Denna teknik kan användas av forskare för att bestämma proteinlokalisering i däggdjursceller eller för anrikning av proteiner med låg förekomst som annars inte skulle kunna upptäckas. Även om det för närvarande finns metoder för subcellulär fraktionering, liksom kommersiella kit som kan köpas, lider de av flera begränsningar som denna procedur försöker övervinna. De flesta cellfraktioneringsmetoder är uteslutande tvättmedelsbaserade1,2, beroende av användning av buffertar som innehåller ökande mängder tvättmedel för att solubilisera olika cellulära komponenter. Även om denna metod är snabb och bekväm, resulterar den i orena fraktioner. Dessa är utformade för att göra det möjligt för forskare att enkelt isolera en eller två komponenter i cellen, men är inte tillräckligt komplexa för att isolera flera subcellulära fraktioner från ett prov samtidigt. Att enbart förlita sig på tvättmedel resulterar vanligtvis i membranslutna organeller och plasmamembranet som urskillningslöst lösgörs, vilket gör separationen av dessa komponenter svår. En ytterligare komplikation från användningen av dessa kit är forskarnas oförmåga att ändra / optimera dem för specifika applikationer, eftersom de flesta komponenterna är proprietära formuleringar. Slutligen kan dessa kit vara oöverkomligt dyra, med begränsningar i antalet användningsområden som gör dem mindre än idealiska för större prover.
Trots tillgången på kit för isolering av mitokondrier som inte är beroende av tvättmedel är de inte utformade för att isolera plasmamembranet och ge betydligt lägre mängder prov än standardisoleringsprotokoll 3,4. Även om differentialcentrifugeringsmetoder är mer tidskrävande, resulterar de ofta i distinkta fraktioner som inte kan erhållas med uteslutande tvättmedelsbaserade kit1. Separation utan enbart användning av solubiliserande tvättmedel möjliggör också ytterligare rening med ultracentrifugering och isopycnic densitetsgradienter, vilket resulterar i mindre korskontaminering. Detta fraktioneringsprotokoll visar isoleringen av subcellulära fraktioner från U937-monocyter med användning av en kombination av tvättmedels- och höghastighetscentrifugeringsbaserade metoder. Denna metod kommer att underlätta isoleringen av kärn-, cytoplasmatiska, mitokondriella och plasmamembrankomponenterna i en däggdjurscell med minimal förorening mellan fraktionerna.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Detta protokoll beskriver en metod för att erhålla subcellulära proteinfraktioner från däggdjursceller med användning av en kombination av tvättmedel, mekanisk lys och isopycnic densitetsgradientcentrifugering. Den största fördelen med denna procedur är att den inte är beroende av den enda användningen av solubiliserande tvättmedel för att erhålla subcellulära fraktioner. Detta gör det möjligt att separera plasmamembranet från andra membranbundna organeller i cellen. Denna procedur kommer att underlätta bestämningen av proteinlokalisering i celler med en reproducerbar, skalbar och selektiv metod. Denna metod har framgångsrikt använts för att isolera cytosoliska, nukleära, mitokondriella och plasmamembranproteiner från den humana monocytcellinjen, U937. Även om den är optimerad för denna cellinje kan denna procedur fungera som en lämplig utgångspunkt för subcellulär fraktionering av andra cellinjer. Potentiella fallgropar i förfarandet och hur man undviker dem diskuteras liksom förändringar som kan behöva övervägas för andra cellinjer.

Ett schematiskt flödesschema för denna procedur (figur 1) sammanfattar visuellt de steg som togs för att framgångsrikt fraktionera U9375-celler som odlas i suspension. Fraktioner uppsamlade från toppen av den isopykniska densitetsgradienten i lika stora volymer (1 ml) visar reningen av mitokondriella och membranfraktioner (figur 2). Genom att använda en antikropp mot VDAC, ett protein lokaliserat till det yttre mitokondriella membra...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Detta fraktioneringsprotokoll gör det möjligt för forskare att isolera cytoplasmatiska, nukleära, mitokondriella och membranproteiner från däggdjursceller. De två senare subcellulära fraktionerna renas ytterligare via isopycnic densitetsgradient.

Cellfraktionering av U937-celler genom isopycnic density gradient reification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Detta protokoll är signifikant, eftersom det ger en metod för att separera fyra cellulära fack från varandra, cytoplasman, kärnan, mitokondrierna och membranet. Inte bara det, men det är en skalbar, reproducerbar procedur som har tillförlitliga resultat. Den största fördelen med denna teknik är separationen av fyra cellulära fack med minimal användning av tvättmedel, vilket möjliggör ett mycket mer reproducerbart, tillförlitligt fraktioneringsförfarande.För cytosolisk proteinisolering, odla U937-celler i RPMI 1640 med 10% fetalt bovint serum vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid till en slutlig total av sex med 10 till de åttonde cellerna. Centrifugera kulturen och återsuspendera cellpelleten i rumstemperatur PBS till en slutlig koncentration av fyra gånger 10 till den sjätte cellerna per milliliter, pipettera försiktigt för att bryta upp klumpar. Efter en andra centrifugering, återsuspendera pelleten i iskall lysbuffert A vid en slutlig koncentration av två med 10 till den sjunde cellerna per milliliter.Tillsätt 7,5 ml celler till ett koniskt rör på is för nedströms kärnproteinutvinning och pellet de återstående cellerna genom centrifugering. Återsuspendera pelleten i cytoplasmatisk isoleringsbuffert vid en slutlig koncentration av två x 10 till de sjunde cellerna per milliliter, pipettera försiktigt för att bryta upp klumpar innan cellerna inkuberas i 20 minuter vid fyra grader Celsius med ändrotation över änd. I slutet av inkubationen centrifugerar du cellsuspensionen och överför supernatanten till ett rent centrifugrör.Centrifugera supernatanten för att sedimentera cellresterna. Efter centrifugering, överför supernatanten till ett nytt centrifugrör och upprepa centrifugeringssekvensen tills ingen pellet kan observeras. När provet är fritt från skräp, förvara den cytosoliska fraktionsinnehållande supernatanten i upp till en månad vid fyra grader Celsius.Återsuspendera sedan den lagrade cellpelleten i lysbuffert A till en slutlig koncentration av fyra med 10 till de sjätte cellerna per milliliter. För cellhomogenisering, centrifugera cellsuspensionen och kassera supernatanten för att avlägsna överskott av digitonin och systoliska föroreningar. Återsuspendera pelleten i iskall cellhomogeniseringsbuffert vid en slutlig koncentration av fyra x 10 till de sjätte cellerna per milliliter för en 30-minuters inkubation på is.Under tiden, för pärlbaserad mekanisk lys, tillsätt 30 gram förtvättat rostfritt stål 3,2 millimeter pärlor till 15 ml lysbuffert B i ett 50 ml skirted rör på is för att kyla. I slutet av inkubationen, byt ut bufferten i det kjolade röret med cellsuspension och blanda cellerna i fem minuter med hastighet åtta. Efter lys, överför homogenatet till ett rent rör.Centrifugera homogenatet och överför sedan supernatanten till ett nytt rör. För att avlägsna eventuellt kvarvarande skräp från provet, centrifugera homogenatet tre gånger enligt anvisningarna och överför supernatanten till ett nytt rör efter varje centrifugering. Efter den sista centrifugeringen, för att isolera den råa mitokondriella fraktionen, överför supernatanten till ett nytt rör för centrifugering.Efter centrifugering, överför supernatanten till ett nytt rör och placera den råa mitokondriella fraktionsinnehållande pelleten på is. För att isolera membranfraktionen, centrifugera den uppsamlade supernatanten och efter att ha kastat supernatanten placera den råa membranfraktionsinnehållande pelleten på is. För isopycnic density gradient rening, återsuspendera de råa mitokondriella och membranfraktionspellets i 200 mikroliter lysbuffert B och 1,8 ml jodixanol.För att skapa en diskontinuerlig jodoxanolgradient för varje prov, tillsätt först en milliliter 15% jodoxanol till botten av ett åtta milliliter öppet, tunnväggigt ultracentrifugrör per prov. Därefter underlag sekventiellt en milliliter 20% jodoxanol, en milliliter 25% jodoxanol, en milliliter 30% jodoxanol och en milliliter 35% jodoxanol under 15% jodoxanolskiktet i varje rör. Tillsätt två milliliter av den råa mitokondriella pelletsuspensionen under bottenskiktet av en gradient och två ml av råmembranpelletssuspensionen under bottenskiktet i den andra gradienten.Lägg försiktigt en milliliter 10% jodixanol på toppen av varje gradient och balansera rören inom 10 mikrogram från varandra genom tillsats av 10% jodixanol efter behov innan mitokondriella och membranfraktioner renas genom densitetsgradientcentrifugering. I slutet av separationen, använd en nål för att punktera sidan av de tunnväggiga rören för att samla de synliga banden från varje prov. För kärnproteinisolering, centrifugera 7,5 ml alikvot av celler suspenderade i lysbuffert A och återsuspendera pelleten i 800 mikroliter iskall celllösningsbuffert med pipettering och virvel.Inkubera suspensionen på is i 30 minuter för att störa plasma- och organellmembranen, samtidigt som kärnproteinerna skyddas. I slutet av inkubationen centrifugerar du cellsuspensionen och återsuspenderar pelleten genom att försiktigt pipettera i 800 mikroliter iskall kärnlysbuffert kompletterad med en enhet per mikroliter Benzonas. Inkubera blandningen på en ände över ändrotatorn vid fyra grader Celsius för att störa kärnmembranet.Efter 30 minuter, sonikat blandningen tre gånger i fem sekunder vid 20% effekt med en fem sekunders paus mellan pulserna för att skjuva nukleinsyrorna. Efter den sista ultraljudsbehandlingen, centrifugera homogenatet och samla supernatanten som kärnfraktionen utan att störa pelleten. Västra fläcken av var och en av fraktionerna efter densitetsgradientrening visar lokalisering av mitokondriell fraktion till 25 och 30% jodoxanolskikten och lokalisering av membranfraktionen till 10 och 15% jodoxanolskikten.Västerländsk blodanalys bekräftar också att varje isolerat prov är rent och fritt från kontaminering av proteiner från andra delar av cellen. Dessutom bekräftar densitometrisk analys av bandintensiteten för varje prov reproducerbarheten och den statistiska signifikansen av data. Felaktigt utförande av fraktioneringen kan resultera i korskontaminering av de cellulära komponenterna.En hög koncentration av histon H3 i den cytosoliska fraktionen kan exempelvis bero på felaktig förtydligande av den cytosoliska fraktionen. Fel under den isopycnic densitetsreningen kan leda till förorening av membranfraktionen. Det kan vara användbart att utföra en proteinkvantifieringsanalys före den västerländska blodanalysen för att bekräfta att fraktionerna verkligen innehåller protein för att tillåta gelbelastning baserat på proteinmängden och för att bekräfta att proceduren har utförts korrekt.Det är viktigt att den cytoplasmatiska fraktionen inte innehåller en pellet. Western blotts eller ELISAs kan utföras enligt denna procedur så att du kan analysera den subcellulära platsen för olika proteiner under vissa förhållanden. Denna teknik gjorde det möjligt för oss att analysera handeln med olika celldödsfaktorer under förhållanden med hyperglykemi.Och så, för oss, hjälpte detta till att belysa mekanismen för det hyperglykemiska skiftet från apoptos till nekros.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinitetsrening av proteinkomplex från eukaryota celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rening av biotinylerade cellytaproteiner från<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitelceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rening av hepatocyter och sinusformad Endothelial celler från mus lever Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionering för upplösning av lösliga och olösliga Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Mätning och korrelation mellan Cell densiteten och ljusa utsläppet av självlysande bakterier

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifiering av havet nejonöga feromoner med hjälp av Bioassay-guidad fraktionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Cell fraktionering av U937 celler i avsaknad av höghastighetståg centrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Mätning av interaktioner mellan fluorescerande sonder och lignin i Plant sektioner av sFLIM baserat på ursprunglig Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Densitet gradient ultracentrifugation för att undersöka endocytisk återvinning i däggdjursceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysomprofilering utan övertoningstillverkare eller fraktioneringssystem

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...